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Actualmente, se conocen en el mundo ocho razas de Drechslera tritici-repentis (Died) (teleomorfo Pyrenophora tritici-repentis, Died) determinadas sobre líneas diferenciales de trigo; sin embargo muchos investigadores sugieren la presencia de nuevas razas de este patógeno. La aparición de nuevas razas del hongo puede traer consigo la pérdida de resistencia genética en variedades comerciales de trigo. A pesar de ello, hay muy pocos trabajos donde se haya caracterizado el comportamiento de cultivares comerciales de trigo frente a diferentes aislados de D. tritici-repentis caracterizados fenotípica y molecularmente. El objetivo de este trabajo fue caracterizar tres aislados de D. tritici-repentis y analizar el comportamiento de variedades comerciales argentinas de trigo en plántula en invernáculo y en planta adulta a campo, frente a los mismos. Se evaluó el tipo de reacción en líneas diferenciales de trigo en invernáculo y se realizó el análisis molecular de los genes que codifican la producción de toxinas. El ensayo con variedades comerciales llevado a cabo en invernáculo se realizó en la Universidad Nacional de La Plata, Partido de La Plata, con un diseño de parcela dividida donde la parcela principal fue el aislado y la sub-parcela el cultivar; mientras que los ensayos en planta adulta a campo se realizaron en la Estación Experimental Julio Hirschhorn dependiente de la Universidad Nacional de La Plata, Partido de Los Hornos y en la Estación Experimental Agropecuaria Pergamino del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria en el partido de Pergamino, con un diseño de parcela dividida donde la parcela principal fue la localidad, la sub-parcela el aislado y la sub-sub-parcela el cultivar. Se inoculó en el estadio de 3 hojas en invernáculo y en principios de encañamiento y hoja bandera desplegada para la evaluación a campo con una concentración de 3000 conidios/ml. Se evaluó el tipo de reacción, usando la escala de 1-5 propuesta por Lamari & Bernier (1989a), y la severidad a los 14 días después de la inoculación en plántula y en tres momentos (EC 37, EC 75 y EC 82) para el ensayo en planta adulta a campo. Los aislados mostraron diferencias en la reacción en líneas diferenciales y en el análisis molecular de genes que codifican toxinas. El aislado 1 (cepa LH) se caracterizó por la presencia del gen TOX b; el aislado 2 (cepa 25M035) por la presencia de los genes homólogos TOX B, TOX B1 y TOX b y el aislado 3 (cepa G327) por poseer el gen TOX A y TOX B1. En plántula los cultivares que, en promedio, presentaron menor severidad fueron Baguette 601, Buck SY 300, Buck SY 110, Don Mario Lenox, Baguette 17, Buck AGP Fast, Nogal, BioInta 1001, ProInta Puntal y SY100 y según tipo de reacción Baguette 601, Buck SY 300, Klein Tauro, Buck SY 110, Buck SY 100, BioInta 1001, Klein Proteo, Klein Volcán, Don Mario Lenox y ACA 320. En planta adulta los que presentaron menor severidad fueron Baguette 601, Buck SY 110, Buck SY 300, Don Mario Lenox, Nogal, Baguette 17, ProInta Puntal, Buck AGP Fast y Buck SY 100 y en cuanto al tipo de reacción fueron Baguette 601, Buck SY 110, Buck SY 300, Baguette 17, Buck SY 100, ProInta Puntal, Buck AGP Fast, Nogal y BioInta 1001. A partir de estos resultados se puede sugerir que los aislados eran diferentes entre sí y que no se correspondieron con las razas conocidas. En los ensayos en plántula en invernáculo y en planta adulta a campo se encontraron algunos cultivares con aceptables niveles de resistencia parcial.

En la actualidad, existe una gran necesidad de desarrollar nuevas herramientas y métodos en el área de la bioseparación. Una de las principales demandas de las industrias alimenticia, textil, papelera, cosmética y farmacéutica, es la disposición de grandes cantidades de enzimas y, en algunos casos, con altos grados de pureza, ya que estas presentan ventajas tanto a nivel velocidad y costo de producción, como así también en el rendimiento del proceso y el bajo impacto negativo en el medio ambiente. Así, surge la búsqueda de nuevas técnicas bioseparativas para la obtención de enzimas. En los últimos años, los procesos de adsorción han sido ampliamente desarrollados para su uso en la recuperación de macromoléculas. Esta técnica hace uso de la capacidad de adsorción de una fase sólida para unir moléculas presentes en una solución. La adsorción puede ser llevada a cabo en tanque agitado, donde el sistema llega a un equilibrio en la concentración de adsorbato tanto en el adsorbente como en la solución; o en columna donde, dependiendo del sentido del flujo de la solución, puede clasificarse como lecho empacado, lecho expandido o fluidizado. El principal problema de esta técnica es que las matrices de adsorción comerciales existentes presentan costos elevados y una vida útil corta, por lo que es deseable diseñar nuevos sistemas rentables y con alta capacidad de adsorción. El uso de polímeros naturales para obtener matrices con capacidad de adsorber proteínas es una excelente opción, ya que son fáciles de preparar, rentables y no contaminantes. En este trabajo se desarrollaron, en una primera parte, matrices de Alginato y Goma Guar, dos polímeros naturales, a partir de la gelificación de una solución de dichos polisacáridos cuando entra en contacto con una solución de CaCl2. Las esferas obtenidas fueron entrecruzadas covalentemente con Epiclorohidrina, con el objetivo de aumentar su estabilidad evitando su disolución. Se caracterizaron morfológica y estructuralmente, verificando su tamaño promedio de 2 mm, su alta hidrofilicidad o capacidad para retener agua y la reacción exitosa entre los grupos OH del Alginato y los grupos epoxi de la Epiclorohidrina a partir del análisis del espectro de Infrarrojo (FT-IR) de las matrices tratadas químicamente. Se estudiaron la cinética y las isotermas de adsorción de la Lisozima en la matriz polimérica. La cinética de adsorción siguió un modelo de pseudo primer orden, mientras que la isoterma de adsorción en el equilibrio pudo representarse mediante el modelo de Freundlich. La cantidad máxima de Lisozima adsorbida en esta matriz fue de aproximadamente 2,4 mg por g de matriz hidratada a pH 7,0. El mecanismo de adsorción se asoció a un proceso de difusión simple con una interacción Coulombica débil entre la proteína y la matriz. La presencia de NaCl 0,3 M indujo un desplazamiento total de la Lisozima desde la matriz. Bajo esta condición, el porcentaje de proteína desorbida fue del 95%. Se realizaron ciclos sucesivos de adsorción-desorción por lavado y los resultados mostraron la reversibilidad del proceso y la utilidad del método para la purificación y separación de enzimas. También, se estudió la adsorción y desorción de Lisozima en lecho empacado utilizando la matriz Alginato-Goma Guar. Se concluyó que los modelos de Thomas y Tiempo de Servicio de la Altura del Lecho ajustaron correctamente a los datos experimentales de las curvas de rupturas con altos coeficientes de correlación. Se llevó a cabo un último paso para la purificación de Lisozima a partir de clara de huevo como fuente natural, obteniéndose un 75% de rendimiento y un factor de purificación de alrededor de 15 cuando se trabajó en columna de lecho empacado. En una segunda parte, se abordó la obtención y caracterización de la matriz de Alginato-Goma Guar entrecruzada con Epiclorohidrina en presencia de diferentes polímeros de cadena flexible: alcohol polivinílico, polivinilpirrolidina y Pluronic® F68. Las matrices obtenidas se usaron para la adsorción de Lisozima y Quimotripsinógeno, y mostraron, para ambas proteínas, una captación creciente en presencia de los polímeros de cadena flexible en el sentido: ninguna < Pluronic® F68 < polivinilpirrolidina < alcohol polivinílico. Se encontró que, en todos los casos, el proceso de adsorción sigue un modelo de cinética de pseudo primer orden y no se encuentra influenciado por el tipo de polímero y que el modelo de Freundlich es el más adecuado para el ajuste de los datos experimentales. Se confirmó que, la adición de alcohol polivinílico y polivinilpirrolidina mostraron la mayor capacidad de adsorción para ambas proteínas comparadas frente a la matriz Alginato-Goma Guar. Esto se debe a un incremento en la rigidez del gel causada por la formación de enlaces puente hidrógeno entre los polisacáridos y los polímeros sintéticos. Finalmente, se obtuvo un recupero de 79% y un factor de purificación de 17 veces de Lisozima desde la clara de huevo en un sistema de lecho empacado con la matriz Alginato-Goma Guar-alcohol polivinílico. Esto verificó que la presencia de este polímero provoca cambios estructurales en la matriz que beneficia la adsorción de macromoléculas desde su fuente natural. Por último, se obtuvieron micropartículas de Alginato mediante secado por pulverización (Spray Drying) y se entrecruzaron químicamente con Epiclorohidrina. Las micropartículas se caracterizaron por su tamaño, morfología superficial (SEM), potencial zeta, análisis térmico (TGA/DSC) y espectroscopia Raman. Las micropartículas resultantes presentaron tamaños promedios de 700 nm y un valor de potencial zeta de -84 mV. La capacidad de adsorción de la matriz se estudió utilizando Lisozima y Quimotripsinógeno como proteínas modelo. Las isotermas de equilibrio fueron descritas por los modelos de Langmuir y Hill, respectivamente. Las capacidades máximas de adsorción para la Lisozima y el Quimotripsinógeno fueron 1880 y 3034 mg/g de micropartículas de Alginato, respectivamente. Finalmente, se estudió la capacidad de selección de las micropartículas de Alginato para ambas proteínas a partir de una mezcla compleja de proteínas. Luego de un ciclo de adsorción, lavado y desorción, se verificó, por SDS-PAGE, la separación de las proteínas modelos con respecto a las proteínas totales presentes en el sistema.

En la actualidad, existe una gran necesidad de desarrollar nuevas herramientas y métodos en el área de la bioseparación. Una de las principales demandas de las industrias alimenticia, textil, papelera, cosmética y farmacéutica, es la disposición de grandes cantidades de enzimas y, en algunos casos, con altos grados de pureza, ya que estas presentan ventajas tanto a nivel velocidad y costo de producción, como así también en el rendimiento del proceso y el bajo impacto negativo en el medio ambiente. Así, surge la búsqueda de nuevas técnicas bioseparativas para la obtención de enzimas. En los últimos años, los procesos de adsorción han sido ampliamente desarrollados para su uso en la recuperación de macromoléculas. Esta técnica hace uso de la capacidad de adsorción de una fase sólida para unir moléculas presentes en una solución. La adsorción puede ser llevada a cabo en tanque agitado, donde el sistema llega a un equilibrio en la concentración de adsorbato tanto en el adsorbente como en la solución; o en columna donde, dependiendo del sentido del flujo de la solución, puede clasificarse como lecho empacado, lecho expandido o fluidizado. El principal problema de esta técnica es que las matrices de adsorción comerciales existentes presentan costos elevados y una vida útil corta, por lo que es deseable diseñar nuevos sistemas rentables y con alta capacidad de adsorción. El uso de polímeros naturales para obtener matrices con capacidad de adsorber proteínas es una excelente opción, ya que son fáciles de preparar, rentables y no contaminantes. En este trabajo se desarrollaron, en una primera parte, matrices de Alginato y Goma Guar, dos polímeros naturales, a partir de la gelificación de una solución de dichos polisacáridos cuando entra en contacto con una solución de CaCl2. Las esferas obtenidas fueron entrecruzadas covalentemente con Epiclorohidrina, con el objetivo de aumentar su estabilidad evitando su disolución. Se caracterizaron morfológica y estructuralmente, verificando su tamaño promedio de 2 mm, su alta hidrofilicidad o capacidad para retener agua y la reacción exitosa entre los grupos OH del Alginato y los grupos epoxi de la Epiclorohidrina a partir del análisis del espectro de Infrarrojo (FT-IR) de las matrices tratadas químicamente. Se estudiaron la cinética y las isotermas de adsorción de la Lisozima en la matriz polimérica. La cinética de adsorción siguió un modelo de pseudo primer orden, mientras que la isoterma de adsorción en el equilibrio pudo representarse mediante el modelo de Freundlich. La cantidad máxima de Lisozima adsorbida en esta matriz fue de aproximadamente 2,4 mg por g de matriz hidratada a pH 7,0. El mecanismo de adsorción se asoció a un proceso de difusión simple con una interacción Coulombica débil entre la proteína y la matriz. La presencia de NaCl 0,3 M indujo un desplazamiento total de la Lisozima desde la matriz. Bajo esta condición, el porcentaje de proteína desorbida fue del 95%. Se realizaron ciclos sucesivos de adsorción-desorción por lavado y los resultados mostraron la reversibilidad del proceso y la utilidad del método para la purificación y separación de enzimas. También, se estudió la adsorción y desorción de Lisozima en lecho empacado utilizando la matriz Alginato-Goma Guar. Se concluyó que los modelos de Thomas y Tiempo de Servicio de la Altura del Lecho ajustaron correctamente a los datos experimentales de las curvas de rupturas con altos coeficientes de correlación. Se llevó a cabo un último paso para la purificación de Lisozima a partir de clara de huevo como fuente natural, obteniéndose un 75% de rendimiento y un factor de purificación de alrededor de 15 cuando se trabajó en columna de lecho empacado. En una segunda parte, se abordó la obtención y caracterización de la matriz de Alginato-Goma Guar entrecruzada con Epiclorohidrina en presencia de diferentes polímeros de cadena flexible: alcohol polivinílico, polivinilpirrolidina y Pluronic® F68. Las matrices obtenidas se usaron para la adsorción de Lisozima y Quimotripsinógeno, y mostraron, para ambas proteínas, una captación creciente en presencia de los polímeros de cadena flexible en el sentido: ninguna < Pluronic® F68 < polivinilpirrolidina < alcohol polivinílico. Se encontró que, en todos los casos, el proceso de adsorción sigue un modelo de cinética de pseudo primer orden y no se encuentra influenciado por el tipo de polímero y que el modelo de Freundlich es el más adecuado para el ajuste de los datos experimentales. Se confirmó que, la adición de alcohol polivinílico y polivinilpirrolidina mostraron la mayor capacidad de adsorción para ambas proteínas comparadas frente a la matriz Alginato-Goma Guar. Esto se debe a un incremento en la rigidez del gel causada por la formación de enlaces puente hidrógeno entre los polisacáridos y los polímeros sintéticos. Finalmente, se obtuvo un recupero de 79% y un factor de purificación de 17 veces de Lisozima desde la clara de huevo en un sistema de lecho empacado con la matriz Alginato-Goma Guar-alcohol polivinílico. Esto verificó que la presencia de este polímero provoca cambios estructurales en la matriz que beneficia la adsorción de macromoléculas desde su fuente natural. Por último, se obtuvieron micropartículas de Alginato mediante secado por pulverización (Spray Drying) y se entrecruzaron químicamente con Epiclorohidrina. Las micropartículas se caracterizaron por su tamaño, morfología superficial (SEM), potencial zeta, análisis térmico (TGA/DSC) y espectroscopia Raman. Las micropartículas resultantes presentaron tamaños promedios de 700 nm y un valor de potencial zeta de -84 mV. La capacidad de adsorción de la matriz se estudió utilizando Lisozima y Quimotripsinógeno como proteínas modelo. Las isotermas de equilibrio fueron descritas por los modelos de Langmuir y Hill, respectivamente. Las capacidades máximas de adsorción para la Lisozima y el Quimotripsinógeno fueron 1880 y 3034 mg/g de micropartículas de Alginato, respectivamente. Finalmente, se estudió la capacidad de selección de las micropartículas de Alginato para ambas proteínas a partir de una mezcla compleja de proteínas. Luego de un ciclo de adsorción, lavado y desorción, se verificó, por SDS-PAGE, la separación de las proteínas modelos con respecto a las proteínas totales presentes en el sistema.

La actividad apícola es una economía regional que puede potenciar el desarrollo de zonas que han quedado postergadas por el avance de la actividad agropecuaria. Los beneficios para las zonas de producción son múltiples, destacándose la posibilidad de desarrollar una actividad económica que preserva ambientes y biodiversidad. Las abejas son las protagonistas de la cadena apícola, pero el hombre tiene también una activa participación ya que interviene ayudando a la abeja a concentrar la producción en colmenas que están protegidas con estructuras de madera, también le otorga adecuado alimento, las posiciona en un entorno favorable y asegura su genética y sanidad para hacer más eficiente la producción.El principal desafío que enfrentan los apicultores es poder mantener el estado sanitario de las colmenas, sin que éstas se contaminen. Este sector se ve afectado por diferentes patologías entre las que se encuentran, principalmente, la Varroasis (ocasionada por un ácaro) y Loque Americana (una enfermedad bacteriana producida por un bacilo denominado Paenibacillus larvae (P. larvae)). Para el control de las mismas los apicultores emplean productos químicos sintéticos, sin embargo, el uso irracional e indiscriminado de estos productos implica un riesgo elevado de contaminación para los productos de la colmena, que pueden derivar en daños a la salud humana y en problemas de comercialización. En la búsqueda de alternativas para poder controlar estas enfermedades a fin de minimizar las desventajas que implican el uso de medicamentos sintéticos, se han diseñado nuevos métodos de control para las enfermedades antes mencionadas mediante el uso de productos sanitarios y nutricionales más naturales y efectivos. En este sentido, el uso de aceites esenciales (AEs) y de extractos de vegetales (EVs) ha ganado popularidad e interés científico en estos últimos años. Desde el punto de vista científico, las investigaciones se desarrollan principalmente en la búsqueda de sustancias activas para el control de microorganismos patógenos, ya que muchos de ellos se han vuelto resistentes a los medicamentos. Así, se ha estudiado la actividad antimicrobiana de decocciones, de infusiones, de EVs y de AEs de diferentes especies vegetales que demostraron ser efectivas contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y hongos.

This thesis proposes new methods for estimating the particle size distribution (PSD) of polymeric latex that involve spherical particles with both homogeneous and non-homogeneous core-shell morphology, based on light scattering measurements. In particular, it is presented a new method for estimating PSDs in latex of homogeneous particles on the basis of multiangle dynamic light scattering (MDLS), from which improved estimates can be obtained when compared to classical estimation methods. In the case of latex with core-shell particles, a novel estimation method is proposed for acceptable estimating the bivariate size distribution (i.e., core and particle size distribution) on the basis of light scattering measurements. Also, two alternative methods for estimating PSDs of latex with unknown composition based on elastic light scattering and MDLS are evaluated. Finally, an analysis of the capillary hidrodynamic fractionation (CHDF) technique with turbidity detection is carry out. A study on the uncertainties of: i) the calibration curve: particle diameter vs elution time; and ii) the refractive index of the particles, is performed. Aditionally, a method to quantify and correct the instrumental broadening in CHDF is proposed, that is able to improve the obtained estimates.

Tesis (Magister en Ciencia y Tecnología de los alimentos) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Phytophthora capsici causa enfermedades destructivas en cultivos de Solanáceas y Cucurbitáceas de regiones de clima templado en todo el mundo. El patógeno es heterotálico y requiere la presencia de los dos tipos de apareamiento para reproducirse en forma sexual. La relación de tipos de apareamiento varía en distintas regiones geográficas y por lo tanto la chance para reproducirse sexualmente. Debido a tales características, su comportamiento depende de las condiciones del ambiente donde se encuentra presente. Para caracterizar a P. capsici como patógeno de cultivos comerciales de Cucurbita máxima var. zapallito, Solanum melongena, Solanum lycopersicum y Capsicum annum, en el NE de la provincia de Buenos Aires, se realizó un estudio sistemático. Éste incluyó el muestreo, la descripción de los factores del ambiente donde se detectó el problema y de los síntomas observados en el campo, la identificación de las especies presentes y el análisis de otras variables que pudieran interactuar con el patógeno. Los muestreos en los lotes de los cultivos de interés se realizaron de modo secuencial, entre enero – abril de 2010 y 2011, y abarcaron tres partidos: Luján, General Rodríguez y Exaltación de la Cruz. Se describió la zona de muestreo; sus características socioeconómicas y productivas, los suelos presentes y el clima: las precipitaciones y las temperaturas. Se analizaron las variables presentes en el muestreo y se describieron los síntomas producidos en los cultivos de interés por las especies de Phytophthora y por otras patologías presentes. Se estableció la prevalencia de Phytophthora spp. por hospedante en la zona de estudio, entre los dos años de muestreo. A partir de las muestras de tejido vegetal colectadas de fruto, tallo, brote y plantín, cuya sintomatología coincidió con la descripta para Phytophthora spp., se realizaron los aislamientos. Se evaluó el crecimiento de Phytophthora spp. en AMT (agar manzana tomate), un medio de cultivo nuevo y alternativo al AV8®. Se analizaron además tres métodos alternativos para la conservación de los aislamientos. Las especies presentes fueron identificadas mediante la caracterización morfológica de las estructuras asexuales y sexuales, de modo cualitativo y cuantitativo. Se determinó la proporción de tipos compatibles, A1 / A2, presente en la zona y la sensibilidad de los aislamientos de P. capsici al metalaxil, a una concentración de 100 ppm. Las identificaciones incluyeron también estudios moleculares derivados de la secuenciación de la región ITS y del gen 5.8S. Se utilizó una serie de 69 aislamientos de Phytophthora spp. Con las secuencias de esta región del ADN se construyó un árbol filogenético. Se realizó además, un análisis preliminar de la variabilidad genética con el programa ADNSPv5 v5.10.01 y de la estructura genética, con el programa Arlequín 3.5. En plantines de los cultivos de interés, se analizó la patogenicidad con 4 aislamientos de P. capsici mediante dos métodos; uno consistió en la inoculación de la base de los tallos con trocitos de agar con micelio y el otro en la adición de semillas previamente inoculadas al suelo. En los frutos, se analizó la patogenicidad y la virulencia de una muestra representativa de 14 aislamientos de P. capsici. Para determinar la presencia de las oosporas se enterraron porciones de tallos y frutos, de un cultivo de S. melongena donde previamente se constató la presencia de P. capsici, en macetas y se incubó por un período de 90 días. Las 37 quintas que integraron la zona de muestreo se caracterizaron por su dinamismo ocupacional, la diversificación de cultivos y la atomización de la producción en el espacio geográfico, cuestión que permitió diferenciar la zona de muestreo de otras a nivel mundial donde predomina el monocultivo. Las precipitaciones y las temperaturas no variaron entre los dos años de muestreo. Los suelos no presentaron diferencias relevantes entre los tres partidos, de acuerdo con la escala de trabajo utilizada y con la topografía plana del lugar. Éstas fueron conductivas para el desarrollo de la enfermedad, al igual que las prácticas de cultivo. Se tuvieron en cuenta 5 variables: el año, la localidad, el productor, el hospedante y el órgano afectado. Las dos primeras no tuvieron asociación con la presencia / ausencia de Phytophthora spp., de acuerdo con el análisis de las tablas de contingencia, mientras que con las tres restantes hubo asociación. Para todos los hospedantes, la prevalencia de Phytophthora spp. se incrementó al segundo año, con la excepción del cultivo de S. melongena; el valor máximo, próximo al 50 %, correspondió a C. máxima var. zapallito. Los síntomas se expresaron en las partes aéreas de las plantas y con mayor frecuencia en la etapa reproductiva, lo que estuvo asociado a las condiciones del clima. La caracterización morfológica mostró patrones consistentes para la especie P. capsici, con excepción de algunos aislamientos que fueron identificados como: P. nicotianae y P. drechsleri. La forma de los zoosporangios de P. capsici fue variable; desde obpiriforme, limoniforme, ovovoide a ovoide, con pedicelos que variaron en longitud entre 22 - 69,7 μm. P. capsici fue la especie predominante en todos los hospedantes muestreados, con la excepción de S. lycopersicum y la única especie identificada para C. máxima var. Zapallito. En el caso de S. lycopersicum, predominó P. nicotianae. Los aislamientos de P. capsici fueron del tipo A1. El tipo A2 solo estuvo presente en un aislamiento de P. nicotianae, en una proporción de 1 a 8 (A1/A2). Las identificación morfológica coincidió con la molecular, pero ésta última permitió identificar además a P. cryptogea. El análisis filogenético de las secuencias de la región ITS de los aislamientos de P. capsici mostró un patrón reticulado de haplotipos frecuentes y centrales en la red, con haplotipos menos frecuentes y más recientes en los extremos de la misma, lo cual, en conjunto con la presencia de eventos de recombinación, sugiere la ocurrencia de un proceso de diversificación en la zona de muestreo, a pesar de la presencia de un único tipo de apareamiento. No se observó una estructuración genética entre los hospedantes. Todos los aislamientos de P. capsici analizados resultaron ser sensibles al metalaxil. La evaluación de patogenicidad en plantines con ambos métodos alternativos, en general, determinó un mejor desempeño con los trocitos de agar, con la excepción de los plantines de S. melongena, que no evidenciaron síntomas. En cambio, en los frutos, los 14 aislamientos inoculados produjeron un 100 % de patogenicidad. La virulencia entre los aislamientos inoculados en cada hospedante fue variable. No fueron detectadas las oosporas en las muestras de tejido vegetal analizadas. Los síntomas producidos por las especies de Phytophthora -podredumbres húmedas- se pudieron diferenciar de las otras patologías, según: la clase de órgano que fue afectado (fruto, tallo y brote), la forma, el aspecto, el color de las lesiones y/o la ubicación en la planta. La identificación de P. capsici en Solanum lycopersicum, S. melongena y Cucurbita pepo var. Medullosa, constituyen las primeras citas para Buenos Aires. P. drechsleri constituye la primera cita para la berenjena en el país, y la primera cita para el pimiento, en el país y a nivel mundial.

Phytophthora capsici causa enfermedades destructivas en cultivos de Solanáceas y Cucurbitáceas de regiones de clima templado en todo el mundo. El patógeno es heterotálico y requiere la presencia de los dos tipos de apareamiento para reproducirse en forma sexual. La relación de tipos de apareamiento varía en distintas regiones geográficas y por lo tanto la chance para reproducirse sexualmente. Debido a tales características, su comportamiento depende de las condiciones del ambiente donde se encuentra presente. Para caracterizar a P. capsici como patógeno de cultivos comerciales de Cucurbita máxima var. zapallito, Solanum melongena, Solanum lycopersicum y Capsicum annum, en el NE de la provincia de Buenos Aires, se realizó un estudio sistemático. Éste incluyó el muestreo, la descripción de los factores del ambiente donde se detectó el problema y de los síntomas observados en el campo, la identificación de las especies presentes y el análisis de otras variables que pudieran interactuar con el patógeno. Los muestreos en los lotes de los cultivos de interés se realizaron de modo secuencial, entre enero – abril de 2010 y 2011, y abarcaron tres partidos: Luján, General Rodríguez y Exaltación de la Cruz. Se describió la zona de muestreo; sus características socioeconómicas y productivas, los suelos presentes y el clima: las precipitaciones y las temperaturas. Se analizaron las variables presentes en el muestreo y se describieron los síntomas producidos en los cultivos de interés por las especies de Phytophthora y por otras patologías presentes. Se estableció la prevalencia de Phytophthora spp. por hospedante en la zona de estudio, entre los dos años de muestreo. A partir de las muestras de tejido vegetal colectadas de fruto, tallo, brote y plantín, cuya sintomatología coincidió con la descripta para Phytophthora spp., se realizaron los aislamientos. Se evaluó el crecimiento de Phytophthora spp. en AMT (agar manzana tomate), un medio de cultivo nuevo y alternativo al AV8®. Se analizaron además tres métodos alternativos para la conservación de los aislamientos. Las especies presentes fueron identificadas mediante la caracterización morfológica de las estructuras asexuales y sexuales, de modo cualitativo y cuantitativo. Se determinó la proporción de tipos compatibles, A1 / A2, presente en la zona y la sensibilidad de los aislamientos de P. capsici al metalaxil, a una concentración de 100 ppm. Las identificaciones incluyeron también estudios moleculares derivados de la secuenciación de la región ITS y del gen 5.8S. Se utilizó una serie de 69 aislamientos de Phytophthora spp. Con las secuencias de esta región del ADN se construyó un árbol filogenético. Se realizó además, un análisis preliminar de la variabilidad genética con el programa ADNSPv5 v5.10.01 y de la estructura genética, con el programa Arlequín 3.5. En plantines de los cultivos de interés, se analizó la patogenicidad con 4 aislamientos de P. capsici mediante dos métodos; uno consistió en la inoculación de la base de los tallos con trocitos de agar con micelio y el otro en la adición de semillas previamente inoculadas al suelo. En los frutos, se analizó la patogenicidad y la virulencia de una muestra representativa de 14 aislamientos de P. capsici. Para determinar la presencia de las oosporas se enterraron porciones de tallos y frutos, de un cultivo de S. melongena donde previamente se constató la presencia de P. capsici, en macetas y se incubó por un período de 90 días. Las 37 quintas que integraron la zona de muestreo se caracterizaron por su dinamismo ocupacional, la diversificación de cultivos y la atomización de la producción en el espacio geográfico, cuestión que permitió diferenciar la zona de muestreo de otras a nivel mundial donde predomina el monocultivo. Las precipitaciones y las temperaturas no variaron entre los dos años de muestreo. Los suelos no presentaron diferencias relevantes entre los tres partidos, de acuerdo con la escala de trabajo utilizada y con la topografía plana del lugar. Éstas fueron conductivas para el desarrollo de la enfermedad, al igual que las prácticas de cultivo. Se tuvieron en cuenta 5 variables: el año, la localidad, el productor, el hospedante y el órgano afectado. Las dos primeras no tuvieron asociación con la presencia / ausencia de Phytophthora spp., de acuerdo con el análisis de las tablas de contingencia, mientras que con las tres restantes hubo asociación. Para todos los hospedantes, la prevalencia de Phytophthora spp. se incrementó al segundo año, con la excepción del cultivo de S. melongena; el valor máximo, próximo al 50 %, correspondió a C. máxima var. zapallito. Los síntomas se expresaron en las partes aéreas de las plantas y con mayor frecuencia en la etapa reproductiva, lo que estuvo asociado a las condiciones del clima. La caracterización morfológica mostró patrones consistentes para la especie P. capsici, con excepción de algunos aislamientos que fueron identificados como: P. nicotianae y P. drechsleri. La forma de los zoosporangios de P. capsici fue variable; desde obpiriforme, limoniforme, ovovoide a ovoide, con pedicelos que variaron en longitud entre 22 - 69,7 μm. P. capsici fue la especie predominante en todos los hospedantes muestreados, con la excepción de S. lycopersicum y la única especie identificada para C. máxima var. Zapallito. En el caso de S. lycopersicum, predominó P. nicotianae. Los aislamientos de P. capsici fueron del tipo A1. El tipo A2 solo estuvo presente en un aislamiento de P. nicotianae, en una proporción de 1 a 8 (A1/A2). Las identificación morfológica coincidió con la molecular, pero ésta última permitió identificar además a P. cryptogea. El análisis filogenético de las secuencias de la región ITS de los aislamientos de P. capsici mostró un patrón reticulado de haplotipos frecuentes y centrales en la red, con haplotipos menos frecuentes y más recientes en los extremos de la misma, lo cual, en conjunto con la presencia de eventos de recombinación, sugiere la ocurrencia de un proceso de diversificación en la zona de muestreo, a pesar de la presencia de un único tipo de apareamiento. No se observó una estructuración genética entre los hospedantes. Todos los aislamientos de P. capsici analizados resultaron ser sensibles al metalaxil. La evaluación de patogenicidad en plantines con ambos métodos alternativos, en general, determinó un mejor desempeño con los trocitos de agar, con la excepción de los plantines de S. melongena, que no evidenciaron síntomas. En cambio, en los frutos, los 14 aislamientos inoculados produjeron un 100 % de patogenicidad. La virulencia entre los aislamientos inoculados en cada hospedante fue variable. No fueron detectadas las oosporas en las muestras de tejido vegetal analizadas. Los síntomas producidos por las especies de Phytophthora -podredumbres húmedas- se pudieron diferenciar de las otras patologías, según: la clase de órgano que fue afectado (fruto, tallo y brote), la forma, el aspecto, el color de las lesiones y/o la ubicación en la planta. La identificación de P. capsici en Solanum lycopersicum, S. melongena y Cucurbita pepo var. Medullosa, constituyen las primeras citas para Buenos Aires. P. drechsleri constituye la primera cita para la berenjena en el país, y la primera cita para el pimiento, en el país y a nivel mundial.

Los plásmidos pueden ser considerados como un ensamble de distintos módulos funcionales característicos que le confieren su identidad (Thomas, 2000). Los plásmidos pueden contener en su secuencia genes de proteínas con funciones plenamente plasmídicas (replicación, movilización y mantenimiento), como así también módulos accesorios que le confieren al microorganismo huésped alguna función beneficiosa para competir por un nicho ecológico. Estos plásmidos, cumplen una función particular y necesaria para la supervivencia del organismo bajo distintas condiciones de estrés. En este marco, se han descripto numerosos genes accesorios, que incluyen determinantes de patogenicidad y virulencia, operones de degradación de compuestos xenobióticos, determinantes de simbiosis, y resistencia a antimicrobianos, entre otros. El fenotipo de multiresistencia a antimicrobianos ha tenido un impacto muy grande en las últimas décadas, debido a la presencia de estos genes en bacterias intrahospitalarias (Zavascki et al., 2007, Jean & Hsueh, 2011, Magiorakos et al., 2012). Cuando esta información alcanza a los elementos móviles como los plásmidos, la dispersión de esta información dentro de la comunidad bacteriana cobra lugar rápidamente, dando a lugar a epidemias de bacterias multiresistentes (Woodford et al., 2011, Halachev et al., 2014, Verroken et al., 2014, Eldholm et al., 2015). Debido a la capacidad de los plásmidos de movilizarse, replicarse y mantenerse autónomamente, como así también de adquirir nueva información genética, se han convertido en vehículos especializados en la transmisión de dicha información y por lo tanto en un blanco importante de estudio para diseñar estrategias de control de la diseminación de resistencia a antimicrobianos (Tabone et al., 2014, Getino et al., 2016). Las bacterias pertenecientes al género Acinetobacter han cobrado en los últimos años relevancia clínica, debido a la aparición frecuente de cepas multi/pan resistentes asociadas a infecciones hospitalarias (Villegas & Hartstein, 2003, Scott et al., 2007, Zarrilli et al., 2013, Halachev et al., 2014). Este fenotipo de resistencia ha sido asociado a la adquisición de información por transferencia horizontal de genes, en donde los plásmidos son protagonistas principales. El estudio de la biología de estos replicones puede proporcionar nueva evidencia molecular que ayude a comprender el peso de la transferencia horizontal de plásmidos en la dinámica de transferencia de ADN en general y de resistencia en particular, como así también en la adaptación de estas bacterias a los distintos nichos ecológicos que ocupa. En este trabajo, se evaluó la presencia de plásmidos en dos colecciones de bacterias pertenecientes al género Acinetobacter de origen hospitalario o ambiental. Los perfiles en geles de lisis in situ, demostraron que la mayoría de los aislamientos eran portadores de al menos un replicón plasmídico y que la distribución tanto en tamaño como en cantidad de plásmidos fue variada entre los aislamientos. A partir de aquellos aislamientos portadores de plásmidos, se realizó el aislamiento plasmídico en gran escala y las muestras fueron purificadas por ultracentrifugación en gradiente isopícnico de CsCl-bromuro de etidio. Las muestras enriquecidas en plásmidos fueron secuenciada utilizando la plataforma MiSeq de Illumina. El análisis in silico de los replicones secuenciados completos mostró que la mayoría de los plásmidos presentaron similitud de secuencia con otros plásmidos aislados de cepas de Acinetobacter spp. y que algunos tenían secuencias homólogas a plásmidos aislados de otros géneros bacterianos. Muchos replicones mostraron no sólo tener identidad sino que también presentaron sintenía con plásmidos presentes en base de datos. Sin embargo, en muchos casos la sintenía no fue completa. La presencia de módulos de replicación adicionales, como así también la ausencia de módulos accesorios, como por ejemplo de resistencia, podrían indicar que los replicones tienen un ancestro en común, el cual, pudo haber incorporado o perdido información a lo largo de su evolución. Estos cambios en la estructura, le pudieron haber conferido al replicón la capacidad de poder dispersarse y mantenerse en bacterias de distinto género y/o especie. Con respecto a los módulos de replicación, un análisis que incluyó a todas las Reps de plásmidos de Acinetobacter spp. en base de datos determinó que las proteínas con dominio Rep_3 son las más frecuentemente encontradas en plásmidos de bacterias de este género y esto fue congruente con lo hallado en las colecciones plasmídicas. Para determinar la cercanía entre estas proteínas se llevó a cabo un estudio filogenético de las proteínas completas utilizando el mejor modelo de evolución encontrado para estas secuencias. El árbol resultante graficó la relación filogenética entre estas proteínas y determinó que existen 16 grupos bien diferenciados y soportados. Las secuencias de proteínas Rep_3 fueron utilizadas para buscar homólogos en base de datos y los resultados indicaron que proteínas muy emparentadas se encontraron no sólo en bacterias del género Acinetobacter, sino también en otros géneros distantes. Esta información permite predecir el rango de huésped en donde estas proteínas podrían potencialmente ser funcionales y consecuentemente permitir la replicación y permanencia de los plásmidos. A partir de la búsqueda de proteínas involucradas en mantenimiento plasmídico se pudieron identificar proteínas involucradas en al menos dos mecanismos bien conocidos: partición activa y muerte post-segregacional. Estas proteínas encontraron sus homólogos más cercanos tanto en enterobacterias como en distintas especies del género Acinetobacter. El análisis bioinformático de las secuencias plasmídicas también permitió reconocer proteínas pertenecientes a los sistemas del Dtr y Mpf involucrados en el proceso de conjugación. El análisis filogenético de las relaxasas permitió clasificar a los plásmidos dentro de distintas familias, descriptas en trabajos anteriores (Francia et al., 2004, Garcillan-Barcia et al., 2009). Algunas de las relaxasas estudiadas se encontraron formando un subclado robusto y bien definido dentro de la gran familia MOBQ. El análisis de las secuencias de las relaxasas de este subclado permitió identificar características específicas-únicas de estas proteínas dentro de los 3 motivos que forman parte del dominio funcional N-ter. Debido a esto, este nuevo subclado fue nombrado como el nuevo subgrupo MOBQ4. El análisis experimental de los Dtr de los plásmidos de esta colección pertenecientes al subgrupo MOBQ4, reveló que todos fueron funcionales. Sin embargo, presentaron diferencias en las frecuencias de conjugación cuando un mismo Dtr se enfrentó a distintos plásmidos conjugativos, como así también, cuando distintos Dtr se enfrentaron a un mismo plásmido con funciones helper. Este comportamiento diferencial indicó que, en primer lugar, los sistemas del Mpf de los plásmidos conjugativos reconocen diferencialmente a un mismo relaxosoma. Por otra parte, la diferencia en la frecuencia de movilización de plásmidos con distintos Dtr enfrentados a un mismo plásmido helper demuestra que existen diferencias en el reconocimiento de un mismo Mpf por los relaxosomas. El alineamiento de las proteínas relaxasas completas demostró que las proteínas difirieron en su extremo C-ter y que esta podría haber sido la razón de las diferencias encontradas, si este segmento tuviese relevancia en el reconocimiento y/o transporte llevado a cabo por el Mpf. El análisis filogenético de las proteínas relaxasas en general fue congruente con lo hallado en el análisis nucleotídico de los esqueletos plásmídicos de estos replicones, sin embargo, el análisis funcional para miembros de un mismo grupo demostró que el método para la clasificación de plásmidos no es suficiente para explicar el comportamiento de estos últimos en la transferencia por conjugación en presencia de distintos plásmidos conjugativos. Los resultados mostrados en este trabajo de Tesis en conjunto demuestran que los plásmidos de Acinetobacter spp. han evolucionado para convertirse en vectores especializados en la transferencia de la información. Se pudo demostrar que existen estructuras modulares eficientes y muy conservadas que son responsables de la herencia estable y propagación de los plásmidos como entidades independientes y que la información accesoria se encuentra en dinámica constante, pudiendo ser adquirida dentro de estas estructuras especializadas para luego transferirse horizontalmente. El estudio realizado en este trabajo de Tesis sobre los módulos plasmídicos de bacterias del género Acinetobacter se espera contribuya al aumento de la información sobre la biología de estos vectores, abriendo camino a la comprensión de la dinámica evolutiva de Acinetobacter hacia su establecimiento como un patógeno nosocomial. Así también, se espera que aporte conocimiento a la biología de los plásmidos en general como entidades independientes especializadas en la propagación de la información.

Fil:da Cruz Cabral, Lucía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.