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Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018

α-sinucleína (AS) es una proteína expresada mayormente en cerebro y su función está asociada a la dinámica de vesículas sinápticas en neuronas dopaminérgicas. Su agregación anómala amiloide está vinculada con numerosas patologías neurodegenerativas como por ejemplo la enfermedad de Parkinson. A pesar de los grandes avances realizados, aún se desconocen cuáles son los mecanismos patogénicos asociados a estas enfermedades. Los oligómeros amiloides pre-fibrilares son señalados como las especies más neurotóxicas. Al respecto, la hipótesis mayormente aceptada sugiere una ganancia de toxicidad de AS cuando se encuentra en estado oligomérico. Sin embargo, una pérdida de la función de la proteína al autoensamblarse en estos agregados podría también contribuir a la disfunción celular. En esta tesis se dirigieron los esfuerzos en estos dos sentidos, por un lado, aportando información estructural de las especies oligoméricas para comprender las bases moleculares de su toxicidad y por el otro, evaluando el impacto de la oligomerización en las propiedades de unión a membranas lipídicas, claves para la función de la proteína. Utilizando técnicas espectroscópicas se logró obtener información sobre el arreglo supramolecular de una población de especies oligoméricas de AS. Este ensamble resultó estar formado por agregados estructurados, ricos en estructura hoja-β antiparalela que poseen un patrón bien definido de interacciones intermoleculares. Se demostró que esta estructura distintiva también está presente en especies que se pueblan a lo largo del proceso de agregación amiloide, evidenciando además que este proceso involucra un marcado rearreglo conformacional de la proteína. A su vez, se midió cuantitativamente la unión de AS en su estado monomérico y oligomérico a membranas de distinta composición y curvatura. Se evidenció que la oligomerización de la proteína influye marcadamente en su interacción con membranas, cambiando su sensibilidad a curvatura y alterando su afinidad, llegando en algunos casos a abolir su asociación completamente. La información estructural obtenida en este trabajo, junto con el estudio de unión a biomembranas, constituyen un avance clave para la comprensión de la toxicidad y pérdida de la función de AS asociada a las patologías neurodegenerativas.

Juritz, E. I. (2015). Caracterización estructural de proteínas por métodos evolutivos (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

En el presente trabajo, se realizó la caracterización estructural del bloque Bajo Baguales, el cual se encuentra en el sector central de la Dorsal de Huincul, en cercanías de Plaza Huincul, hacia el Oeste de la Ciudad de Neuquén. A partir de la interpretación de datos sísmicos 3D, y con la ayuda de la información provenientes de legajos de pozos, se pudieron identificar en el área varias estructuras, siendo la de mayor importancia para este estudio un gran pliegue anticlinal localizado en el sector norte del cubo, producto de la propagación de una falla inversa con rumbo Este – Oeste ubicada en este sector, la cual presenta un notable rechazo vertical de alrededor de 700 metros, elevando el basamento cristalino y los depósitos Precuyanos, ambos de gran interés como roca reservorios de hidrocarburos. Las estructuras que podemos encontrar en el área de estudio son el producto de una inversión tectónica, donde un sistema extensional de edad Jurásico fue reactivado en diversos eventos como producto de los esfuerzos provenientes del margen convergente occidental. Dichos esfuerzos presentaron un cambio en la orientación del vector del esfuerzo máximo horizontal de alrededor de 90° desde el Jurásico temprano hasta la actualidad. El reconocimiento de los elementos estructurales, basados en la información sísmica y de pozos exploratorios, fueron utilizados en la confección de secciones estructurales y mapas isócronos para la caracterización estructural de la zona.

El trabajo se llevó a cabo sobre el bloque petrolero Puesto Tuquet, ubicado en el sector centro-oeste de la Dorsal de Huincul, hacia el oeste de la ciudad de Neuquén, Argentina. Se realizó la interpretación de datos sísmicos 3D con ayuda de información de pozos, identificando tres estructuras principales y se determinaron los tiempos relativos de su generación, en función de las relaciones estratales entre las formaciones de roca presentes. La primera de ellas, se encuentra en el sector noroeste (NO) del cubo sísmico, el anticlinal California, que se genera a través de un proceso de inversión tectónica regional, donde se encuentra el yacimiento Puesto Touquet. La segunda estructura, se aloja en el sector centro-norte del cubo sísmico y también está dada por inversión, en este caso correspondiente a dos fallas normales, preexistentes. Se observa la presencia de estratos de crecimiento, interpretados en base a la relación de los reflectores, asociados a la estructura (on-lap, acuñamientos, etc), e información proveniente de legajos de pozo. La tercer estructura de importancia, se ubica en el sector sureste (SE) del cubo, en donde se distingue un claro predominio del basamento por sobre el paquete sedimentario, lo que genera un acuñamiento de la formación Molles, sobre el basamento Precuyano, localizando una particularidad en la cúspide del basamento. En base a la interpretación de estratos de crecimiento y discordancias en las secciones sísmicas, se han determinado cuatro fases principales, para la caracterización tectónica estructural del área, siendo estas: Fase 1 Molles Media-Superior (comienza en el Mb Cutral-có y culmina en el Mb Pelítico Superior); 2 Fase Challaco; 3 Fase Quintuco Superior; 4 Fase base del Grupo Neuquén.

El antígeno B (EgAgB) es una lipoproteína presente en la larva del parásito cestodo Echinococcus granulosus, agente causante de la zoonosis conocida como hidatidosis, enfermedad endémica en nuestra región. Esta proteína pertenece a una familia de proteínas exclusivas de cestodos que unen ligandos hidrofóbicos, conocidas como HLBPs. A nivel proteico, el EgAgB está formado por subunidades de ~8 kDa codificadas por genes polimórficos pertenecientes a 5 subfamilias distintas (EgAgB8/1 a EgAgB8/5); mientras que su componente lipídico está formado por una amplia variedad de lípidos, incluyendo lípidos neutros y polares. El hecho de que muchos de estos lípidos no pueden ser sintetizados de novo por el parásito hace suponer que el EgAgB podría estar involucrado en la adquisición de estos compuestos desde el hospedador, como ha sido propuesto para otras HLBPs. Esto implicaría que el EgAgB interactué con componentes del hospedador para adquirir estos ligandos. En este sentido, existe evidencia de que el EgAgB es capaz de interactuar con células del sistema inmune, modulando su respuesta, lo que a su vez favorecería el establecimiento y permanencia del parásito. Sin embargo, para poder comprender los mecanismos asociados a esta modulación a nivel molecular y determinar si la proteína es capaz de transportar e intercambiar los lípidos, es imprescindible avanzar en el conocimiento estructural y funcional de esta partícula compleja. Con este fin, durante el desarrollo de este trabajo se purificaron las subunidades recombinantes EgAgB8/1, EgAgB8/2 y EgAgB8/3, logrando obtenerlas de forma libre de lípidos. Se logró determinar que estas subunidades son capaces de interaccionar consigo mismas aún en ausencia de lípidos, formando oligómeros de entre 40 y 60 kDa, distintos a los que se han reportado previamente en la literatura en presencia de los ligandos. Por otro lado, se analizó la capacidad de distintos ligandos lipídicos de unirse a estas subunidades y se pudieron determinar constantes de disociación en el orden submicromolar empleando antroiloxi-derivados de ácidos grasos. Más aún, se evaluó la capacidad de las subunidades EgAgB8/2 y EgAgB8/3 de transferir estos derivados hacia membranas fosfolipídicas modelo. Utilizando distintos tipos de vesículas se pudo establecer que ambas subunidades son potencialmente capaces de transferir los ácidos grasos. En el caso de las subunidad EgAgB8/2, la transferencia ocurriría por un mecanismo que involucra un contacto directo con la membrana, mientras que en el caso de EgAgB8/3 la cinética de la transferencia estaría determinada por la disociación del complejo proteína-ligando. Asimismo, para ambas proteínas se pudo determinar que las interacciones electroestáticas tienen importancia en el mecanismo, dado que la transferencia se ve favorecida en el caso de vesículas con mayor carga neta negativa, como ocurre en el caso de vesículas ricas en cardiolipina. Por otro lado, con el fin de evaluar la capacidad de las subunidades libres de lípidos de interactuar con células del sistema inmune, particularmente con monocitos y macrófagos, se encontró que las subunidades EgAgB8/1 y EgAgB8/3 libres de lípidos son reconocidas por estas células, mientras que la subunidad EgAgB8/2 no presenta unión a los monocitos y es pobremente reconocida por los macrófagos. Asimismo, se pudo determinar que la fosfatidilcolina que estaría expuesta en la partícula nativa de EgAgB participaría en la unión, posiblemente modificando la forma en que se exponen las subunidades de EgAgB para que sean reconocidas por las células. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la partícula de EgAgB puede ser reconocida por células del sistema inmune a través de algunas de sus subunidades y el hecho de que en proximidad de una membrana fosfolipídica algunas subunidades pueden ser capaces de transferir sus ligandos, apoya la idea de que EgAgB pueda intercambiar lípidos interaccionando con células del hospedador.

Carrica, M. C. (2008). Caracterización estructural y funcional del factor de virulencia IivA de Brucella abortus (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina

. subtilis se adapta rápidamente a disminuciones de temperatura mediante un mecanismo denominado vía Des, el cual es controlado por el sistema de dos componentes DesK/DesR. El termosensor DesK es el encargado de detectar cambios en la temperatura ambiental y regular la transcripción del gen des que codifica para una Δ5 acil lípido desaturasa, la cual genera insaturaciones en los ácidos grasos de los fosfolípidos de la membrana plasmática modificando la fluidez de la misma. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar los eventos moleculares que tienen lugar en los segmentos transmembrana (TM) de DesK durante la detección de la señal de temperatura. La estrategia inicial que decidimos aplicar es la marcación de spin sitio-dirigida y posterior medición por resonancia paramagnética electrónica (EPR). Dicha estrategia implica la unión de una sonda de spin a residuos de cisteína ubicados en diferentes posiciones de los segmentos TM, para estudiar la dinámica de los mismos en membranas artificiales. Este procedimiento requiere de la purificación de las proteínas en estudio a homogeneidad. Hasta la escritura de esta tesis, los estudios in vitro de DesK completa requerían de la utilización de un sistema de expresión in vitro. Aunque el sistema libre de células ha demostrado ser adecuado para la expresión de DesK, el mismo es muy costosos para ser usado de forma rutinaria. Por este motivo, en una primera instancia nos enfocamos en desarrollar un protocolo que permitiese purificar DesK a partir de cultivos bacterianos, en concentración y pureza suficientes para estudios biofísicos posteriores a un costo reducido. Con este fin, ensayamos diversas estrategias para la expresión y purificación de DesK, incluyendo diferentes vectores de expresión, medios de cultivo, condiciones de crecimiento para la expresión proteica, detergentes para la solubilización de las proteínas de membrana y diversas técnicas cromatográfícas. En función de los resultados obtenidos planificamos un protocolo que permitirán purificar DesK a homogeneidad en micelas de detergente. Resultados posteriores mostraron que la integración de DesK en liposomas permite incrementar la pureza de la misma, indicando que sería posible realizar la marcación con la sonda de spin de las proteínas purificadas en detergente, y posteriormente reconstituir las mismas en liposomas para las subsiguientes mediciones por EPR. Por otra parte, a partir de un análisis informático de covariancia de residuos identificamos pares de aminoácidos con alta probabilidad de interaccionar, ya sea por su cercanía en la estructura cuaternaria, o a través del esqueleto peptídico de DesK. En función a estos resultados seleccionamos posiciones de los segmentos TM que próximamente se reemplazarán por cisteínas, generando variantes de DesK con mutaciones puntuales, para su posterior marcación con la sonda de spin y mediciones de EPR. Estos experimentos ermitirían obtener información estructural y dinámica de los segmentos TM durante la detección de la señal de temperatura. En base a predicciones de estructura secundaria junto con el análisis de las estructuras cristalográficas de la porción catalítica soluble de DesK (DesKC) en distintos estados funcionales, identificamos un motivo de hélices enrolladas (2-HCC) que conecta el dominio TM sensor y el dominio catalítico soluble. La construcción de dos variantes de DesK en las cuales se estabilizó (DesKSTA) o desestabilizó (DesKDEST) el dominio 2-HCC mediante mutaciones puntuales permitió determinar que este motivo juega un rol importante en la regulación de las actividades catalíticas de DesK. Además, de acuerdo con medidas de actividad in vitro de DesK salvaje y DesKSTA insertadas en liposomas, y a ensayos de dinámica molecular de modelos atómicos de DesK salvaje, DesKDEST y DesKSTA, se propuso que en el estado fosfatasa las hélices del segmento TM5 podrían continuar formando un 2-HCC a través de toda la membrana, y que la hidratación de este motivo podría favorecer la apertura del mismo durante la transición al estado auto-quinasa. Por otra parte, se construyeron modelos del estado fosfatasa y auto-quinasa de una quimera funcional de DesK (MS-DesK), la cual posee un único segmento TM por monómero, generado por la fusión de los 17 residuos N-terminales de DesK a los 14 residuos C-terminales del TM5 de DesK. En función a ensayos de dinámica molecular de estos modelos embebidos en bicapas lipídicas de diferente espesor, se propuso un modelo para la detección y transmisión de la señal de temperatura por parte de MS-DesK. En este modelo, a 37 ºC la membrana se encuentra fluida y delgada, y MS-DesK adopta una conformación fosfatasa competente, caracterizada por el enrollamiento de las hélices TM formando un 2-HCC que se prolonga hacia el dominio citoplasmático. Los residuos polares del extremo N-terminal de los segmentos TM se encuentran hidratados debido a la apertura del 2-HCC generada por la bisagra formada entre Gly13 y Pro16, y los dominios de unión a ATP (ABDs) interaccionan fuertemente con el dominio de dimerización y fosforilación de histidina (DHp). Frente a una disminución de la temperatura, la membrana pierde fluidez y se ensancha, generando un movimiento de tijera en el N-terminal de los segmentos TM, favoreciendo la deshidratación de los residuos polares. Los segmentos TM sufren un estiramiento debido al cierre del extremo N-terminal y al segmento citoplasmático KERER que permanece anclado en la interface lípido-agua citoplasmática. Este estiramiento promueve la rotación de las hélices que a su vez provoca el desenrollamiento de los segmentos TM y del 2-HCC. El desenrollamiento estaría favorecido por la hidratación de los residuos polares que se orientan hacia el núcleo del CC. Esta rotación se transmite al DHp, que ahora esconde los residuos hidrofóbicos que le permitían interaccionar con los ABDs. Finalmente, los ABDs quedan libres favoreciendo el estado auto-quinasa competente.

Prosopis alba, P. chilensis y P. flexuosa "algarrobos", características en las regiones fitogeográficas del Chaco y Monte, Argentina, constituyen un recurso natural con innumerables aplicaciones. Si bien el progresivo avance de la desertización ha puesto en riesgo a estas comunidades vegetales, es indudable que en la actualidad constituyen una fuente inagotable de productos y subproductos. A partir del estudio de los caracteres estructurales (micro, ultra, nano), propiedades funcionales y color de los frutos y harinas de P. alba, P. chilensis y P flexuosa, se desarrolló un proceso de secado, molienda y mezcla. Se analizaron y discutieron las observaciones con microscopio óptico (MO), microscopio electrónico de barrido ambiental (MEBA) y con campo de emisión (FESEM), microscopio electrónico de transmisión (MET) y microscopio de fuerza atómica (MFA). Se caracterizaron las harinas de las distintas especies en función de la granulometría, la capacidad de absorción de agua, la capacidad de absorción de aceite, la solubilidad y el color. La investigación permitió optimizar el proceso, elaborar harina enriquecida con proteínas a partir de P. chilensis y proponer una mezcla de fácil formulación. El estudio constituye un aval para lograr la incorporación de P. chilensis al Código Alimentario Argentino.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba: 2015 - 325 h. + CD. ils. col.; grafs.; tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.