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Campylobacter fetus subsp. venerealis y Campylobacter fetus subsp. fetus son agentes causales de la campylobacteriosis genital bovina (CGB), una de las enfermedades reproductivas más importantes en los rodeos bovinos de Argentina. Hasta la actualidad, se han realizado escasos estudios sobre el comportamiento de ambas subespecies de C. fetus en los rodeos bovinos. Lo antedicho, probablemente se deba a que el diagnóstico de rutina de la CGB se realiza por inmunofluorescencia directa (IFD) a partir de muestras de esmegma prepucial por su rapidez, bajo costo, sensibilidad y especificidad, pero sin la identificación microbiológica de las cepas. Además, los conjugados que se emplean en esta técnica, no diferencian entre C. fetus subsp. fetus y C. fetus subsp. venerealis. Por lo tanto, se carece de información sobre la presencia de ambas subespecies a nivel regional. El cultivo microbiológico sigue siendo la técnica de referencia, sin embargo la alta contaminación de algunas muestras clínicas, sumado al costo de un equipamiento adecuado y el tiempo que requiere el cultivo y la posterior caracterización por pruebas bioquímicas, determinan que el diagnóstico microbiológico no se realice en forma rutinaria. En las últimas décadas se han desarrollado y puesto a punto técnicas de biología molecular para optimizar la identificación y la caracterización de C. fetus. La aplicación de nuevas técnicas permitirá complementar los resultados obtenidos por las pruebas tradicionales, caracterizar los perfiles fenotípicos y genotípicos de las cepas, determinar su influencia en la patogenia de la enfermedad, el grado de homología entre ellas y finalmente, contribuir con estudios epidemiológicos que analicen el comportamiento de las cepas en los rodeos a través de los años. El objetivo de la presente tesis doctoral fue caracterizar parámetros fenotípicos y genotípicos de cepas de C. fetus aisladas del tracto reproductor y de abortos bovinos de la provincia de Buenos Aires. El documento se divide en cuatro capítulos, correspondiendo cada uno de los objetivos particulares propuestos. En el Capítulo I se realiza la identificación de las cepas de C. fetus del cepario constituido a partir de los ceparios de C. fetus pertenecientes a los laboratorios de Bacteriología (EEA-INTA Balcarce) y Microbiología Clínica y Experimental de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPBA) conformados por primoaislamientos de muestras de esmegma prepucial, mucus cérvico vaginal y abortos, conservados a -80 °C. La identificación de C. fetus se realizó mediante IFD y pruebas bioquímicas convencionales. De un total de 159 aislamientos registrados en ambas instituciones entre los años 1999 y 2014, se seleccionaron 95 cepas indígenas de C. fetus de los ceparios citados. Los criterios de selección considerados fueron: año de aislamiento, muestras clínicas de origen y localización geográfica, los cuales permitieron los estudios de distribución temporal y espacial que se desarrollaron en los capítulos siguientes. Para la identificación bioquímica de género, especie y subespecie bacteriana, las cepas fueron descongeladas y cultivadas. Posteriormente, se realizó la descripción de la morfología de colonias y bacteriana mediante tinciones y observación en fresco por microscopía de campo oscuro. La inmunomarcación de las cepas se realizó por IFD. La identificación de especie y subespecie bacteriana se realizó mediante pruebas bioquímicas de rutina de nuestro laboratorio. Conjuntamente, se utilizó un sistema comercial miniaturizado de identificación para bacterias del género Campylobacter, Arcobacter y Helicobacter de origen humano. La morfología de las colonias y bacteriana de todas las cepas, fueron compatibles con las descriptas para las especies de Campylobacter. La IFD y las pruebas bioquímicas de rutina permitieron clasificar todas las cepas dentro de la especie C. fetus. Por pruebas bioquímicas, se diferenciaron ambas subespecies. La totalidad de las cepas analizapositiva. Las pruebas de producción de SH2 en sustratos sensibilizados y de tolerancia a la glicina, fueron definitorias en la determinación de la subespecie bacteriana y para el biotipo intermedius de C. fetus subsp. venerealis. Por pruebas bioquímicas convencionales, 50 cepas (52,6%) fueron clasificadas como C. fetus subsp. fetus, 40 (42,1%) como C. fetus subsp. venerealis y 5 (5,3%) como C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius. El sistema miniaturizado comercial no permitió la diferenciación de algunas cepas de ambas subespecies: seis cepas (6,3%) no pudieron ser caracterizadas. Sesenta y ocho (76,4%) fueron identificadas como C. fetus subsp. venerealis y 21 (23,6%) clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus. Los resultados de la identificación de especie y subespecie bacteriana por pruebas bioquímicas y el sistema comercial, fueron comparables para 89 cepas. Se registraron coincidencias para 32 cepas identificadas como C. fetus subsp. venerealis por ambas metodologías. De las 21 cepas clasificadas como C. fetus subsp. venerealis/C. fetus subsp. fetus por el sistema comercial, 15 se correspondieron con C. fetus subsp. fetus y seis con C. fetus subsp. venerealis por pruebas bioquímicas. La limitante del sistema comercial para identificar cepas de C. fetus subsp. fetus, no permitió comparar los resultados para esta subespecie.das presentaron fluorescencia En el Capítulo II, se caracterizan los parámetros de patogenicidad de C. fetus mediante la capacidad de adherencia y citopatogenicidad. Como modelos de estudio se utilizaron cultivos celulares primarios de útero y vagina bovina y la línea celular MDBK. Las monocapas con semiconfluencia celular, fueron desafiadas con las cepas. Para los cultivos primarios se seleccionaron 35 cepas (13 cepas de C. fetus subsp. venerealis, dos de C. fetus subsp. venerealis biotipo intermedius y 20 de C. fetus subsp. fetus) en base a: el año de aislamiento, la muestra clínica de origen, la localidad geográfica y la subespecie bacteriana. Los cultivos de células MDBK fueron desafiados con la totalidad de las cepas. El inóculo fue establecido en una DO610 de 0,8. La incubación se realizó de acuerdo al objetivo del ensayo: evaluación de la capacidad de adherencia (3 h) y efecto citopatogénico (48-72 h). La adherencia bacteriana se observó por tinción de Giemsa y fueron puestas a punto las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido para confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. Se calcularon los indicadores: porcentaje de adherencia a células y número de bacterias adheridas por célula. Para la comparación de los cultivos primarios y células MDBK, las cepas fueron utilizadas como bloques para las variables observadas. El efecto de los cultivos se evaluó mediante un análisis de variancia (ANOVA) con un diseño en bloques. Los resultados permitieron confirmar la capacidad de adherencia de C. fetus a las células uterinas, vaginales y MDBK como así también la aplicabilidad de las técnicas empleadas. El 100% de las cepas fueron adherentes. Los porcentajes de adherencia fueron significativamente mayores para los cultivos primarios en relación a la línea MDBK. Contrariamente, el número de C. fetus por célula fue significativamente mayor para las células MDBK. La aplicación de las técnicas de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de barrido permitieron confirmar y caracterizar la adherencia de C. fetus. Para la evaluación del efecto citopatogénico de C. fetus en células uterinas, vaginales bovinas y MDBK, se registraron alteraciones citoplasmáticas, nucleares y muerte celular. Las alteraciones citoplasmáticas fueron evaluadas mediante la observación en fresco y tinción de Giemsa. El coeficiente de distensión celular ((F<1,3) en células desafiadas y controles, se determinó con la aplicación del programa Image Pro. La actividad mitótica y las alteraciones nucleares mediante tinción DAPI. La observación de los cultivos celulares en fresco y por tinción de Giemsa, permitió establecer una secuencia de hallazgos: granulación del citoplasma, vacuolización citoplasmática, redondeamiento y distensión celular, condensación nuclear y muerte celular con desprendimiento de la monocapa. Las alteraciones se observaron en el 100% de las cepas analizadas para ambos cultivos. La distensión celular fue significativamente mayor en cultivos primarios y la citopatogenicidad en células uterinas. La evaluación de la actividad mitótica en los cultivos de células MDBK, permitió identificar los distintos estadios del ciclo celular, con detenimiento en interfase y profase en los cultivos desafiados respecto a los controles. En los núcleos de células MDBK desafiadas con 17 cepas, se registraron modificaciones compatibles con efectos apoptóticos. El desarrollo y la implementación de los modelos de estudio in vitro permitieron profundizar los conocimientos referentes a la adherencia y el efecto citopatogénico de C. fetus, considerando la importancia de los aspectos éticos, económicos, de bienestar animal y de practicidad. Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros de patogenicidad de C. fetus en los cultivos celulares, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman, utilizando el procedimiento PROC CORR del SAS V9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Se consideraron como relevantes aquellas correlaciones ≥ 0,5. El análisis de las correlaciones de los parámetros de patogenicidad evaluados en cultivos primarios y células MDBK, permitió obtener resultados similares por ambos métodos. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas, significativas y de distinta magnitud. La mayor correlación en los tres cultivos se registró entre el porcentaje de adherencia y de citopatogenicidad. En el Capítulo III se caracterizaron los perfiles moleculares de C. fetus. La caracterización de los perfiles proteicos de las cepas se realizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Los extractos bacterianos de las 95 cepas fueron obtenidos según la metodología de Laemmli (1970). Las corridas se realizaron en un sistema homogéneo en gel de poliacrilamida al 10% (Brooks et al., 1996). Los perfiles moleculares proteicos fueron visualizados por coloración con Coomassie Blue. El análisis proteico se basó en la detección del polipéptido mayor que se correspondería con la microcápsula. Ochenta y siete (91,6%) cepas de C. fetus presentaron bandas del polipéptido mayor con variabilidad de pesos moleculares que se ubicaron en un rango de 100 a 117 kDa. La variabilidad para las cepas de casos intrarodeo fue menor. La tipificación genotípica de las cepas de C. fetus, mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La puesta a punto, se realizó teniendo en cuenta el protocolo descripto por Schulze et al. (2006) basado en el trabajo de Hum et al. (1997) modificando las condiciones de reacción y termociclado (Henegariu et al., 1997). Se emplearon los primers MG3F - MG4R para la detección de la especie C. fetus y los primers VenSF - VenSR para la diferenciación de la subespecie de C. fetus subsp. venerealis (Hum et al., 1997). A partir de los cultivos puros de las cepas en estudio, se realizaron suspensiones bacterianas con una DO610 0,1. La extracción de ADN se realizó por ebullición. Como controles negativos se utilizaron cepas de C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis, C. bubulus y E. coli. La PCR permitió tipificar la totalidad de las cepas en estudio, dentro de la especie C. fetus y diferenciar ambas subespecies: C. fetus subsp. venerealis 49 (51,6%) y C. fetus subsp. fetus 46 (48,4%). Las cepas de casos intrarodeo fueron tipificadas dentro de la misma subespecie. No se observaron amplificaciones inespecíficas ni resultados positivos para microorganismos estrechamente relacionados. La caracterización y subtipificación de las cepas de C. fetus, se realizó por análisis de polimorfismos genéticos a partir de la aplicación de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE - SmaI). Para la implementación de la técnica, se seleccionaron 28 cepas en base a los parámetros descriptos anteriormente. Se aplicó el protocolo para la subtipificación molecular de C. jejuni elaborado por el Centro para el Control y la Prevención de las Enfermedades (CDC) en el marco de la Red PulseNet América Latina y el Caribe para la subtipificación de Campylobacter spp. La interpretación de los resultados se realizó de acuerdo a lo descripto por Tenover et al. (1995). La observación y el registro fotográfico de los geles se realizaron en el fotodocumentador BioRad Gel DOC EQ System y software Quantity One. La comparación de los perfiles de PFGE (PFPs) se realizó visualmente. Para la interpretación de los datos y la elaboración de los dendogramas, se utilizó el programa informático Bionumerics v.5.1 (Applied Maths). Con el objetivo de determinar la relación genética entre las cepas de C. fetus seleccionadas en esta tesis y cepas de C. fetus, C. coli y C. jejuni, se seleccionaron aislamientos pertenecientes a la Red PulseNet. Los perfiles de PFGE obtenidos para C. fetus presentaron fragmentos incluidos en un amplio rango de tamaño y con una distribución homogénea. La homología interespecie entre C. fetus, C. coli y C. jejuni fue 40 - 50% e intraespecie para C. fetus > 70%. La PFGE – SmaI permitió identificar 19 PFPs para las 28 cepas de C. fetus. En el Capítulo IV se relacionaron los parámetros fenotípicos y genotípicos analizados en los capítulos anteriores, con los datos de origen de las cepas de C. fetus y entre sí. La distribución temporal y por muestra clínica de origen de las subespecies de C. fetus fueron analizadas mediante las herramientas de gráfico en el programa Excel. La distribución espacial se evaluó mediante el programa SatScan V9.3 tomando como unidad de localización geográfica al centroide del partido de origen de las cepas. La visualización espacial de las cepas se realizó mediante mapas gráficos utilizando el software QGis 2.10.1. Para la visualización de la distribución espacial de los parámetros de patogenicidad se consideraron los mayores y menores porcentajes de adherencia y de citopatogenicidad para cada subespecie bacteriana. El efecto del origen y de la subespecie de C. fetus sobre los parámetros de patogenicidad, se analizó mediante un ANOVA. Para evaluar la asociación lineal entre los parámetros observados en los distintos cultivos celulares en relación a la muestra clínica de origen y las subespecies, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson y de Spearman. En el período de tiempo analizado se registró la presencia de ambas subespecies de C. fetus con un predominio de C. fetus subsp. fetus en siete años. El mayor número de cepas de C. fetus subsp. fetus fueron aisladas de fetos y de C. fetus subsp. venerealis de hembras y toros. Se observa una distribución temporal homogénea para el porcentaje de adherencia de las cepas en los diferentes cultivos. En células MDBK, los porcentajes fueron menores en relación a los cultivos primarios. La distribución del número de C. fetus por célula fue homogénea, si bien en la mayoría de los años los mayores valores se registraron en los cultivos de células MDBK. Los porcentajes de citopatogenicidad de las cepas fueron superiores al 50% y el F > 1,3 en todos los años de estudio. La subespecie bacteriana no tuvo efecto significativo sobre los parámetros de patogenicidad evaluados. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de toros. Las correlaciones entre los parámetros de patogenicidad fueron positivas y significativas. La adherencia y el efecto citopatogénico se correlacionaron independientemente del número de bacterias adheridas por célula, principalmente para las cepas aisladas de fetos y hembras. La presencia del polipéptido mayor fue independiente de los datos de origen de las cepas. La distribución temporal de las cepas con el polipéptido mayor fue homogénea en todos los años. Al evaluar la distribución espacial, no se observó ninguna tendencia de distribución definida. El polipéptido se observó en 46 cepas aisladas de fetos, 30 de hembras y 11 de toros. En cambio, las cepas que no presentaron el polipéptido fueron aisladas de muestras de fetos (3) y hembras (5). La subespecie bacteriana no tuvo asociación significativa sobre los parámetros de patogenicidad. La mayor patogenicidad se observó en las cepas de origen fetal y la menor en las aisladas de toros. Las subespecies bacterianas, los parámetros de patogenicidad y la presencia del polipéptido mayor de las cepas no registraron tendencias de distribución temporal ni geográfica. Los resultados de la distribución temporal, espacial y por muestra clínica de origen para las cepas caracterizadas por PCR, fueron similares a los obtenidos por pruebas bioquímicas. Los PFPs de C. fetus no se relacionaron con el año de aislamiento, la localización geográfica y la muestra clínica de origen de las cepas en estudio. El porcentaje de similitud para la especie C. fetus fue > 70%. El porcentaje intrasubespecie para C. fetus subsp. venerealis (13 cepas) fue > 80% y sólo tres fueron 100% homólogas y para C. fetus subsp. fetus (15 cepas) > 70%, ocho fueron indistinguibles bajo esta metodología. Los resultados confirman la utilidad de la PFGE – SmaI como una herramienta molecular de alto poder discriminatorio a nivel de subespecie para C. fetus. Para C. fetus subsp. venerealis, sólo dos cepas aisladas de mucus cérvico vaginal fueron indiferenciables bajo esta metodología. En las cepas aisladas de toros las homologías registradas fueron < 75% y para los fetos < 70%. Para C. fetus subsp. fetus, tres cepas aisladas de feto fueron indistinguibles. En las cepas aisladas de hembras las homologías fueron < 70% y en toros <75%. Los PFPs registrados para ambas subespecies en los casos intrarodeo se correspondieron tanto con cepas homólogas como heterólogas. Para evaluar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos por pruebas bioquímicas y la PCR para caracterizar las subespecies, se realizó el test de Mc Nemar y se estimó el coeficiente Kappa mediante el procedimiento PROC FREQ del SAS V.9.12 (SAS, Institute Inc., Cary, NC, USA). Para la subespecie C. fetus subsp. venerealis, fueron identificadas por pruebas bioquímicas 45 cepas (47,4%) y por PCR 49 (51,6%). Para C. fetus subsp. fetus por pruebas bioquímicas 50 cepas (52,6%) y por PCR 46 (48,4%). El test de Mc Nemar no detectó diferencias significativas (p=0,1573) y el coeficiente Kappa fue de 0,8319 indicando una alta concordancia entre ambas técnicas. El bajo número de cepas procesadas por PFGE limitó la asociación de los PFPs con la presencia del polipéptido mayor. Los parámetros fenotípicos y genotípicos considerados en la presente tesis, no se relacionaron entre sí. Finalmente, se concluye que las cepas de C. fetus actuantes en los rodeos bovinos poseen diferencias fenotípicas y genotípicas.

Enterococcus spp. es flora habitual de la microbiota intestinal de humanos y animales, así como importantes patógenos nosocomiales. Desde principios del siglo XX, se conoce que causan infecciones en humanos. Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium son las especies más relevantes clínicamente, particularmente en infecciones invasivas humanas. Estas especies se consideran patógenas oportunistas, ya que las infecciones graves se han asociado principalmente a pacientes inmunocomprometidos. Las infecciones invasivas causadas por enterococos pueden tener un origen alóctono o endógeno. Además, los enterococos presentan resistencia intrínseca a varios antibióticos, como los β-lactámicos, trimetoprima-sulfametoxazol y los aminoglucósidos que podrían mejorar su selección en el tracto gastrointestinal humano. E. faecium y E. faecalis han adquirido resistencia a la mayoría de las familias de antibióticos utilizados en terapia humana, en las últimas tres décadas. Esto llevó a la selección de clones enterocócicos resistentes a múltiples fármacos, lo que complica enormemente el tratamiento antimicrobiano, particularmente en el caso de infecciones graves. La adquisición de resistencia a vancomicina, una de las opciones terapéuticas de primera línea para las infecciones por enterococos, es uno de los problemas más preocupantes para la salud humana. El primer enterococo vancomicina resistente (EVR) reportado en América Latina fue una cepa de E. faecium de Argentina en 1998. Posteriormente, se realizaron estudios epidemiológicos para detectar EVR en diferentes hospitales de Argentina. El linaje clonal más frecuente de E. faecium vancomicina resistente (EFMVR) que circula en los hospitales argentinos parece ser el ST17. Se han realizado varios estudios de vigilancia epidemiológica aplicando técnicas moleculares en nuestro país, sin embargo se limitan principalmente a cepas EVR. No hay documentación de los perfiles de resistencia a los antimicrobianos y de la estructura poblacional de E. faecalis y E. faecium aislados de infecciones invasivas humanas en el Hospital Público de Tandil, Argentina hasta la fecha. El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar fenotípicamente y genotípicamente Enterococcus spp. aislados de líquidos obtenidos por punción, de infecciones invasivas humanas, de pacientes ingresados en el Hospital Municipal Ramón Santamarina (HMRS) de Tandil. Además, el segundo objetivo general fue detectar la resistencia a los antimicrobianos y evaluar in vitro varias opciones terapéuticas en enterococos resistentes a múltiples fármacos (MDR). Las cepas de Enterococcus spp. se recuperaron de forma retro-prospectiva a través de un estudio transversal a partir de infecciones invasivas de pacientes hospitalizados en el HMRS entre 2010 y 2014. Todas las cepas fueron identificadas con métodos convencionales fenotípicos y confirmadas por MALDI TOF-MS. Cuarenta y cuatro fueron identificadas como E. faecalis (69,8 %) y 19 como E. faecium (30,2 %). La caracterización molecular y la relación clonal se determinaron mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y tipificación de secuencias multilocus (MLST). La susceptibilidad a 15 antimicrobianos ampicilina, penicilina, ampicilina/sulbactam, cloranfenicol, vancomicina, teicoplanina, estreptomicina (resistencia de alto nivel: RAN), gentamicina (RAN), ciprofloxacina, levofloxacina, quinupristin-dalfopristin, clindamicina, eritromicina, linezolid y tigeciclina fue determinada por el método de difusión de disco y por concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). El genotipo de resistencia a glucopéptidos fue determinado por PCR. La actividad antimicrobiana se evaluó in vitro mediante estudios de cinética de muerte utilizando curvas de letalidad. Este trabajo de tesis contribuye a generar conocimiento para continuar avanzando en la temática de la resistencia antimicrobiana y su estrategia de control en Argentina en el contexto de “Una Salud’’. Además, reconoce que, la detección y el control epidemiológico de los enterococos MDR es necesario realizarlo tanto en reservorios humanos como no humanos, para evitar su diseminación e impacto en salud pública.

Tesis (Magister en Ciencias Agropecuarias. Mención: Producción Vegetal)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2014.

Helicoverpa gelotopoeon (D.) (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga polífaga de la subfamilia Heliothinae que ocasiona daños a los cultivos de soja, garbanzo, algodón y alfalfa, entre otros. Algunas especies de este complejo han desarrollado resistencia a cultivos genéticamente modificados e insecticidas, lo cual ha llevado a incrementar el interés sobre la biología, diversidad genética y estructuración poblacional de H. gelotopoeon. El objetivo de este trabajo fue determinar la existencia de estructura genética de poblaciones de H. gelotopoeon en función de distintas plantas hospederas y regiones de la Argentina en base a características biológicas y moleculares. Los parámetros biológicos evaluados fueron: duración de los estados de huevo, larva y pupa, número de estadios larvales, masa pupal y longevidad de adultos. Los parámetros reproductivos evaluados fueron: número de espermatóforos, período de pre, ovi y postoviposición, fecundidad y fertilidad. Para los ensayos de compatibilidad reproductiva se realizaron cuatro tipos de cruzas: parentales, híbridas, retrocruzas y cruzas entre híbridos. Para la caracterización molecular se utilizaron marcadores nucleares (microsatélites) y mitocondriales (de las regiones Citocromo oxidasa I y Citocromo b), ya que se consideró que ambos marcadores podían proveer información complementaria y más precisa para entender la estructura poblacional de esta especie. A partir de los resultados obtenidos en esta investigación, se observó que H. gelotopoeon completa su ciclo aproximadamente en 45 días en condiciones de laboratorio, observándose la mayor mortalidad en el estado de huevo y los primeros estadios larvales. Las poblaciones pertenecientes a distintos cultivos y regiones mostraron parámetros biológicos y reproductivos similares. A su vez, las cruzas intra e interpoblacionales no mostraron signos de incompatibilidad reproductiva, sugiriendo un flujo génico sustancial entre las poblaciones. Los marcadores nucleares microsatélites mostraron que las poblaciones de H. gelotopoeon no están estructuradas y hay flujo génico entre ellas, correlacionándose este resultado con lo observado a nivel biológico. Sin embargo, los marcadores mitocondriales mostraron que en general existiría cierta estructuración genética entre las poblaciones de H. gelotopoeon. Se consideran diversas causas que podrían haber contribuido a esta estructuración, como ser: región geográfica, planta hospedera, año de recolección, influencia de plantas silvestres, distintos sistemas de manejo, etc. Se destaca también la necesidad de realizar más estudios, abarcando una escala geográfica mayor, así como otros cultivos y posibles hospederos silvestres a lo largo de varias campañas. Todo esto ayudará a comprender mejor el grado de flujo génico y la repercusión del comportamiento migratorio de H. gelotopoeon en las distintas campañas. Este trabajo de tesis constituye el primer estudio de caracterización biológica y genética de H. gelotopoeon, información que servirá para desarrollar estrategias de manejo de esta plaga en Argentina, sobre todo haciendo énfasis en el retraso del desarrollo de resistencia a insecticidas y cultivos Bt.

El mal de Río Cuarto virus (MRCV) es la enfermedad más importante del maíz (Zea mays L) en la Argentina. El MRCV -género Fijivirus, Familia Reoviridae- es transmitido de manera persistente por Delphacodes kuscheli Fennah. Estudios iniciales mostraron que la resistencia al MRCV es un carácter poligénico de moderada heredabilidad, regido por genes con efectos genéticos aditivos y no aditivos. Los genotipos usualmente tienen respuestas impredecibles porque esta enfermedad virósica, que se presenta de manera no sistemática, manifiesta una marcada interacción genotipo x ambiente. Los objetivos del presente estudio fueron evaluar fenotípicamente familias segregantes F2:3 de maíz por los caracteres índice de severidad (ISE), incidencia (INC) y severidad (SEV) del MRCV, así como por intervalo antesis-estigma (IAE) y rendimiento (RTO); estimar la heredabilidad y correlación de los caracteres; identificar loci de caracteres cuantitativos (QTL) para ISE, INC y SEV; y determinar la consistencia en las posiciones encontradas. Un total de 208 familias F2:3 derivadas del cruzamiento entre la línea parental susceptible (B73) y resistente (LP116), fueron evaluadas para los caracteres mencionados en tres ambientes en el área donde el MRCV es endémico. La extracción de ADN se realizó desde material vegetal obtenido de las líneas parentales y de las generaciones F1 y F2. El análisis molecular se realizó con marcadores microsatélites y se efectuaron análisis de ligamiento entre los mismos para identificar regiones del genoma asociadas a los caracteres. Los valores estimados de heredabilidad fueron moderados para todos los caracteres en ambientes individuales donde las componentes de varianza genética y ambiental presentaron similares dimensiones; las estimaciones a través de ambientes fueron inferiores debido a una gran proporción de la componente de varianza genotipo x ambiente. El ISE del MRCV presenta correlaciones positivas y significativas con síntomas en panojas y hojas, INC, SEV e IAE, y correlaciones negativas y significativas con altura de planta y RTO. Los QTL estables detectados para ISE, INC y SEV del MRCV, mediante el análisis de QTL para caracteres múltiples en ambientes múltiples (MTME), ubicados en los bins 1.03, 1.07, 4.01, 8.08 y 10.03, resultan posiciones consistentes al observar lo encontrado en estudios previos, por lo que serán regiones candidatas para profundizar la investigación de las bases genéticas de la resistencia a la enfermedad. Sobre la base de heredabilidades moderadas e interacciones genotipo x ambiente significativas, la selección para la resistencia requiere continuar con la evaluación de distintas fuentes de germoplasma a través de múltiples años y localidades.

Aspergillus flavus es uno de los principales productores de aflatoxinas, carcinógeno de grado 1. La Argentina es un país agrícola donde el cultivo de maní (Arachis hypogaea) es uno de los más rentables, pero también uno de los más susceptibles de ser atacados por Aspergillus. El origen del maní cultivado proviene de Argentina y Bolivia, donde se encuentran distribuidas las especies nativas del género y sobre las cuales no existen estudios sobre los hongos productores de micotoxinas asociados. Por primera vez se realizó un relevamiento de especies nativas de Arachis y se aislaron Aspergillus de la sección Flavi, comparando la diversidad fúngica de las especies nativas y cultivadas. Se estudió la estructura poblacional de A. flavus de semillas de maní en base a la técnica de compatibilidad vegetativa, potencial toxigénico y producción de esclerocios de tipo S o L. Se llevó a cabo una revisión de la sección Flavi utilizando características morfológicas, filogenia molecular y perfil de producción de extrolitos. Los resultaron mostraron que existen diferencias en la proporción y especies de la sección Flavi asociados a las especies de Arachis. Mas del 90% de A. flavus produjeron aflatoxinas y cerca del 100%, ácido ciclopiazónico. Las cepas S produjeron aflatoxinas tipo B y G. El porcentaje de las cepas L es mas alto que el de las cepas S. La presencia de un alto numero de VCGs con un solo aislamiento y el bajo número de grupos de compatibilidad vegetativa que incluyeron aislamientos de diferentes zonas agroecológicas demostraron la alta diversidad poblacional de A. flavus en nuestro país. Cepas tipo L y S de A. flavus actúan de diferente manera, presentan diferencias morfológicas, perfil de producción de extrolitos y quedan agrupadas en diferentes clados. Las especies nativas de Arachis podrían actuar como reservorios de Aspergillus sección Flavi. El alto potencial toxigénico de las especies de Aspergillus y la alta diversidad genética de A. flavus son factores importantes cuando se debe elegir y formular medidas de control a aplicar en el campo. La heterogeneidad en las poblaciones derivadas de las semillas de maní sugiere que las poblaciones de A. flavus se encuentran bajo continuos cambios temporales y espaciales. La sección Flavi se caracteriza por la superposición de caracteres entre los miembros del grupo por lo cual el estudio taxonómico requiere de la utilización de diferentes disciplinas. Del análisis filogenético se concluye que la habilidad de producir aflatoxinas fue perdida (o ganada) varias veces en la evolución de los integrantes de la sección. Se describen 2 nuevas especies.

El tomate es una de las hortalizas de mayor importancia económica mundial. A través del cruzamiento entre el cultivar argentino Caimanta de Solanum lycopersicum y la accesión LA722 de la especie silvestre S. pimpinellifolium mediante un programa de selección divergente-antagónica para el peso y la vida poscosecha de los frutos, se desarrollaron 17 líneas endocriadas recombinantes (RIL). Como resultado del cruzamiento entre RIL es posible obtener los llamados híbridos de segundo ciclo (HSC). En estos HSC es viable encontrar nueva variabilidad genética por recombinación de los genes seleccionados durante la obtención de las RIL progenitoras. El objetivo de la Tesis fue caracterizar fenotípica y molecularmente tres generaciones F2 obtenidas de la autofecundación de tres HSC (RIL18xRIL1, RIL1xRIL8 y RIL1xRIL5), determinar la variabilidad existente en los dos niveles de caracterización, identificar regiones genómicas asociadas a caracteres de calidad de los frutos y seleccionar una generación segregante para iniciar un nuevo programa de mejoramiento. La caracterización molecular de las tres generaciones F2 utilizando seis combinaciones de cebadores de AFLP (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos Amplificados) originó en todas las poblaciones un número de bandas superior a 100 y un porcentaje de bandas polimórficas superior al 57%, determinando la presencia de una alta variabilidad molecular en todas las poblaciones. En el nivel fenotípico se evaluaron los caracteres del fruto: diámetro, altura, índice de forma, peso, vida poscosecha, firmeza, cociente de absorbancias (a/b), porcentaje de reflectancia (L), pH, sólidos solubles y acidez titulable. La variabilidad generada fue evidenciada dado que, en la mayoría de los casos, se identificaron individuos F2 que tuvieron valores superiores o inferiores a los valores promedios de las RIL. Por otro lado, la aplicación de diferentes herramientas multivariadas permitió conocer, en una primera aproximación integral, las diferentes estructuras de las poblaciones. En el Análisis de Componentes Principales, en las tres generaciones, fueron necesarias las primeras cuatro componentes para explicar cerca del 80% de la variabilidad fenotípica. Analizando la variabilidad molecular con el Análisis de Coordenadas Principales, para obtener el mismo porcentaje de variabilidad, fueron necesarias 12 o más coordenadas. El consenso obtenido entre ambas clases de variabilidad por un Análisis de Procrustes Generalizado fue superior al 64% en todas las F2. La alta asociación entre la información en los niveles fenotípico y molecular encontrada en esta primera aproximación fue profundizada mediante la estimación de diferentes parámetros genéticos y la detección de QTLs (loci de caracteres cuantitativos) por métodos convencionales. Respecto al grado de dominancia, en general, predominó la dominancia completa, aunque también se observó dominancia parcial,sobredominancia y aditividad pura, pero en menor medida. Por otro lado, las tres generaciones presentaron los mayores valores de heredabilidad para los caracteres pH, sólidos solubles y acidez titulable. Se detectó un amplio número de QTLs para la mayoría de los caracteres en las tres generaciones, aunque ninguno de ellos se pudo validar ya que no fueron comunes. La generación F2 del HSC RIL18xRIL1 presentó el mayor número de QTLs detectados y asociados a todos los caracteres; en consecuencia, fue seleccionada para hacer una caracterización molecular más exhaustiva y derivación de familias F3. En relación a la caracterización molecular se llevó a cabo utilizando marcadores de tipo SSR (Repeticiones de Secuencia Simple) y SNP (Polimorfismo de Nucleótido Simple). Por un lado, se utilizaron 12 combinaciones de cebadores de SSR de los cuales el 92% resultaron ser polimórficos. Con estos SSR polimórficos se detectó un total de siete QTLs para peso, vida poscosecha, ambos atributos de color (L y a/b), sólidos solubles y acidez titulable. Dos de ellos (asociados a a/b y a vida poscosecha) pudieron ser validados ya que también fueron identificados en una población retrocruza relacionada. Por otro lado, al disponer de las secuencias de Caimanta y la accesión LA722, se desarrollaron marcadores altamente específicos del tipo SNP. Se utilizaron 130 SNP localizados en los 12 cromosomas de la especie cultivada. De ellos, sólo el 59% segregaron en los individuos de la generación F2, y con ellos se detectaron siete QTLs para diámetro, peso e índice de forma. Se elaboró un mapa físico y genético. Mediante el primero, se pudo estimar que las regiones no segregantes fueron levemente superiores al 50% mientras que el porcentaje de regiones segregantes fue de unos puntos por debajo del 50% (46%). En cuanto al mapa genético, se obtuvieron 23 grupos de ligamiento. En relación al avance a la siguiente generación de autofecundación, aplicando criterios fenotípicos y moleculares se seleccionaron 18 individuos F2 para obtener las familias F3., que fueron caracterizadas fenotípicamente para los mismos atributos que sus progenitores. Se detectaron heredabilidades en sentido estricto significativas para diámetro, altura, índice de forma, peso, pH y acidez titulable. Se concluye que a través de la caracterización fenotípica y molecular con los diferentes tipos de marcadores de ADN utilizados se pudo corroborar que los HSC presentan combinaciones genotípicas favorables entre los genes que fueron seleccionados en generaciones previas. Estas nuevas combinaciones originaron variabilidad genética en el nivel molecular y fenotípico. También fue posible identificar numerosos QTLs mediante los diferentes marcadores moleculares y validar algunos de ellos. Con la información obtenida en estas generaciones tempranas se seleccionaron individuos dentro de la población base seleccionada para obtener familias F3, para iniciar en base a estos resultados un nuevo programa de mejoramiento genético para los caracteres de calidad de fruto.

Faccone, D. (2010). Caracterización fenotípica y molecular de mecanismos de resistencia emergentes en estreptococos de interés clínico (Tesis de Doctorado).

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agrarias, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en marzo de 2018.

La respuesta de las bacterias al estrés osmótico es actualmente de gran interés debido a los aspectos importantes de su aplicación. La mayoría de los estudios realizados en procariotas se han focalizado sobre la regulación genética y sobre aspectos fisiológicos de la adaptación a la alta osmolaridad. El comportamiento de las envolturas no ha sido prácticamente estudiado, sin embargo, existen diversas evidencias que sugieren que la composición de las envolturas celulares posee un rol importante durante el mecanismo de osmosensado. El objetivo de este trabajo fire el de estudiar el efecto del estrés osmótico sobre la estructura y composición bioquímica y biofisica de las membranas de Bacillus subtilis YB886 utilizando diferentes enfoques como la bioquímica, espectroscopía de fluorescencia y biología molecular. En esta tesis demostramos que se producen importantes variaciones en la composición de lípidos polares y de ácidos grasos (AG) durante la adaptación de B. subtilis. Entre los principales fosfolípidos presentes en la membrana de esta especie, se observó que cuando la bacteria es crecida en medios hipersalinos se produce una disminución en el contenido de fosfatidilglicerol de 40 a 31% y un aumento en el de cardiolipina de 24 a 46%. Además de las variaciones observadas a nivel del grupo polar de los lípidos, se determinó un cambio significativo en la composición de AG entre las diferentes condiciones de cultivo. Las células crecidas en el medio hipersalino presentan una marcada disminución en el contenido de AG saturados ramificados y un aumento en el de los saturados lineales. Asimismo, se observó un aumento en el contenido de los AG monoinsaturados, los cuales representan un 6% bajo condiciones normales de crecimiento y alcanzan un 18% en estrés osmótico. Con el objetivo de caracterizar la estructura y dinámica de la membrana, se utilizaron diferentes técnicas espectroscópicas. Se determinó que en respuesta al estrés osmótico se produce un aumento en el empaquetamiento de los lípidos de las membranas, hecho que fue evidenciado por medio de las tres sondas fluorescentes utilizadas. No obstante, esta variación no se observó en los liposomas preparados con los lípidos extraídos a partir de las células, indicando que el aumento en el empaquetamiento de los lípidos depende de la presencia de las proteínas de membrana. En este trabajo también se determinó que en las membranas de B. subtilis otras propiedades fisicas de la membrana, como la hidratación de la interfaz, cambia en fimción de la osmolaridad del medio exterior. Además, se construyeron diversas cepas mutantes para la biosíntesis de fosfolípidos. Los resultados obtenidos demostraron la importancia de los lípidos aniónicos (cardiolipina y fosfatidilglicerol específicamente) en la adaptación al estrés osmótico en esta especie. Nuestros resultados indican que la interrupción del gen cls2 provoca una deficiencia total en la síntesis de cardiolipina, sugieriendo que el producto del gen cls2 es la principal cardiolipina síntasa en esta especie. En esta tesis se demostró por primera vez los cambios biofisícos y bioquímicos que se producen en la membrana de B. subtilis en respuesta al estrés osmótico. Estos cambios serian indispensables para contrarrestar el desbalance osmótico presente entre las células y el medio externo.