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El presente trabajo consiste en un estudio de la oxidación electroquímica del cobre, con la finalidad de obtener óxido cuproso. Ha sido nuestra idea la de efectuar un estudio lo más completo posible, con los medios que teníamos a nuestro alcance, de todos los factores que, de una u otra manera, intervienen en la obtención electroquímica de óxido cuproso, es decir, aquellos que tienen valor desde un punto de vista que podríamos llamar teórico (tal es el caso de las determinaciones de los potenciales de descomposición) como de aquellos otros que tienen un valor eminentemente práctico (influencia de distintos factores en la producción y en las características físico-químicas del producto obtenido). Al decir, precedentemente, que nuestra idea ha sido la de efectuar un estudio ”lo más completo posible“ sobre el tema, es necesario que dejemos aclarado que no pretendemos que tal estudio se haya realmente llevado a cabo con todo éxito, ni mucho menos que sea este un trabajo exhaustivo sobre el tema. Pero, no obstante ello, nos encontraremos conformes si, en la medida de lo hecho, ello resulte un paso más adelante en la investigación en general y, en el caso particular que nos ocupa resalte, una vez más, la importancia enorme que tiene, durante la fabricación de un producto por vía electroquímica, el conocimiento amplio de las variables puestas en juego durante el proceso, por la influencia notable que ellas ejercen sobre la constitución íntima del producto en cuestión.

El objetivo de este trabajo fué estudiar las variables que afectan la producción de la aspirina (ácido acetilsalicílico) mediante la acetilación del ácido salicílico con cetona. Los métodos clásicos paraobtener aspirina usan como agente acetilante el anhídrido acético, ya sea solo o con catalizadores. El nuevo método estudiado tiene la ventaja de no dejar subproductos, de llevar a cabo la reacción más rapidamente y de permitir dar un empleo a la propanona que resulta como subproducto de distintas industrias ( fermentación acetobutílica, oxidación catalítica del cumeno, etc.). El trabajo se dividió en dos partes : una dedicada exclusivamente al aspecto preparativo y la otra fué un intento de estudiar la cinética de la reacción. Esta se llevó a cabo en una columna con relleno de anillos Raschig de 6 mm. provista de una camisa por la que se circulaba agua para termostatisar. En dicha columna se colocó un determinado volumen de solución de ácido salicílico y se hicieron circular los gases que contenían cetona.- Esta se obtuvo en un reactor tubular homogéneo, continuo, por pirólisis de propanona a unos 750 °C. Terminado el pasaje de los gases, se tomó una muestra de la solución y se tituló con NaOH usando fenolftaleina como indicador, luego se añadio un exceso conocido del álcali y se hirvió unos 10 minutos, se enfrió y tituló por retorno con H2SO4.- El consumo de álcali en esta última operación se tomó como medida de la cetona unida al grupo -OH del ácido salícilico. El resto del NaOH consumido, deducido el gastado en neutralizar el -CO2H del ácido salicílico inicial, dió la medida de la cetona absorbida que no había reaccionado con el -OH.- Cunando se estudió la faz preparativa se utilizaron como solvente el éter etílico, el ácido acético y la propanona. En el caso de los dos primeros, después de absorber la cetona, se vació la columna, se lavó dos o tres veces, se unió al resto de la solución y de ésta se tomó una parte alícuota que luego se concentró. Por enfriamiento se hizo cristalizar, luego se filtró al vacvío, se lavó y secó.- El uso del ácido acético no fué favorable por cuanto los rendimientos del producto separado fueron muy bajos y bastante impuros. El éter etílico, si bieb permitió recuperar entre un 70 y 90% de la aspirina formada, ésta fué siempre impurificada por pequeñas cantidades de sustancias que le impartieron colores oscuros y olor desagradable. Otro inconveniente lo representó la poca solubilidad del ácido salicílico y de la misma aspirina, aunque dicha solubilidad se vió aumentada por la presencia de propanona, arrastrada en parte por los gases que entraron a la columna. La propanona como solvente permitió la separación de los productos mediante dos procedimientos. En el primer caso, se añadio agua a la solución acetilada, con lo que se separó la aspirina al disminuir su solubilidad. Esta técnica permitió recuperar hasta un 88% de la aspirina formada, pero no pudo evitarse la separación conjunta de resinas y polímeros de la cetona que impurificaron el producto dándole su color característico. El otro método separativo consistió en concretar la solución a presión reducida, calentando a B.M.- Los cristales se separaron según se indicó en el caso del éter etílico y el ácido acético. Esto permitió la obtención de aspirina pura pero con rendimientos del 30-40%. El ácido sulfúrico como catalizador no mejoró las condiciones de acetilación; por el contrario, su presencia impartió a la solución color más oscuro.- De lo que antecede, surgió la necesidad de estudiar la posibilidad de purificar el producto por cristalización.- Los ensayos se efectuaron utilizando los siguientes solventes: etanol, etanol-agua (1/1), propanona-agua (1/4), tetracloruro de carbono, tetracloruro de carbono-anhídrido acético (10/1); éter etílico y ácido acético glacial.- Los resultados pueden resumirse del siguiente modo: las veces que se usó un solvente mezclado con agua se separó algo de líquido oscuro y no permitió obtener un producto puro, con tetracloruro de carbono y anhídrido acético no se consiguió hacer cristalizar, finalmente con los solventes orgánicos solos no siempre se pudo recuperar un producto puro y en general los rendimientos de recuperación fueron bajos. Desde el punto de vista cinético se efectuaron distintos ensayos en los que se varió el tiempo de pasaje de los gases, su caudal, la concentración de ácido salicílico, la concentración de cetona en la fase gaseosa y la temperatura-. Se supuso que, como ocurre en la mayoría de las absorciones de gases con reacción química, no había resistencia en la película gaseosa y que en consecuencia el coeficiente volumétrico total era igual al coeficiente de película liquida para la transferencia de masa.- Dicho de otro modo se supuso que K´LA . a´=k´LA . a´=NA/V.(CAi-CAL) K´LA.a´: Coeficiente volumétrico total de transferencia de masa (min^-1). k´LA.a´: Coeficiente volumétrico de película líquida para la transferencia de materia (min^-1). NA: Cantidad de materia, cetena, transferida por unidad de tiempo (g.mol/min.) V: Volumen del sistema líquido-gas(1). CAi:Concentración de cetena en la interfase (gmol./l.) CAL: Concentración de cetena en el seno del líquido (gmol./l.) El valor de CAi se calculó con ka fórmula establecida por M.S. Dinaburg y B.A. Porai- Koshita (Zhur.Prikland.Khim.28,2664 (1955)) que se supuso válida para las condiciones en que se llevaron a cabo las experiencias. Se observó que la cetona absorbida, no se pudo eliminar mediante el pasaje de aire a presión reducida.- Este hecho más otros detalles experimentales permitieron suponerque la cetena debía reaccionar de alguna forma con la propanona y por consiguiente que resultaba válido en primera aproximación suponer que su concentración en el seno del líquido era cero. Con estas consideraciones se observó que el coeficiente volumétrico de transferencia de masa aumentaba al aumentar el flujo gaseoso, pero ello no pudo tomarse como dato concluyente de que la resistencia en la película liquida fuera la etapa controladora porque simultáneamente aumentaba el área de transferencia. La velocidad de consumo de cetena, es decir la cantidad de cetena consumida, por absorción y reacción química, por unidad de tiempo y de volumen fué proporcional a la concentración de cetena en la interfase lo que probó que se trataba de una reacción de primer orden respecto de dicho reactante. También se comprobó que con respecto al ácido salicílico es de orden cero. Finalmente, las variaciones del coeficiente volumétrico de transferencia de masa con la temperatura y la determinación del coeficiente de difusión de la cetena en propanona, D AL , calculada con la fórmula de C.R.Wilke(A.I.Ch.E.Journal 1,264(1955)) permitieron establecer un valor de la energía de activación para la absorción y reacción química de la cetena en solución cetónica de ácido salicílico.-Este valor resultó ser igual a 2700 cal/gmol. Conocido este valor se calculó la siguiente ecuación para la velocidad de consumo de cetena en solución en tónica de ácido salicílico. F= 4,58 CAi (DAL) 0,5 e -1350/RT (g.mol/l.seg.).

Fil:Rosenthal, Eduardo T.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Se ha ensayado el método original de Milas para la obtención del ácido fumárico comprobando el rendimiento obtenido por dicho autor, y su posible aplicación industrial pero usando para ello productos del país; "Celarite" (solución acuosa de clorato de calcio) y Furfural. Se han estudiado experimentalmente algunas variantes que pueden influir en el rendimiento (Tiempo de calentamiento, Acidez, Dilución y Agitación).

Agar o agar-agar, es el nombre comercial aplicado al extracto gelatinoso, seco, parcialmente blanqueado, de ciertas especies de algas rojas (Tressler). Actualmente la fórmula molecular aceptada es la siguiente (difiriendo los distintos autores solamente en el número de moléculas de galactosa): (ver estructura en la tesis). El tiempo de ebullición prolongado, el aumento creciente en la concentración de sales o un pH alcalino o ácido pronunciado, tienen influencia en la disminución de la viscosidad de sus soluciones. (ver tabla de valores en la tesis). Carece de valor alimenticio y es usado en la fabricación de cremas, dulces, mermeladas, repostería, sopas, etc. por su alto poder gelificante. En farmacia como laxante suave y en otras industrias como la de films fotográficos, filamentos de lámparas incandescentes, clarificantes de licores, terminado de cueros, etc., E.E.U.U. y Japón absorben la producción mundial la cual es insuficiente. La única fuente de obtención conocida de agar son las algas marinas de las especies Ahnfeltias, Gelidium, Pterocladia, Chondrus, Digenea, Eucheuma, Gracilaria, Gigastina y Suhria de las costas de Japón, E.E.U.U., Corea, China, Australia, Rusia, Suecia, Noruega, Chile, Irlanda, Escocia. El método de extracción varía de acuerdo a los autores y los diferentes tipos de alga, pero fundamentalmente consiste: 1) extracción del alga con agua a presión o en vaso abierto (de 50 a 80°C ) y separación grosera de ésta de la solución de agar obtenida. 2) separación del agar de la solución por congelación y posterior descongelación, utilizando las variaciones atmósfericas como en el primitivo método japonés o en forma artificial como en el método americano. 3) decoloración anterior o posterior a esta separación, de acuerdo al autor, con hipoclorito, peróxido de sodio, C animal activado, cloro, etc., e inmediatamente filtración. 4) secado final hasta obtener en agar con el 20% de humedad, terminando el producto de acuerdo al mercado en finas tiras, escamas o polvo. Antes de la extracción se somete al alga a un lavado previo con agua dulce para eliminar impurezas y a veces al mismo tiempo se la somete a los rayos solares para su decoloración. La congelación como forma de separación del agar de la solución es reemplazada por un autor japonés, por una precipitación del agar con SO4Na2 y por un autor ruso por un fuerte batido de la solución y posterior agregado a un volumen mayor de agua a temperatura baja con la aparición posterior de copos de agar en suspensión. El alga sobre la que se han hecho los ensayos, fué cosechada en las roquerías de Puerto Deseado y corresponde a la siguiente clasificación botaníca: Grupo : Rodophyceae Orden : Gigartinales Familia : Rhyllophoreceaea Especie : Ahnfeltia Tipo : Durvillea Es la única de las estudiadas hasta ahora en la República Argentina capaz de producir agar-agar de buena calidad y reemplazar al importado con un poder gelificante de un 40% de él de agar de origen chileno y ligeramente inferior al japonés. Fué obtenido en laminillas transparentes de ligero color pardo grisáceo, insaboro. El método al cual se llegó finalmente luego de ensayar y adaptar los distintos descriptos en la bibliografía representa una extracción de casi 100%. La bibliografía si bien es abundante, es prácticamente de origen Japonés o Americana. Flow sheet del proceso al que se llegó luego de los ensayos citados: (ver diagrama en la tesis).

Se propone en el presenta trabajo encontrar un método para la producción de oxicloruro de cobre que pueda ser aplicado en escala industrial. El oxioloruro de cobre encuentra su principal aplicación en la agricultura, como fungicida en la lucha contra numerosas plagas. Los diferentes fungicidas agrícolas pueden ser clasificados según su composición en tres grandes grupos: 1.-Compuestos metálicos. 2.-Compuestos a base de azufre y polisulfuros. 3.-Compuestos orgánicos. Entre los compuestos metálicos los que tienen mejores propiedades fungicidas son los hechos e base de cobre. Entre ellos se encuentran: el sulfato de cobre en diversos preparados siendo el más conocido el caldo bordelés. El oxicloruro de cobre presenta ventajas con respecto a los restantes fungicidas cúpricos, pues puede ser aplicado directamente por el agricultor sin necesided de preparaciones anteriores su uso previene y combate numerosas enfermedades criptogámicas en especial en la viña, citrus, hortalisas y flores. Los compuestos orgánicos son los más modernos; demuestran tener mayor afectividad en algunos casos que los fungicidas de los grupos 1 y 2, y ninguna en otros, por lo que deben esperarse los resultados de mayor trabajo experimental para opinar en forma definitiva sobre su conveniencia. Oxicloruro de cobre Con el nombre de oxicloruro de cobre se conoce un elevado número de compuestos, unos 21, con la fórmula general: Cl2Cu.nCOCu.mH2O siendo n= 1, 2, 3, 3 1/2, 4, 5 1/2, 6 ú 8. m= 0, 1, 1 1/2, 2, 3, 3 1/2, 4, 4 1/2, 5, 6, 8, 9, 6 o 12 Estado natural Se lo encuentra en las regiones desérticas en diversas formas siendo la de mayor importancia la atacamita, así llamada por haberse encontrado originariamente en la Provincia de Atacama en Chile. Le corresponde la fórmula: Cl2Cu.3OCu.4H20. Al mineral de fórmula: Cl2Cu.3OCu.3H2O se lo conoce con el nombre de paraatacamita. Método de obtención de laboratorio. En general se basan en la acción del oxígeno, los óxidos o los hidróxidos de cobre sobre los cloruros de cobre. Métodos industriales de obtención Según las materias primas utilizadas se clasifican en: 1.- Métodos que parten de minerales de cobre. 2.- Métodos que parten de cobre metálico. 3.- Métodos que utilizan compuestos de cobre y cobre metálico. 4.- Métodos que utilizan compuestos de cobre. El método utilizado en el presente trabajo pertenece al grupo 2 Experiencias realizadas. Como materias primas se utilizaron cobre metálico y ácido clorhídrico, los cuales tienen la ventaja de no presentar inconvenientes para su aprovisionamiento. El método de obtención es sencillo y se basa en la siguiente reacción: 4Cu + 2 O2 + 2 HCl + 2 N2O = Cl2Cu. 30 Cu.3 N2O 254,16g + 64g + 72,92g + 36g =427,08g Relación Cu/HCl = 3,48 El cobre utilizado estaba en forma de virutas. El ácido clorhídrico era el comercial de 21°Bé, densidad: 1,169 y concentración 33,53%. El aire provenía de un compresor. El calentamiento se realizaba al baño maría. Las experiencias se realizaron por triplicado. Se efectuaron una serie de experiencias en distintos aparatos modificándose las condiciones de reacción. Se extrajeron las siguientrs conclusiones: 1.- El rendimiento es máximo cuando se utiliza cobre ya atacado, y en la forma más dividida posible. 2.- El cobre debe estar 100% en exceso de la relación estequeométrica con respecto al ácido clorhídrico. 3.- La concentración de la solución de ácido clorhídrico debe ser de 5%. 4.- La temperatura media: 65°C. Con los resultados de laboratorio se montó una planta piloto donde se realizaron experiencias que ratificaron los resultados ya obtenidos, y donde se observó un notable aumento de rendimiento debido a una mejor distribución del aire introducido en el reactor.

En el presente trabajo de investigación se busca mostrar la posibilidad de producir mullita de alta calidad en Argentina, utilizando materias primas nacionales y comodities internacionales con el objetivo de obtener un material confiable, de excelentes propiedades en el uso y con un costo razonable para ser incorporada en la producción de refractarios. El estudio de la obtención tecnológica de mullita a partir de arcillas y caolines refractarios argentinos, y alúmina calcinada ó alúminas hidratadas, se realizó partiendo de los ensayos de caracterización de las materias primas utilizadas (arcillas, caolines, alúmina calcinada y un hidrato de alúmina), los cuales fueron analizados desde el punto de vista físico-químico, continuó con el estudio de las mezclas (arcilla/caolín con alúmina calcinada/hidratada) en proporciones de estequiometría 3Al₂O₃·2SiO₂ caracterizadas fisicoquímicamente. Posteriormente se realizó un seguimiento a las transformaciones físicoquímicas, termomecánicas y minerológicas llevadas a cabo durante su calcinación a alta temperatura y su estudio cinético. Este último definió la temperatura y tiempo de calcinación a aplicar al proceso final. A posteriori se realizó el conformado de probetas por tres métodos, prensado (a tres presiones distintas), colado y extrusión. Se calcinaron probetas a la temperatura y tiempo definidas en la etapa anterior, caracterizándose fisicoquímica y termomecánicamente. Se establecieron parámetros de semejanza entre las propiedades de las probetas obtenidas por colado ó extrudado, con aquellas provenientes de las prensadas a distintas presiones con el objeto de poseer herramientas científico técnicas en el caso de una producción industrial que permitan decidir un tipo de operación u otro según la disponibilidad de instalaciones de una empresa adoptante; siempre vinculado al tipo de propiedades finales deseadas. Por último en base a los ensayos de caracterización realizados se seleccionó el material obtenido por extrudado, y se efectuó una pequeña producción de mullita a escala con la cual se elaboraron prototipos de refractarios mulliticos, comparándose sus propiedades mecánicas con otros elaborados de igual forma pero con materia prima importada (mullita comercial).

Esta tesis estudia compuestos pertenecientes a dos plantas utilizadas por la medicina tradicional como antiinflamatorias: Isodon xerophilus (C. Y. Wu et H. W. Li) H. Hara perteneciente a la familia Lamiaceae y endémica de la provincia de Yunnan, en China; y Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn. de la familia Cucurbitaceae, que crece en el Amazonas. 4 diterpenoides ent-kauranos: xerophilusin A y B, longikaurin B y xerophilusin F que habían sido aislados previamente a partir de las hojas de I. xerophilus, en esta tesis son evaluados en su capacidad de afectar la activación del factor de transcripción nuclear NF-κB, mediante la utilización de ensayos in vitro, para determinar el potencial antiinflamtorio de estos compuesto. El estudio con C. tayuya consistió en la obtención de una fracción enriquecida en flavonoides a partir de un extracto butanólico previamente obtenido de las raíces de la planta, la identificación de los flavonoides, y la evaluación de la fracción enriquecida en flavonoides mediante ensayos in vivo e in vitro para comprobar el efecto antiinflamatorio y la influencia sobre mediadores y enzimas involucrados en el proceso inflamatorio. Para los estudios in vivo se utilizaron modelos de inflamación aguda y crónica en oreja de ratón inducida por aplicación tópica de TPA. Los experimentos in vitro se realizaron con macrófagos murinos RAW 264.7. La fracción enriquecida en flavonoides fue estudiada en su efecto sobre la producción de NO y TNF-α, y sobre la expresión de iNOS y COX-2. Los cuatro ent-kauranos se investigaron en su capacidad de inhibir la degradación de IκB, la translocación de NF-κB al núcleo, la expresión de iNOS y la producción de NO. Para esto se utilizaron técnicas cromatográficas (TLC, VLC, CC y HPLC) espectroscópicas (UV y NMR), y de biología molecular (WB, ELISA, inmunocitoquímica, RT-PCR, EMSA y gen reportero de luciferasa). Los resultados obtenidos demuestran que la fracción enriquecida en flavonoides manifiesta efecto antiinflamatorio y que este efecto estaría mediado en parte, por inhibición de la expresión de iNOS y COX-2. Y que los 4 ent-kauranos son agentes potencialmente antiinflamatorios mediante un mecanismo que inhibe la activación de NF-κB con la consecuente disminución de los mediadores proinflamatorios implicados.

El ión calcio (Ca2+) es usado por prácticamente todos los tipos celulares para señalizar procesos tan diversos como la fertilización, la comunicación neuronal, la contracción muscular o la muerte celular. La versatilidad de este mensajero se basa en la variedad de patrones espacio-temporales que la concentración intracelular de Ca2+ puede desplegar. Dentro de las células el Ca2+ citosólico libre es mantenido a muy baja concentración. Las señales entonces involucran el ingreso de Ca2+ desde el medio extracelular o su liberación desde reservorios internos. Dentro de este último tipo de procesos, la liberación desde el retículo endoplasmático (RE) a través de receptores (RIP3s) de inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) juega un rol fundamental. En la mayoría de los casos estos receptores están organizados en cúmulos sobre la membrana del RE y pueden abrirse cuando ligan IP3 y Ca2+. El Ca2+ citosólico tiene un rol dual sobre la cinética de los RIP3s llevándolos a su apertura a concentraciones moderadas y a su inhibición a concentraciones altas. Es por esto que el Ca2+ liberado a través de un RIP3 abierto puede inducir la apertura de canales vecinos. Este fenómeno es conocido como liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ (CICR, por su nombre en inglés). En la mayoría de las células los cúmulos de RIP3s están separados por unos pocos micrones. La organización interna de los cúmulos, por otro lado, no es totalmente conocida aunque se supone que puede variar entre situaciones con RIP3s muy empaquetados y otras con mayor separación entre canales. Dado que las características de las se~nales resultantes dependen del CICR, la distribución espacial de RIP3s intra e inter-cúmulo juega un rol fundamental. Es por esto que la obtención y el análisis de imágenes con resolución suficiente para poder inferir cómo ocurre el acoplamiento entre receptores mediado por calcio es clave. Dependiendo del número de receptores o cúmulos que participan de un mismo evento de liberación, las señales de Ca2+ mediadas por RIP3s permanecen localizadas o se transforman en ondas que viajan entre cúmulos, abarcando, eventualmente toda la célula. Las señales localizadas (elementales) mediadas por RIP3s son llamadas blips o puffs según haya uno o varios RIP3s de un cúmulo simultáneamente abiertos. A través del CICR, los puffs de Ca2+ constituyen los ladrillos fundamentales de las señales más globales. La variedad de las señales que pueden surgir entonces dependen de la inter-relación entre la cinética y arreglo espacial de los canales, el nivel de Ca2+ citosólico, la tasa de liberación de Ca2+ y de los mecanismos que lo atrapan o remueven. El objetivo de la Tesis es develar algunas de las propiedades de estos mecanismos y estudiar cómo se afectan unos a otros. En esta tesis combinamos experimentos, su análisis y el desarrollo de modelos matemáticos para obtener un descripción detallada de los distintos aspectos que moldean el acoplamiento entre eventos de Ca2+ elementales. Esto es particularmente importante dado que el proceso desde se~nales locales a globales (o spikes) es clave para la determinación de los intervalos de tiempo entre spikes. Se cree que la información está codificada en la frecuencia de estos spikes. Por lo tanto, nuestro objeto de estudio está directamente implicado en la habilidad del Ca2+ de transmitir el mensaje que transporta. Para estudiar se~nales de Ca2+ mediadas por RIP3s experimentalmente, usamos el ovocito de Xenopus laevis como sistema modelo. Este es un modelo conveniente, entre otras cosas, porque el Ca2+ es liberado desde el RE exclusivamente a través de RIP3s. Los experimentos involucraron la observación de se~nales de Ca2+ usando diferentes indicadores de Ca2+ fluorescentes (citosólicos y luminal), buffers exógenos e IP3 enjaulado que fue fotoliberado dentro de las células para inducir la apertura de los RIP3s. Para monitorear cambios en la uorescencia, usamos microscopía confocal multiespectral y microscopía wide-field. Para el modelado usamos descripciones estocásticas y deterministas dependiendo de los aspectos que intentamos describir. En primer lugar investigamos el tamaño de los eventos de Ca2+ observados en ovocitos inmaduros de Xenopus laevis. La distribución de amplitudes de puffs obtenida no fue gaussiana sino que había una notable fracción de eventos de gran tamaño. La distribución de áreas de puffs mostraba una cola larga y podía ser ajustada con una relación tipo ley de potencias. Este comportamiento tipo ley de potencias se encontró también dentro de un modelo simple que incluía acoplamiento entre se~nales individuales para un amplio rango de valores de los parámetros. Un análisis del modelo mostró que una elevación global de la concentración de Ca2+ era muy importante para determinar si la distribución de tama~no de eventos tenía o no cola larga. Esto nos sugirió que la remoción del Ca2+ del citosol es clave para determinar el tipo de se~nales que podían surgir. Determinamos que cuando el Ca2+ no es removido del citosol a una tasa lo suficientemente alta, la transición del RIP3 de un estado inhibido a un estado activo lleva a una liberación inmediata de Ca2+ y a la propagación de una se~nal de baja intensidad. Investigamos luego el rol del Ca2+ luminal en las se~nales. Mientras que el rol del Ca2+ citosólico ha sido ampliamente estudiado, el rol del Ca2+ luminal en las se~nales de Ca2+ mediadas por RIP3 no ha sido investigado con tanto detalle. Desarrollamos un protocolo original para usar el indicador Fluo-5N AM en ovocitos de Xenopus laevis. Este indicador de Ca2+ había sido usado para sensar Ca2+ luminal en otros tipos celulares pero nunca había sido usado en ovocitos. Combinando el uso del Fluo-5N AM y el de un indicador de Ca2+ citosólico cuya emisión ocurre a una longitud de onda diferente (Rhod-2) seguimos la dinámica del Ca2+ luminal y del Ca2+ citosólico en simultáneo durante las señales. A partir del análisis de estas observaciones, cuantificamos las tasas de liberación y de recaptura del Ca2+ al lumen. Determinamos que la liberación de Ca2+ en el citosol a través de RIP3s abiertos no podía explicar por si misma la dinámica observada en el lumen. Concluimos entonces que existe una fuente virtualmente inagotable de Ca2+ libre luminal que atribuimos a los buffers de Ca2+ luminal que muy rapidamente compensan la depleción de Ca2+ local que la liberación puede eventualmente producir. Esto es diferente al comportamiento observado durante la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático (RS) en miocitos. Atribuimos esta diferencia a la diferencia entre el cociente entre el área y el volumen en ambos tipos celulares. Por lo tanto, concluimos que la geometría no solamente determina la propagación de señales intracelulares de Ca2+ desde el lado citosólico sino también desde su contraparte luminal. Realizamos también experimentos para estudiar y comparar la dinámica espacio-temporal del Ca2+ uminal y citosólico. Para este fin, usamos nuevamente Fluo-5N y Rhod-2 para observar el comportamiento del Ca2+ en ambos reservorios simultáneamente durante una liberación de IP3 prolongada en diferentes regiones. Estos experimentos nos permitieron explorar el acoplamiento entre regiones distantes en cada reservorio. Su análisis sugiere que el Ca2+ citosólico provee el mecanismo de inhibición necesario para terminar las se~nales. De esta forma, el Ca2+ citosólico parece ser el principal mecanismo de acoplamiento entre RIP3s tanto para la propagación inicial de las señales como para el tiempo que tardan los canales en recuperarse y permitir que pueda generarse una nueva onda global. Para estudiar el acoplamiento entre canales entre cúmulos distintos, trabajamos finalmente en un set-up alternativo para observar se~nales de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial. A pesar de que el microscopio confocal provee seccionado óptico y alto contraste, el escaneo de la muestra en esta técnica impone una desventaja temporal. Usando un microscopio wide-field, iluminación LED y una cámara EMCCD obtuvimos una resolución axial de aproximadamente 1 micrón. Usamos este set-up para observar se~nales de Ca2+ mediadas por RIP3s y obtuvimos imágenes 2D con resolución temporal similar a la de las imágenes confocales en modo line-scan (unidimensionales). Este set-up abre la posibilidad de aplicar herramientas de análisis de super-resolución a los puffs de Ca2+ en ovocitos. Este método puede ser usado para detectar se~nales de Ca2+ en 2D con alta resolución temporal y por lo tanto para estudiar el acoplamiento entre unidades de liberación dentro del cúmulo o entre cúmulos distantes.

La fracción flagelar de epimastigotes de la cepa Tulahuén de Trypanosoma cruzi es una subfracción celular heterogénea, conteniendo flagelos y membranas del parásito. En modelos experimentales murinos, la inmunización con fracción flagelar liofilizada y Bordetella pertussis como adyuvante, protege de la infección por T. cruzi en términos de mortalidad y de esterilidad parasitémica ya que un 60% de los ratones desafiados no presentan parasitemia detectable. En este trabajo se presenta la caracterización de componentes antigénicos del estadio epimastigote obtenidos por purificación a partir de un anticuerpo monoclonal anti-fracción flagelar. Dicho anticuerpo monoclonal, FCH-F8-4 (AcMo 4), mostró una interesante actividad biológica contra el Trypanosoma cruzi, ya que evidenció la capacidad de lisar tripomastigotes sanguíneos por medio del complemento y de neutralización in vitro de la infectividad de tripomastigotes. El AcMo 4 reconoce seis proteínas por "inmunoblotting" en epimastigotes y dos proteínas en tripomastigotes. A partir del homogenato total de epimastigotes se purificaron los componentes antigónicos reconocidos por el AcMo 4. Las proteínas aisladas correspondieron al patrón previamente observado para el extracto de epimastigotes original. Cuando se ensayó la capacidad inmunoprotectiva in vivo de estos antígenos purificados, con Bordetella pertussis como adyuvante, se observó que estas proteínas del T. cruzi mantienen las propiedades inmunoprotectoras de la fracción flagelar en cuanto a sobrevida de los animales desafiados y el bajo porcentaje de ratones que presentan parasitemia. Utilizando el AcMo 4 se seleccionaron clones en una biblioteca de ADN copia de epimastigotes de T. cruzi, construída en el vector de expresión λgt 11. Con uno de los clones de ADN recombinante obtenidos λ(FCH-FB-4)1, con un inserto de 150 pares de bases, se ensayó su hibridización al ARNm de epimastigotes. Los estudios realizados mediante la hibridización del clon λ(FCH-F8-4)1 con el ADN del parásito sugirió que esta información genética estaría repetida en el genoma haploide de T. cruzi en un número bajo de copias. El análisis de este clon respecto de su hibridización con diferentes clones y cepas del parásito reveló que este gen se halla ampliamente presente en T. cruzi, siendo el patrón de esta hibridización conservado para los aislados y clones estudiados. A partir de la secuencia de bases del ADN del clon λ(FCH-F8-4)1 y deducida la secuencia de aminoácidos, se sintetizó en fase sólida un péptido de 19 aa:SP4(PAFLGCSSRFSGSFSGVEP). Este péptido inhibió la reactividad de sueros de ratones inmunizados con fracción flagelar, en ensagos de ELISA, utilizando epimastigotes como antígeno. Los ratones inmunizados con el péptido SP4 libre o acoplado a KLH como proteína transportadora, adyuvado siempre con Bordetella pertussis, mostraron una respuesta inmune humoral y celular contra el T. cruzi, demostrada por anticuerpos y reacciones cutáneas de hipersensibilidad retardada específicos. Estos resultados indicaron que la conformación del epitope presente en el péptido sintético representa aquella que se encuentra en el parásito y que a pesar de su pequeño tamaño, el péptido fue capaz de evocar una respuesta inmune, aún inoculado en su forma libre. Un estudio por computacion a partir de la secuencia primaria de aminoácidos, siguiendo un algoritmo previamente descripto, arrojó que el péptido SP4 tiene una estructura anfipática de alfa-hélice que podría representar sitios de reconocimiento para los linfocitos T colaboradores. Otros clones de ADN recombinante, obtenidos de la misma genoteca de ADN copia de la cepa Tulahuén, fueron obtenidos con el AcMo 4 g con sueros de conejo anti-péptido sintético SP4. Dichos clones fueron analizados en cuanto a la secuencia de bases de su ADN, observándose diferencias en algunas bases y aminoácidos que codifican. Se describen aquí dos secuencias de ADN con homología parcial reconocidas por el AcNo 4 y un suero policlonal anti-péptido sintético; pudiendo estas secuencias representar dos copias diferentes dentro del gen que codifica para este antígeno. Los analisis efectuados por hibridización de los diferentes clones de ADN recombinante con el ADN genómico del parásito, sugiere que habría un único gen que codifica para la síntesis de los péptidos que reconoce el AcMo 4 en el genoma del Trypanosoma cruzi.