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Trabajo final de licenciatura

Fil:Morales, Carlo M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Se ha estudiado la obtención, purificación y propiedades de la fumarasa de levadura de panadería. a) Se ha puesto a punto un método de dosaje de la actividad enzimática, independiente de toda consideración sobre la cinética de la reacción. En él se comparan los consumos de fumarato por la muestra de enzima en un tiempo standard (medidos con el método permanganimétrico de Straub), con una curva patrón calibrada en unidades enzimáticas arbitrarias. b) Se han obtenido extractos acelulares de fumarasa por autolisis en fosfato de polvo acetónico de levadura. El proceso de extracción se completa a pH 7 en 5 - 6 días, dando la enzima en forma totalmente soluble, con rendimiento y pureza comparables a los de las mejores preparaciones acelulares obtenidas por desintegración mecánica de la levadura. c) Se han ensayado diversos métodos de purificación en los extractos acelulares: la clarificación inicial con gel de fosfato dc calcio, seguida de un fraccionamiento con sulfato de amonio (0.40 — 0.60 sat.), un fraccionamiento con acetona a pH 7, y dos fraccionamientos con sulfato de amonio a pH 8 y 6, dió una preparación de una pureza 12.5 veces mayor que la inicial. d) La enzima de levadura cataliza la reacción reversible fumarato + H2O <---> L-malato con una constante de equilibrio Kap = (L-malato)/(fumarato) = 3.8, a pH 7 y 30°. Este valor está comprendido entre los hallados para otras fumarasas. e) La actividad sobre el fumarato en ausencia de sales es óptima a pH 6.3; la presencia de fosfatos corre este máximo al alcalino. Los cationes alcalinos y alcalinotérreos no tienen influencia en la reacción de hidratación, los aniones arseniato, fosfato, sulfato y borato son activadores, y los cloruros, bromuros, y nitratos, son inhibidores (el fluoruro es indiferente). Los cloruros además intensifican la inactivación térmica de la enzima, que en su presencia es protegida por el fumarato. La cinética de la reacción de hidratación en presencia de fosfato diluído demuestra un efecto activador del fumarato en concentraciones mayores de 4 mM, que no se observa en fosfato concentrado; éste también aumenta las constantes cinéticas de la reacción, y además resulta inhibidor cuando se pasa de 0.05 M a 0.1 M. Éstos resultados son semejantes a los obtenidos con la fumarasa cristalizada de corazón de cerdo, y el mecanismo desarrollado para ésta da cuenta de aquellos hechos. f) La fumarasa de levadura se diferencia de la enzima de cerdo en su inactivación rápida a pH inferiores a 6, y en su requerimiento de sulfhidrilos libres indispensables para su actividad catalítica: es inhibida por los reactivos para tioles o-iodosobenzoato; 3-melaminilfenilarsenóxido y p-cloromercuribenzoato (el más eficaz); frente al último es reactivada por la cisteína. Los sustratos y el fosfato protegen la enzima frente a los tres reactivos: con el mercurial la protección de los primeros se extiende hasta 10^(-4) M (del orden de la constante de Michaelis) en tanto que el efecto protector del fosfato es pobre. De acuerdo al modelo propuesto, el o los sulfhidrilos se hallarían en el área activa de la enzima que forma el complejo catalítico enzima-sustrato.