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Las bacterias del género Brucella son organismos Gram negativos, patógenos intracelulares facultativos responsables de una zoonosis denominada Brucelosis. La envoltura de Brucella exhibe características únicas que hacen que estas bacterias sean patógenos furtivos y resistentes a compuestos de defensa del hospedador. Brucella se caracteriza por presentar tropismo a diversos tejidos y es capaz de replicar en múltiples tipos celulares. Previo a la invasión la bacteria debe ser capaz de adherirse a la célula hospedadora. Mediante estudios filogenéticos en B. suis 1330 se identificaron diversas proteínas que podrían cumplir una función en la adhesión al hospedador. Dentro de éstas, BmaA y BmaB pertenecen a la familia de autotransportadores (AT) monoméricos. Análisis bioinformáticos de los ortólogos de BmaA y BmaB en los genomas de numerosas cepas de B. suis, Brucella abortus y Brucella melitensis mostraron gran variabilidad. Más aún, BmaA y BmaB serían pseudogenes en varias cepas de B. abortus y B. melitensis, indicando que estas adhesinas contribuirían a la preferencia de hospedador o al tropismo a determinados tejidos. Se demostró que BmaA y BmaB en B. suis son proteínas funcionales que participan en la adhesión a distintos tipos celulares y a componentes de la matriz extracelular del hospedador. Por inmunofluorescencia se observó que BmaB se localiza en el polo nuevo generado luego de la división asimétrica de Brucella, apoyando la hipótesis que en Brucella dicho polo estaría funcionalmente diferenciado para la adhesión. Otro de los candidatos estudiados, denominado MapB, no tuvo función de adhesina, sino que cumpliría un rol crucial en la integridad de la envoltura celular. En efecto, la resistencia típica de Brucella tanto a la lisozima como a polimixina B se redujo marcadamente en la mutante ΔmapB. MapB resultó ser un homólogo lejano de TamB. Esta proteína junto con TamA forman un complejo que participaría en la translocación de ATs a través de la ME. En línea con esta observación, MapB fue requerida para el ensamblaje en la ME de BmaB, ya que la mayor parte del AT se acumuló en el periplasma de ΔmapB. La evaluación de otras proteínas de ME (OMPs) indicó que la ausencia de MapB no condujo a una alteración generalizada de OMPs, sino a una reducción en la abundancia de un subconjunto de OMPs, incluyendo miembros de la familia Omp25/31. Mediante microscopía electrónica se observó que las células ΔmapB presentan anomalías en la morfología celular, lo que indica que la ausencia de MapB altera la división celular. Finalmente, las células ΔmapB mostraron estar comprometidas en la invasión o supervivencia inicial en macrófagos y un fenotipo de virulencia atenuado en el modelo murino. En conjunto, nuestros resultados indican que el rol de MapB no se limita a la translocación e inserción de algunas proteínas en la ME, sino que es esencial para la estabilidad de la ME y participa en la biogénesis de la envoltura celular, un proceso que está inherentemente coordinado con la división celular.

Nota de disertación: Tesis (DCI)--FCEFN-UNC, 1993

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

El avance agrícola hacia regiones de mayor aridez crece en todo el mundo y particularmente en Sudamérica, generando cuestionamientos sobre su viabilidad productiva, sus costos ambientales y beneficios socio-económicos. Ante estos cuestionamientos surge la necesidad de comparar los principales sistemas agrícolas semiáridos y las alternativas predominantes de uso del territorio, considerando múltiples perspectivas que abarquen sucesivamente el plano ecológico, agronómico, económico y social. A escala de lote, compromisos biológicos entre la capacidad de tolerar la aridez y sostener altas productividades sugieren la existencia de rangos óptimos en gradientes de lluvia, en los que sucesivamente resultan ventajosos los cultivos anuales, las pasturas perennes y la vegetación natural. Se exploraron los resultados para los principales usos (forestal, ganadero y agrícola) y coberturas (bosque, pasturas C4, maíz, soja y trigo) del Chaco y Espinal semiárido (900 a 400 mm y 14 a 25 °C). El cultivo de maíz duplicó la producción de biomasa y alimento de las demás coberturas en todo el gradiente ambiental. Así, la elección del tipo de cultivo excedería el efecto del tipo de uso definiendo estos dos atributos ecológicos y agronómicos fundamentales. Menores costos de transporte y semilla o su transformación local revertirían su menor renta respecto a la soja, que actualmente prevalece por su mayor precio a pesar de su menor productividad. El rinde y la renta del uso forestal tradicional de la vegetación natural resultó extremadamente bajo, incluso maximizando la cosecha de madera y su precio, dificultando su conservación. Disminuir esta brecha demandaría mecanizar eficientemente usos alternativos compatibles con el bosque, como silvopastura o cosecha de bioenergía. Notablemente, no existió un nicho óptimo para cultivos en el extremo húmedo ni para pasturas en el árido, respecto a su adaptación, productividad e impacto ecológico. Por ende, maximizar la actividad fotosintética, transpiración y conservación de servicios del ecosistema, requeriría estrategias mixtas que combinen y alternen cultivos de renta con otros de cobertura y pasturas con especies leñosas. A escala regional, las complejas interacciones entre estrategias productivas y de distribución de recursos, sugieren una vinculación no lineal entre los factores sucesivos que contribuyen al bienestar humano. Se compararon dos fronteras agrícolas del Chaco semiárido, biofísicamente similares pero con desarrollos contrastantes (actores locales organizados vs inversores externos). El beneficio socio-económico del ahorro en transporte y agregado de valor mediante agroindustria local excedió el de maximizar el rinde o renta a escala de parcela, potenciando usos ecológicamente menos disruptivos. El rol clave de la capacidad de organización y gestión en el desarrollo cuestiona enfoques netamente agronómicos que no incorporan aspectos político-organizativos a los objetivos principales de intervención e investigación.

La cebada (Hordeum vulgare L.) y el trigo (Triticum aestivum L.) son dos de los cereales de invierno más importantes, tanto a nivel mundial como en la Argentina. Por otra parte, la enfermedad conocida como fusariosis de la espiga es una de las principales enfermedades de los cultivos mencionados, ocurriendo en todas las regiones cerealeras del mundo, causando daños cuantitativos, cualitativos y económicos. Actualmente, en la Argentina y en gran parte del mundo, se ha reportado que los principales agentes etiológicos de esta enfermedad son Fusarium graminearum y Fusarium poae, productores de micotoxinas tales como deoxinivalenol, sus derivados acetilados, y nivalenol, respectivamente. Con respecto a las condiciones ambientales, numerosos estudios proyectan que las mismas variarán en un futuro cercano y que la temperatura será una de las variables más afectadas por el cambio climático. Como consecuencia, esto no traería solamente aparejado problemas de variación en los rendimientos, sino un posible aumento en el riesgo de presencia de micotoxinas. Sin embargo, se desconoce cómo afectarán estos cambios la diversidad de cada especie fúngica en particular, siendo el potencial impacto del cambio climático sobre la productividad agrícola aún incierto.Considerando los antecedentes mencionados previamente, el objetivo general del presente trabajo fue estudiar el efecto de la interacción entre F. graminearum y F. poae (especies de Fusarium con mayor prevalencia e interés agroalimenticio) en los dos cereales de invierno con mayor superficie sembrada en la Argentina (cebada y trigo), bajo condiciones de temperatura actuales y proyectadas a futuro. Para ello, se plantearon las siguientes hipótesis: (i) la interacción de los distintos genotipos de cebada y trigo con F. graminearum y F. poae se encuentra relacionada al genotipo y a la especie de Fusarium inoculada, siendo ésta significativamente mayor cuando los patógenos se inoculan de manera conjunta; (ii) el aumento de la temperatura nocturna favorece la colonización y producción de toxinas de Fusarium. Con este fin, en el presente trabajo se evaluó: (i) la interacción entre F. graminearum/F. poae en cebada/trigo, durante tres campañas agrícolas (2014/2015, 2015/2016 y 2016/2017) y bajo condiciones experimentales a campo; (ii) el potencial impacto del aumento de las temperaturas nocturnas (3°C) sobre la interacción F. graminearum/F. poae en cebada/trigo, durante tres campañas agrícolas (2016/2017, 2017/2018 y 2018/2019) y bajo condiciones experimentales a campo. En ambos casos, se evaluó el potencial impacto de cada patógeno sobre parámetros de patogenicidad, rendimiento, calidad de grano y contaminación con micotoxinas.En primer lugar, los resultados obtenidos con respecto a la patogenicidad en ambos cultivos, sugieren que no existieron diferencias significativas que sustenten el sinergismo entre F. graminearum y F. poae. En cuanto al genotipo, se reportaron diferentes comportamientos con respecto a la infección por Fusarium y su impacto en variables de rendimiento y calidad, que podrían ser útiles para la20mejora genética en el futuro. Además, se observaron diferencias significativas en la degradación de las diferentes fracciones proteicas evaluadas , dependiendo de cada especie de Fusarium. Con respecto a la contaminación con micotoxinas, en ambos cultivos se registraron concentraciones de DON y 3-ADON por encima de los límites de tolerancia, aunque estas diferencias no fueron significativas, y por ende, no evidenciaron sinergismo en la producción de micotoxinas. Por lo tanto, según lo descripto anteriormente, la hipótesis (i) fue rechazada.En cuanto a los experimentos llevados a cabo bajo condiciones proyectadas de cambio climático, los resultados obtenidos en ambos cultivos mostraron que el aumento de la temperatura nocturna (3°C) favoreció el desarrollo de F. graminearum, incrementando los valores de patogenicidad significativamente tanto en cebada (2-6%) como en trigo (15-17%). Además, durante los años en los cuales las condiciones ambientales fueron favorables para el desarrollo de la enfermedad, el aumento de la temperatura nocturna impactó negativamente disminuyendo el peso de mil granos, tanto para F. graminearum (4,6-5,6%) como para F. poae (0,4-5,2%) en cebada. Por otra parte, si bien el objetivo del presente trabajo no fue evaluar el impacto de las temperaturas nocturnas per se, se registraron disminuciones significativas en cuanto al calibre de los granos (cebada) y a la composición proteica (trigo). Respecto a la contaminación con micotoxinas, el impacto del calentamiento nocturno incrementó significativamente la concentración de micotoxinas tales como DON (75,7%) y 3-ADON (68,3%) en trigo. Por ende, de acuerdo con las evidencias expuestas anteriormente, la hipótesis (ii) fue aceptada.Los resultados obtenidos a lo largo del presente trabajo, aportan conocimientos novedosos y promisiorios en lo que respecta a la interacción F. graminearum/F. poae-cebada/trigo bajo condiciones climáticas actuales y futuras. Además, los resultados obtenidos establecen las bases para potenciales investigaciones futuras, principalmente en lo que respecta a estudios de cambio climático, bajo condiciones de campo. Es de destacar, que un mejor entendimiento del patosistema Fusarium-cebada/trigo en lo que respecta a parámetros de patogenicidad, rendimiento, composición proteica y contaminación con micotoxinas, posibilitará estimar el potencial impacto de esta enfermedad sobre la calidad maltera y panadera de los granos. Sin embargo, un monitoreo constante a lo largo de toda la cadena productiva (desde la cosecha, transporte y almacenamiento de los granos) es considerado necesario, con el fin de asegurar la inocuidad y seguridad alimentaria.

La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa de motoneuronas. Se encuentra mayormente asociada a una forma esporádica de etiología desconocida. Numerosas evidencias favorecen a la auto-inmunidad como uno de los potenciales contribuyentes a esta patología. Para estudiar los posibles antígenos que interactúan con las IgGs de pacientes con ELA esporádica (IgGs-ELA), evaluamos su inmuno-reactividad hacia la placa neuromuscular (PNM), comparando animales normales con aquellos carentes de la subunidad formadora del poro del canal de calcio (Ca2+) de tipo P/Q (CaV2.1). Las IgGs-ELA mostraron una importante reactividad hacia la PNM de ratones CaV2.1+/+ e incrementaron la frecuencia de potenciales de placa miniatura (MEPPs). Ambos parámetros disminuyeron significativamente al evaluar tejido de animales CaV2.1-/-. Ensayos de inmuno-precipitación y western blot indican que el blanco de los anticuerpos no sería el canal mismo sino una proteína asociada. Estudios de proteómica sugieren a la proteína BASP-1 (proteína ácida soluble de cerebro-1) como un candidato a evaluar en forma más detallada en fututos ensayos. Nuestros resultados adicionan evidencias a favor de la auto-inmunidad como uno de los posibles mecanismos contribuyentes a la patología de ELA. También sugieren que los auto-anticuerpos en el suero de una serie de pacientes interactúan con proteínas cuya presencia en la PNM disminuye cuando los canales de Ca2+ de tipo P/Q se encuentran ausentes.

El objetivo de este trabajo de tesis fue el estudio a nivel molecular de la interacción de la melatonina (N-acetil-S-metoxitriptamina) con dos radicales libres de relevancia biológica, el radical oxhidrilo (OH·) y el óxido nítrico (NO). Para el desarrollo del presente trabajo se analizaron estas interacciones químicas desde un enfoque teórico, mediante técnicas de simulación computacional, desde un enfoque experimental, a través del estudio de las mismas en condiciones aisladas y controladas, y a través de la evaluación de los alcances fisiológicos de las reacciones propuestas. Para evaluar las interacciones con los diferentes blancos se analizó, en primer término, la superficie de energía potencial de la melatonina mediante técnicas de dinámica molécular basadas en campos de fuerzas clásicos y métodos semiempíricos. Se prestó especial atención a los aspectos relacionados con su libertad conformacional en vacío y en solución acuosa. Asimismo, se analizó la dependencia de las propiedades moleculares con la conformación. La reacción con el radical oxhidrilo se estudió mediante técnicas de estructura electrónica, evaluando los posibles mecanismos de reacción y realizando una exhaustiva caracterización de los intermediarios. El estudio de la interacción con NO se puede dividir en dos partes: i) la identificación y caracterización de los productos de reacción y la elucidación de los mecanismos operantes en diversos medios; y ii) el estudio del efecto de la melatonina sobre la biosíntesis de NO en la retina de hámster. Finalmente, mediante el uso de técnicas de resonancia magnética nuclear y de dinámica molecular, se realizó un estudio detallado de la interacción entre la melatonina y la calmodulina, una proteína con probado efecto estimulatorio en la biosíntesis del NO.

La regulación de la expresión génica mediada por proteínas quinasas es esencial para la correcta adaptación celular frente a un estímulo extracelular. En S. cerevisiae, la PKA está formada por tres subunidades catalíticas: Tpk1, Tpk2 y Tpk3 y una subunidad regulatoria: Bcy1. Existen antecedentes que indican la asociación de Tpk1 y Tpk2 a la cromatina durante el crecimiento en glucosa, glicerol y estrés oxidativo (Pokholok et al, 2006). El rol de la vía cAMP/PKA sobre la expresión génica en glucosa ha sido ampliamente estudiado (Livas et al, 2011). Por otro lado, se ha descripto, que la activación de la PKA limita la expresión de genes de respuesta a estrés (Leadsham et al, 2010; Ferretti et al, 2012). Durante el desarrollo de esta tesis analizamos la unión de Bcy1, Tpk1 y Tpk2 a diferentes regiones génicas en respuesta a estrés osmótico y oxidativo. Describimos que tanto las subunidades catalíticas como la subunidad regulatoria de la PKA se encuentran asociadas tanto a regiones transcriptas como a promotores de los genes blancos de manera estrés-dependiente. Además analizamos el requerimiento de la actividad quinasa y el papel de Bcy1 en la asociación de las Tpks a la cromatina. Versiones inactivas de Tpk1 y Tpk2 no se asociaron a la cromatina. La deleción de Bcy1 promueve una mayor asociación de Tpk1, mientras que anuló la asociación de Tpk2. Luego analizamos el posible rol de las Tpk en el remodelado de la cromatina en respuesta a estrés a través del análisis de la cinética de unión de factores remodeladores de la cromatina a las regiones donde encontramos asociadas a Tpk1 y Tpk2. Observamos unión transitoria a la cromatina de Arp8, Rsc1 y Snf2 seguido temporalmente por la asociación de las Tpk. Observamos también, la ocupación concomitante de Tpk2 y el factor de transcripción de unión al DNA Rap1. En conjunto los datos existentes y los resultados obtenidos en esta tesis sugieren que la PKA podría participar en la expresión génica mediante fosforilación in situ de los reguladores transcripcionales o de la cromatina. La distribución núcleo-citoplasmática permite regular la actividad diferencial de muchas proteínas quinasas. Hemos analizado la localización subcelular de las subunidades de PKA y su mecanismo de transporte durante estrés. Hemos observado que Tpk1-GFP y Tpk3-GFP acumulan en el núcleo post-estrés oxidativo y osmótico, sin embargo Tpk2- GFP y Bcy1-GFP no cambian su acumulación nuclear. El análisis cinético de la acumulación nuclear de Tpk1 mostró mayor velocidad en respuesta a estrés osmótico versus oxidativo. Hemos determinado que la acumulación nuclear de Tpk1, Tpk2, Tpk3 y Bcy1 es un mecanismo de transporte activo. Sorprendentemente, cada una de las subunidades de PKA es importada al núcleo por diferentes carioferinas. Por otra parte, las cepas defectivas en carioferinas las cuales impiden la acumulación nuclear específicamente de Tpk1 o Tpk2 no mostraron asociación a la cromatina las Tpks, lo que sugiere el requerimiento de acumulación nuclear de las subunidades catalíticas para la asociación a sus genes blancos.

El objetivo general del presente trabajo fue evaluar la tolerancia de Lactobacillus kefir a plomo, cadmio, zinc y níquel y su rol como biosorbente de dichos metales pesados a nivel molecular.

DCL1 es la enzima ribonucleasa central en la biogénesis de micro-ARNs en plantas. Su función consiste en realizar dos cortes sucesivos sobre transcriptos primarios para liberar el micro-ARN maduro. El mecanismo a través del cual la enzima reconoce los sitios de corte sobre los precursores resta ser elucidado. La enzima presenta dos dominios de unión a ARN doble hebra en tándem en el extremo carboxilo-terminal, los cuales son esenciales para su funcionamiento in vivo. En este trabajo de tesis nos dedicamos principalmente a la descripción biofísica del primero de los dominios de unión a ARN doble hebra de DCL1 de Arabidopsis thaliana, el cual se encuentra altamente conservado entre las distintas especies de plantas. Demostramos que el dominio libre en solución de encuentra desestructurado tanto en forma aislada como en presencia de regiones vecinas de la proteína. A pesar de estar desestructurado, es capaz de unir ARN sustrato. Mediante el análisis estructural del complejo con el ARN encontramos que el dominio adquiere una conformación plegada al entrar en contacto con el sustrato. La topología de la conformación plegada adquirida, que calculamos en base a datos de RMN, se corresponde con la esperada para un dominio de la familia de los dominios de unión a ARN doble hebra. Una vez definidas las características de este sistema procedimos a realizar, por un lado, una descripción más profunda de la forma libre desestructurada y, por otro, proponer un mecanismo posible para la unión al sustrato y plegamiento de la proteína. De la forma libre podemos decir que globalmente es una especie flexible, aunque no se encuentra completamente desestructurada. A través de distintos observables de RMN logramos determinar que la región correspondiente al extremo carboxilo-terminal presenta una cierta rigidez y explora conformaciones tipo hélice alfa. La presencia de esta estructura preformada podría resultar esencial para la unión al sustrato y el plegamiento. En cuanto al mecanismo de unión y plegamiento pudimos obtener evidencia que sugiere la existencia de un complejo intermediario entre la forma libre desplegada y la forma plegada unida al ARN. En este complejo intermediario la proteína se encuentra en una tercer especie, también mayormente desplegada y unida al sustrato. Finalmente en una tercera etapa del trabajo nos abocamos al estudio desde el punto de vista estructural de precursores completos de micro-ARNs. Buscamos validar los determinantes que permiten reconocer la posición del micro-ARN dentro del precursor por parte del complejo de procesamiento formado por DCL1 y las proteínas accesorias HYL1 y SERRATE. Estudiamos cuatro precursores de diferentes familias por técnicas bioquímicas de sondeo de estructura secundaria y flexibilidad de la cadena. Logramos validar experimentalmente determinantes estructurales propuestos a partir de estructuras calculadas in silico. También encontramos indicios que sugieren que la posición del sitio del primer corte, el cual es fundamental para definir el registro de los cortes sucesivos ejecutados por DCL1, podría estar relacionada con un cambio abrupto desde una región de la hebra con una conformación flexible a una de menor flexibilidad. Esta particularidad podría estar permitiendo una interacción específica con las proteínas que conforman el complejo de procesamiento.