El presente trabajo tuvo por objeto el estudio de heparán sulfatos de grado de sulfatación comparables a Heparina y la modificación química de heparán sulfatos de mucosa intestinal bovina. El conocimiento de las diferencias estructurales entre heparán sulfato y heparina sirvieron de guia para las transformaciones realizadas sobre heparán sulfato con el fin de obtener productos de mayor actividad anticoagulante. En él se presentan: a) una descripción de la estructura y distribución de los glicosaminoglicuronanos presentes en vertebrados superiores, con especial referencia a heparán sulfato y heparina; b) una descripción de los estudios estructurales sobre heparán sulfatos, con especial referencia a los métodos degradativos de la cadena glicosídica que brindan información sobre secuencia de residuos con diferente grado y posiciones de sulfatación; c) una descripción de los estudios biosintéticos y de actividad biológica de heparán sulfato, con especial referencia a similitudes y diferencias con heparina, el otro glucosaminoglicuronano N-sulfatado presente en la naturaleza; d) una descripción de las modificaciones químicas de glucosaminoglicuronanos y oligosacáridos relacionados, con especial referencia al impacto del cambio de estructura en la actividad biológica; e) una descripción detallada y discusión de los resultados obtenidos: 1. Glicosaminoqlicuronanos de tejidos de rata Se aislaron dos polisacáridos altamente sulfatados (L1, PM 16.000 y L2, PM 11.700) de tejidos de hígado de rata, que fueron purificados por cromatografía en DEAE-celulosa. Se aislaron heparán sulfatos de tejidos de corazón y pulmón para comparación, que fueron fraccionados por cromatografía en geles de acuerdo a su peso molecular (C1, PM 35.500; C2, PM 15.500; C3, PM 8.300; C4, PM 4.700; C5, PM 2.800; Pl, PM 33.900; P2, PM 14.500; P3, PM 5.400). Se procedió a la extracción del heparán sulfato de hígado de rata en su forma nativa, es decir como proteoglicano, con clorhidrato de guanidinio. Después de purificar el extracto por cromatografía se aisló un único proteoglicano, a partir del cual se liberaron L1 y L2 por tratamiento alcalino. Se determinaron las actividades anticoagulantes in Vitro usando ensayos de coagulación (anti factor IIa, anti factor Xa, APTT), que resultaron acotadas a un rango estrecho (5 a 44 UI/mg) a pesar de la amplia variabilidad de Peso Molecular y grado de sulfatación. Las actividades anti Xa observadas para L1, P1 y C4 no fueron neutralizadas por adición de sulfato de protamina. La caracterización de L1 y L2 (relación sulfato/disacárido 2,05 y 2,48 respectivamente) como heparán sulfatos altamente sulfatados y no como heparinas de baja actividad anticoagulante fue realizada en base a los siguientes estudios: i) análisis de componentes de L1 y L2: se cuantificaron urónicos (32,8 y 34,1%), hexosaminas (21,0 y 21,1%), sulfato total (19,2 y 23,3%), hexosaminas N-sulfatadas (9,8 y 13,2%) y la relación idurónico/glucurónico (27:73 y 38:62, respectivamente). ii) degradación con ácido nitroso de L1 y L2: el perfil de N-sustitución se analizó por degradación con ácido nitroso a pH 1,5 y los oligosacáridos resultantes se cromatografiaron en Biogel P2. Las glucosaminas N-sulfatadas y N-acetiladas en L1 y L2 están segregadas formando regiones ricas en N-sulfato y regiones con alto contenido en N-acetilos consecutivos. iii) estudios enzimáticos: L1 y L2 no sufren degradación por tratamiento con condroitinasa ABC y heparinasa. iv) comportamiento electroforético: se analizaron por electroforesis discontinua en placa de agarosa, en acetato de bario/1,3-diaminopropano, sistema que permite diferenciar condroitín sulfato y dermatán sulfato, heparán sulfato y heparina, no distinguibles en otros sistemas; L1 y L2 presentaron la misma movilidad que un heparán sulfato testigo, y distinta a la de una heparina. v) estudios de metilación: se extendió la aplicación del método de metilación que utiliza butillitio en la generación del alcóxido, a polisacáridos sulfatados. Se procedió al estudio por este método de heparina, heparán sulfato de mucosa bovina y L1. Las conclusiones más significativas son: — ausencia de glucosamina 3,6-di-O-sulfatada en L1; este residuo está presente en el oligosacárido del sitio de unión de heparina a antitrombina III y fue detectado sólo en heparina, — presencia de glucurónico 2-O-sulfatado en L1, componente inusual en glucosaminoglicuronanos y que no fue detectado en los estudios comparativos realizados con heparina y heparán sulfato de mucosa bovina. vi) Resonancia Magnética Nuclear de 13C: se realizó el análisis estructural de L1 por R.M.N. de 13C, registrándose en las mismas condiciones los espectros de heparina, heparina N- y O-desulfatada y heparán sulfato de mucosa bovina para un análisis comparativo de los mismos; en la región anomérica se observan señales correspondientes a los C-l de glucosamina N-sulfatada y N-acetilada, idurónico 2-O-sulfatado y glucurónico; se comprueba la presencia de glucurónico 2-O-sulfatado por la señal a 103,0 ppm; se establecieron las siguientes relaciones: N-Ac/N-Sulfato 56:44; 6-0H/6-O-sulfato 54:46. vii) actividades anticoagulantes: L1 y L2 presentaron baja actividad en el ensayo APTT (14 y 44 UI/mg, respectivamente); en ambos casos la actividad anti Xa resultó mayor que la actividad anti IIa; la actividad anti Xa de L1 no fue neutralizada totalmente por la adición de sulfato de protamina. 2. Modificaciones químicas de heparán sulfatos Se aisló heparán sulfato de mucosa bovina por precipitación fraccionada y por cromatografía de intercambio iónico a partir de una mezcla de subproductos de extracción de heparina; se caracterizó por electroforesis en placa de agarosa, espectro de R.M.N. de 13C, metilación con BuLi/MeI, perfil de degradación con ácido nitroso, análisis de componentesy actividad anticoagulante. Este heparán sulfato se utilizó como material de partida para las modificaciones químicas. Se realizaron seis modificaciones químicas diferentes que se analizaron por métodos químicos y/o espectroscópicos: i) O-sulfatación de heparán sulfato: se utilizaron tres condiciones diferentes: 1. sal de trietilamonio / N,N—dimetilformamida / trióxido de azufre-trietilamina; 2. sal de piridinio / dimetilsulfóxido / trióxido de azufre-trietilamina; 3. sal de piridinio / N,N-dimetilformamida-dimetilsulfóxido (5:1) / trióxido de azufre-trietilamina. En todos los casos se observó un nivel variable de N-desulfatación (por R.M.N. de 13C), que es menor en el método 3. La posición 6 de glucosamina resultó la más reactiva, seguida por la posición 2 de los ácidos urónicos. ii) N-desacetilación/N-sulfatación: la desacetilación se llevó a cabo por hidrazinólisis y se N-sulfató con trióxido de azufre-trietilamina en carbonato de sodio. Esta secuencia permitió aumentar la relación N-sulfato/N-acetilo de 0,6:1 a 2:1 y la actividad anticoagulante de 8,3 a 25,6 UI/mg. iii) O-carboximetilación de HS: Las condiciones de carboximetilación (ácido monocloroacético en hidróxido de sodio) no resultaron efectivas sobre el polímero tal cual. La reducción previa de los grupos carboxilo permitió la introducción de 1,15 grupos carboximetilo por disacárido. El producto se analizó por metanólisis —acetilación seguida de cromatografía gas líquido — espectrometria de masas, caracterizándose 6-O-carboximetilhexosa y 6-O-carboximetilhexosamina. iv) oxidación con periodato de sodio / reducción / sulfatación: la oxidación de un 20 %de los ácidos urónicos de HS, la reducción de los grupos aldehido a alcohol y la sulfatación posterior dio un producto altamente sulfatado que presentó una mayor actividad anticoagulante. Es importante señalar que este producto de cadena abierta es reconocido como sustrato por heparinasa, enzima especifica para ácido L-idurónico 2-O-sulfatado. v) preparación de un derivado fluorescente: por aminación reductiva con 2-aminopiridina / cianoborohidruro de sodio sobre los grupos aldehido generados en la oxidación con periodato de heparán sulfato, se obtuvo un derivado fluorescente. El producto contiene 0,5 grupos fluorescentes por urónico oxidado. La eliminación alcalina del producto fue seguida por fluorescencia de los fragmentos obtenidos. vi) reacción con ácido acetilsalicilico: a través del cloruro del ácido se preparó un derivado de heparina de bajo peso molecular que contiene unidades de acetilsalicilico acilando los nitrógenos de las unidades de glucosamina, según se desprende del análisis del espectro de carbono 13 y del perfil de degradación con ácido nitroso. El producto presentó una actividad de 102,0 UI/mg (APTT). Este producto constituye el primer conjugado heparina-acetilsalicilico que se prepara. f) una descripción de las técnicas experimentales utilizadas.