Catálogo de publicaciones

Fil:Padula, Paula Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Mentaberry, Alejandro Néstor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Como contribución al estudio del rol de los N-glicanos en la fertilización de mamíferos, estudiamos su presencia en la superficie del espermatozoide humano normal y en plasma seminal bovino. Usando lectinas específicas fluorescentes como sondas moleculares localizamos los dominios de glicoproteínas conteniendo oligosacáridos oligomanosídicos, híbridos y complejos en el espermatozoide humano. Con neoglicoproteínas demostramos que los receptores especificos para manosa, fucosa y galactosa, localizan respectivamente en las zonas de dichas glicoproteínas. Esto concuerda con la complementariedad molecular de la interacción espermatozoide-zona (por receptores de doble unión). Por cromatografía lectina-agarosa, demostramos la presencia de glicoproteínas conteniendo oligosacáridos oligomanosídicos, híbridos y complejos en plasma seminal bovino. Aislamos en microescala las proteínas BSP, demostramos que éstas y aSFP, participan (quizás junto con lípidos) en la modulación de la actividad "in vitro" de las proteasas espermáticas. Dicha actividad es incrementada cuando los oligosacáridos fucosilados conteniendo el antígeno Lex está presente. Además cada BSP sola es menos activa que el conjunto de ellas sugiriendo que potenciarían su actividad por efecto sinérgico. Dado que las BSP unen a lípidos, sugerimos que la modulación de la capacitación y reacción acrosomal por parte de las BSP (BSP-HDL)estaría relacionada con la actividad inhibitoriade proteasas acrosomales.

La N-glicosilación de proteínas comienza en la mayoría de las células eucariotes por la transferencia en bloque al resto amida de una asparagina, de un oligosacárido de composición Glc3Mar9GlcNAc2, preformado sobre dolicol-P-P. La enzima responsable se denomina oligosacariltransferasa y fue estudiada en numerosos sistemas. Se constató que existe una secuencia aminoacídica consenso para la glicosilación (Asn-Xaa-Ser/Thr), y una señal en el oligosacarido: la presencia de los tres residuos glucosa, para efectuar la transferencia. Una vez transferido a proteínas, el oligosacárido sufre una serie de modificaciones (por sustracción y adición de unidades sacarídicas y no sacarídicas) que en conjunto se denominan procesamiento. Los oligosacáridos adquieren distintas composiciones finales, según las cuales se denomina, a los que están en celulas de mamífero, tipo polimanosa, tipo complejo o tipo híbrido. Trypanosomatidae es una familia de protozoarios parásitos, algunos de los cuales producen enfermedades en el hombre y en el ganado. El agente causal de mal de Chagas, el Trypanosoma cruzi, pertenece a esta familia. El estudio de la N-glicosilación "in vivo" de proteínas en tripanosomátidos demostró que estos son los únicos eucariotes tipo salvaje, capaces de sintetizar sobre dolico-P-P y transferir a proteínas oligosacáridos no glucosilados. Además, en algunos estadíos, T. cruzi es capaz de transferir simultáneamente dos oligosacáridos diferentes. Se ha estudiado el procesamiento en organismos de la familia Trypanosomatidae y se han encontrado características comunes a otros eucariotes (reacciones de demanosilación y glucosilación transitoria). Se observó además adición de residuos galactosa en configuración furanósica, en extremos no reductores de oligosacáridos tipo polimanosa. Se estudió la especificidad de la oligosacariltransferasa de tripanosomátidos "in vitro", frente a sustratos oligosacarídicos de diferente composición, y se la comparó con la de mamíferos y hongos. Por otro lado se estudió 1a estructura de varios oligosacáridos conteniendo residuos galactofuranosa existentes en glicoproteínas de Leptomonas samueli. Resultados: - Se diseñó un sistema de ensayo "in vitro" que permite estudiar la especificidad de la oligosacariltransferasa frente al sustrato oligosacarídico. Este ensayo contiene como sustrato dador una serie de oligosacáridos radioactivos (de diferente tamaño: Glc3-1Man9GlcNAc2 y Man9-7GlcNAc2) unidos a dolicol-P-P y un péptido sintético aceptor con la secuencia consenso de glicosilación. — La oligosacariltransferasa de hígado de rata y de Saccharomyces cerevisiae demostraron en este sistema tener la misma especificidad por el sustrato oligosacarídico ya conocida anteriormente, es decir transfieren preferentemente Glc3Man9GlcNAc2. - La actividad de transferasa de T. cruzi (parásito digenético que "in vivo" transfiere Man9GlcNAc2), fue inespecífica respecto del sustrato, transfiriendo todos los oligosacáridos presentes en el mismo a la misma velocidad. - Los tripanosomátidos monogenéticos Leptomonas samueli, Crithidia fasciculata y Blastocrithidia culicis, "in vivo" sintetizan y transfieren a proteinas oligosacaridos no glucosilados y con nueve, siete y seis unidades de manosa respectivamente. Membranas de éstos parásitos con actividad de oligosacariltransferasa fueron capaces de transferir con este sistema tanto unidades no glucosiladas como las glucosiladas, (con las cuales fisiológicamente nunca se encuentran), con la misma eficiencia. Por lo tanto se concluye que la oligosacariltransferasa de tripanosomátidos difiere de la de todos los demás eucariotes en que no presenta especificidad frente al sustrato oligosacarídico (y por lo tanto no requiere la presencia de residuos de glucosa en el oligosacárido para catalizar una transferencia eficaz). - Células de teratocarcinoma de ratón, transfieren "in vivo" a proteínas los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 y Man7GlcNAc2. "In vitro", membranas de estas células fueron capaces de transferir preferentemente Glc3Man9GlcNAc2, igual que la enzima normal de mamíferos, constatando que la inespecificidad frente al sustrato oligosacarídico es una característica exclusiva de la familia Trypanosomatidae. Esto sugiere la posible modulación "in vivo" de la especificidad de la oligosacariltransferasa de células de teratocarcinoma por factores desconocidos. - La síntesis y transferencia a proteínas de unidades no glucosiladas en L. samueli, se debe a, por lo menos, la incapacidad de estas cédulas de sintetizar dolicol-P-Glc, el dador de glucosa en el ciclo del dolicol de otros eucariotes. - El procesamiento de oligosacáridos en proteínas de L. samueli involucra la demanosilación parcial de la unidad transferida (Man9GlcNAc2) y el agregado de residuos galactofuranosa. - Se describen las estructuras de varios ofigosacáridos tipo polimanosa que contienen o no residuos galactofuranosa, presentes en glicoproteínas de L. samueli. - A diferencia de lo observado en C. fasciculata, el oligosacárido originalmente transferido sufre una elongación por agregado de restos galactofuranosa. - Durante el curso del presente trabajo se ha desarrollado un método de conservación de éstos parásitos a -70°C, que se ha utflizado con éxito con todas las cepas monogenéticas del laboratorio.

Los glicales, éteres vinílicos polihidroxilados, se han empleado frecuente- mente en la síntesis de azúcares modificados y de una gran variedad de otros productos naturales, debido a la versatilidad que les confiere la función enol-éter y por tratarse además de moléculas con varios centros quirales. En el presente trabajo de Tesis se han estudiado reacciones de glicosidación con nucleófilos oxigenados (alcoholes) o nitrogenados (bases pirimidínicas) de derivados acilados de un tipo particular de glicales sustituidos en C-2: 2-aciloxiglicales acilados. La presencia del sustituyente aciloxi en C-2 modifica la reactividad respecto de los análogos no sustituidos. Los derivados acilados de 2-aciloxiglicales se prepararon modificando el procedimiento descripto en la literatura. Por tratamiento de los bromuros de glicosilo peracilados con 1,8-diazobiciclo |5.4.0|undec-7-eno (DBU) en 1,2-dicloroetano se obtuvieron los derivados de 2-aciloxiglicales de configuración D-arabino | 3,4,6- trin-O-acetil-2-acetoxi-D-glucal (2b) y 3,4,6-tri-O-benzoil—2-benzoiloxi-D-glucal (11)|, D-lixo | 3,4,6-tri-O-aceti1-2-acetoxi-D-galactal (49) y 3,4,6-tri-O-benzoil-2- benzoiloxi-D-galactal (97)| y 6-desoxi-L-lixo |2,4-di-0-acetil-2-acetoxi-L-fucal (96)| con excelentes rendimientos. Los glicales 96 y 97 no habían sido descriptos en la literatura. Se estudió primeramente la reacción de los 2-aciloxiglicales acetilados con alcoholes en presencia de N-iodosuccinimida (NIS). Así, a partir de 2b y un alcohol primario, en acetonitrilo y en presencia de NIS, se observaba por cromatografía en capa delgada, la formación rápida de un producto de mayor movilidad. Se optimizaron las condiciones de reacción (solvente, concentración de NIS, concentración de alcohol configuración del glical, etc.). Se observó que los alcoholes secundarios y terciarios también reaccionaban, aunque estos últimos más lentamente. Al extender la reacción a escala preparativa, usando cantidades equimolares de NIS y del glical 2b, y un ligero exceso de 2-propanol se obtuvo un único producto con 91% de rendimiento que se identificó como 2-propil 2,4,6-tri-O-acetil-3-desoxi- -α-D-eritro-hex-2-enopiranósido (98) en base a sus datos espectroscópicos. La configuración del centro anomérico fue confirmada preparando dos derivados cristalinos de hex-2-enopiranósidos descriptos en la literatura (el ter-butil glicósido 42 y el colesteril glicósido 99) y comparando sus propiedades físicas. Se encontró que la reacción es altamente estereoselectiva y no se detectaron trazas de anómero β. En este aspecto, esta ruta sintética aventaja al método clásico de Ferrier, que conduce a una mezcla anomérica de glicósidos y con menores rendimientos. Al disminuir las cantidades de NIS respecto al glical 2b, la reacción era má lenta pero el compuesto gg se obtenía siempre con buenos rendimientos, lo cual indicaría que la NIS actúa en forma catalítica en la glicosidación. Cuando se trabajó con exceso de 2-propanol, el compuesto 98 fue el producto principal independientemente de la concentración de NIS usada y se formaba también un producto secundario en cantidades apreciables que se identificó posteriormente como 2-propil 6-O-acetil-3,4-didesoxi-α-D-glicero-hex—3-enopiranosid-2-ulosa (101). También se estudió la reaccióncon derivados acetilados de glicales con configuración D-lixo (49) y L-lixo (96), observándose que con éstos las alquil hex-3- enopiranosid-2-ulosas (101, 102, 104) se obtenían con mejores rendimientos que cuando se partía del glical de configuración D-arabino (2b). El derivado benzoilado del 2-aciloxi-D-glucal (33) reaccionaba más lentamente con alcoholes en presencia de NIS, y afin luego de 20 h la reacción no se completaba. El 2-propil 2,4,6-tri-0-benzoil-3-desoxi-α-D-eritro-hex—2-enopiranósido (106) se obtuvo con 49% de rendimiento luego de su purificación cromatográfica. Los alquil hex-2-enopiranósidos se formaban por un reordenamiento alílico del 2-aciloxi-glical catalizado por ácidos, mediante un mecanismoque involucra la formación de un carbonio intermedio producido por eliminación del sustituyente del C-3. El hecho que la NIS no reacciona con los 2-hidroxiglicales en ausencia de un alcohol, sugeriría que el reordenamiento alílico es promovidopor el ácido iodhídrico producido por oxidación del alcohol por la NIS. La estereoselectividad de la reacción estaría regulada por factores estereoelectrónicos (anoméricoy alílico) los cuales favorecerían el ataque axial del nucleófilo al C-l del catión alílico formado. También sería factible la participación anquimérica del sustituyente de C-2 en la estabilización de la carga positiva de C-l. Aunque la formación del cación aciloxonio podría ocurrir por la cara α o β de la molécula, en virtud del efecto anomérico reverso el de configuración β sería preferencial, induciendo el ataque del alcohol por la cara opuesta, es decir la α. La formación de las alquil 3-hexen-2-ulosas involucraría el reordenamiento alílico de los 2-enopiranósidos (98 y 103) intermediarios, por ataque del alcohol al éster enólico. Este reordenamiento generaría el carbonilo de C-2 e induciría la eliminación del grupo aciloxi en C-4. Cuando en lugar de NIS se empleó como catalizador de la reacción tetracloruro de estaño(IV) (SnCl4) se favorecían las condiciones para la obtención de alquil 3-enopiranosid-2-ulosas. Así por ejemplo, la reacción de derivados acilados de 2-aciloxi- glicales con alcoholes, en presencia de SnCl4 y usando cloruro de metileno como solvente, condujo a alquil 3-enopiranosid-2-ulósidos (101, 102, 114, 116, 117, 118 y 119) como productos principales, junto con cantidades variables de un subproducto, identificado como 5-aciloximetil-2-furaldehído (113 ó 115). Se observó que la composición de la mezcla de reacción dependía de la concentración de SnCl4, de la configuración del glical de partida y fundamentalmente de la temperatura. Así por ejemplo, a partir de 2-aciloxiglicales con configuración D-arabino (2b y 33) se minimizaba la concentración de los subproductos ll3 y 115 cuando se trabajaba en un intervalo de temperatura entre -5°-0°C. Cuando se disminuía afin más la temperatura o se usaban cantidades de SnCl4 menores que las estequiométricas, no ocurría la reacción. En el caso de 2-aciloxiglicales de configuración lixo (42 y 97) la formación de los derivados acilados de 5-aciloximetil-2-furaldehído se encontraba muy afectada por la temperatura y a -20°C no se detectaba su formación. El di-O-acetil-2- acetoxi-L-fucal (96) con configuración L-lizo presentó un comportamiento similar obteniéndose a —20°Cla enona 116 con rendimientos casi cuantitativos. El procedimiento desarrollado para la preparación de glicósidos de 3-hexen-2- -ulosas a partir de 2-aciloxiglicales acilados y alcoholes en presencia de SnCl4 presenta importantes ventajas respecto a otros métodos, como por ejemplo: a) Permite preparar 3-hexen-2-ulosas en un solo paso y con muy buenos rendimientos. b) El método es esteroselectivo, formándose el anómero α. La única excepción se encontró en la reacción del tri-O-benzoil-2-benzoiloxi-D-galactal (97) con metanol, la cual condujo a una mezcla anomérica de enulosas. c) Los derivados benzoilados de 2-aciloxiglicales (33 y 97) se reordenan facilmente con SnCl4 a las correspondientes enonas, mientras que en presencia de NIS no era posible esta transformación. Los glicósidos de hex-2-enopiranosilo o de hex-3-enopiranosid-2-ulosas son intermediarios útiles en síntesis debido a los variados grupos funcionales presentes en la moléula. En este trabajo hemos obtenido a partir de dichos compuestos y mediante reacciones sencillas, derivados de desoxiazúcares, azúcares halogenados y 2-ulosas. Así por ejemplo, la hidrogenación del doble enlace de los alquil 2-enósidos 98 y 105 condujo estereoselectivamente a los glicósidos de la 3-desoxiglucosa 120 y 121. Por otra parte, por reducción catalítica del doble enlace C=C de la enulosa 101 se obtuvo el 2-ulósido 124. Se estudió también la reducción del grupo carbonilo de las enulosas 101 y 118 con NaBH4 en solución metanólica, obteniéndose los alcoholes alílicos correspondientes. En el caso particular de la glicosilulosa del colestanilo (118) el alcohol obtenido por reducción se caracterizó por preparación del derivado acetilado 125. Por posterior hidrogenación de estos intermediarios insaturados se obtuvieron los alquil 3,4-didesoxi-hexopiranósidos (127) y sus derivados acetilados (126 y 128). El análisis de los espectros de RMN-1H de estos compuestos mostraban valores de constantes de acoplamiento que definían claramente una configuración D-eritro, lo cual indicaba que la reducción del carbonilo con NaBH4 había ocurrido estereoselectivamente. Por último, por tratamiento de 101 con Br2/Cl3CH se obtuvo la 3-bromo-enulosa 133. Aparentemente, la halogenación de 101 ocurriría mediante una reacción de adición de Br2, seguida por eliminación de bromuro de hidrógeno, para reestablecer la conjugación. Los resultados de la reacción de glicosidación de 2-aciloxiglicales con alcoholes catalizada por SnCl4 nos llevaron a considerar la posibilidad de reemplazar los alcoholes por derivados nitrogenados como agentes nucleofílicos con la finalidad de obtener N-glicósidos de enulosas. Empleando como compuesto nitrogenado una base purínica o pirimidínica, esta reacción permitiría sintetizar cetonucleósidosa, α,β-insaturados en un solo paso. Los cetonucleósidos son moléculas de interés en bioquímica y en medicina, y particularmente los α,β-insaturados han mostrado actividad antitumoral. El uso de cetonucleósidos insaturados como agentes antitumorales ha potenciado el desarrollo de métodos sintéticos, que en general involucran numerosos pasos. Por tratamiento del tri-O-acetil-2-acetoxi-D-galactal (49) con el 2,4-bis (trimetilsililoxi)uracilo (135), en presencia de SnCl4 , se obtuvieron dos compuestos principales de distinta movilidad cromatográfica. El :e menormovilidad (¿21) se aisló puro por cromatografía en columna con 63% de rendimiento y se identificó como 3-(6'-0-acetil-3'4'-didesoxi-α-D-glicero-hex-3'-enopiranosid-2'-ulosa)uracilo. El producto de mayor movilidad (136) se caracterizó como el derivado N-acetilado de 137. El compuesto 136 se convertía en 137 por calentamiento en solución metanólica. La glicosidación había ocurrido a través del N-3 por lo cual los compuestos 136 y 137 son en realidad cetoisonucleósidos, de los cuales no se encontró ejemplos en la literatura. El compuesto 137 se preparó también a partir de 2-aciloxi-D-glucal acetilado (2b), en las mismas condiciones descriptas para el acetato de 2-acetoxi-D-galactal (49), obteniéndose el cetosionucleósido insaturado 137 con un rendimiento menor (44%). La reacción de N-glicosidación se extendió a otros glicales y a otras bases Pirimidínicas. Así por ejemplo, el di-O-acetil-2-acetoxi-L-fucal (96) reaccionó con el derivado trimetilsililado del uracilo (135) para dar el 3-(3',4',6'-tridesoxia-α- L-glicero-hex-3'-enopiranosid-2'-ulosa)uracilo (138) con 40% de rendimiento. Se efectuó también la N-glicosidación del derivado trimetilsililado de la timina (139) con tri-O-acetil-2-acetoxi-D-galactal (49), en presencia de SnCl4, reacción que condujo a 3-(6'-O—aceti1—3',4'-didesoxi-α-D-glícero -hex-3'-enopiranosid-2'-ulosa) timina (140) con 40% de rendimiento. Por reducción del sistema carbonílico α,β-insaturado de los cetoisonucleósidos se confirmó la estructura de los mismos mediante un método químico. Por tratamiento del compuesto 137 con exceso de NaBH4 en solución metanólica se obtuvo el 3-(3',4'-didesoxi-α-Q?ritro-hexopiranósil)uracilo (144), y por posterior acetilación con Ac2O/Py el derivado diacetilado 145. La configuración D-eritro de la porción didesoxihexosa se asignó por análisis de los espectros de RMN-1H y -13C de 145. Por otra parte, para demostrar las configuraciones de C-l y C-2 de 144 por un método químico, se realizó la acetólisis de 144 con la finalidad de obtener el derivado peracetilado de una 3,4-didesoxihexosa. Por tratamiento de 144 con una mezcla anhídrido acético-ácido sulfúrico-ácido acético (72 h, 4°C) se obtuvo la mezcla anomérica de la l,2,6-tri-O-acetil-3,4-didesoxi-D-eritro-hexopiranosa (147). Los anómeros 147α y 147β se separaron por CLAR. El mismo tratamiento aplicado al 2-propil 3,4-didesoxi-α-D-eritro-hexopiranósido (127), condujo a una mezcla de productos, de la cual luego de separaciones por columna cromatográfica y CLAR, se aislaron entre otros, los anómeros α y β de la triacetil didesoxihexosa(147α y 147β). Estas secuencias de reacciones permiten concluir que tanto el didesoxisonucleósido 144, como el O-glicósido análogo 127, tienen la misma configuración en C-2. Además, con este dato se pudo reconfirmar, indirectamente, la configuración anomérica de 144 y 137. En ambos casos, la reducción del sistema carbonílico α,β-insaturado de 137 y 101; resultó estereoselectiva, con ataque del ión hidruro por la cara β de la molécula, opuesta al sustituyente anomérico. Con el propósito de estudiar la influencia de la sustitución por un grupo aciloxi en el C-2 de los glicales sobre la reacción de condensación con bases pirimidínicas en presencia de SnCl4, se extendió el estudio de la reacción a glicales acilados comunes, en particular el 3,4-di-0-acetil-L-ramnal (26). Así, por tratamiento del glical 26 con el derivado trimetilsililado de la timina 139 en presencia de SnCl4, se aislaron, luego de la cromatografía en columna, los anómeros α y β de la 1-(4'-0-acetil-2',3',6'-tridesoxi-L-erítro-hex-2'-enopiranosil)timina, 155 y 154 respectivamente. Las estructuras se determinaron en base a sus datos espectroscópicos y constantes físicas que coincidían con las descriptas en la literatura. La misma reacción, con el derivado trimetilsililado del uracilo (135) condujo a resultados similares, aislándose los anómeros α y β de l-(4'-0-acetil-2',3',6‘- tridesoxi-L-eritro-hex-2'-enopiranosil)uracilo (157 y 156 respectivamente). Las reacciones de N-glicosidación del derivado acetilado del L-ramnal (26) en presencia se SnCl4, condujeron pues a mezclas anoméricas de N-l nucleósidos de hexen-2'-enósidos. La diferencia observada en cuanto a estereo y regioselectividad en las reacciones de los 2-aciloxiglica1es acilados respecto a los glicales normales, ponen de manifiesto la influcencia del sustituyente del C-2 del glical, el cual afectaría el curso estereoquímico de 1a reacción de N-glicosidación. Los compuestos 96, 97, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 114, 116, 117, 118, 120, 121, 124, 125, 127, 128, 133, 136, 137, 138, 140, 144, 145, 147α, 147β, 156 y 157, no se encontraban descriptos en la literatura.

Las α- y ,β-D-galactosidasas (α- y ,β-Gal)y α-L-arabinofuranosidasas (α-Af) son enzimas capaces de liberar restos galactosilos y arabinofuranosilos de polímeros pécticos y hemicelulósicos como así también de diferentes glicoconjugados. Algunas de estas glicosidasas han sido vinculadas al ablandamiento de los frutos. En esta Tesis, se desarrollaron métodos de separación de la β-Gal II y de 3 isoformas de la α-Af. Se demostró que la ,β-Gal II es la única ,β-Gal involucrada en la maduración. Asimismo, mediante el uso de frutos de tomate antisentido para la enzima 1-aminociclopropano-l-carboxílico sintasa (ACC-S[—])se determinó que la actividad de β-Gal lI responde a muy bajas concentraciones de etileno. Los frutos ACC-S[—] presentan una disolución incipiente de los polímeros pécticos de la lámina media, la cual puede ser atribuirse, entre otras causas, a hidrolasas de pared celular capaces de responder a muy bajas concentraciones de etileno. Las isoformas α-Af I y II mostraron actividad durante toda la ontogenia del fruto. α-Af I es la primera enzima de pared dependiente de zinc extraída del pericarpo de fruto de tomate, y sugiere la participación del catión en el metabolismo de la pared celular de los frutos. La actividad de α-Af II es superior al 80% de la actividad arabinofuranosidásica total en frutos de 10 días, pero disminuye durante la maduración. La isoforma α-Af III, en cambio, es específicamente activa durante la maduración y sensible al etileno, aún a muy bajas concentraciones. Se obtuvieron diferentes respuestas de las α-Af al ácido giberélico, auxinas sintéticas y etileno, mediante un nuevo sistema de discos de pericarpo de tomate ACCS[—]. Las isofonnas I y II mostraron incrementos significativos de actividad por la aplicación de ácido giberélico o ácido 2,4-diclorofenoxiacético, mientras que la aplicación de etileno exógeno sólo incrementó la actividad de la isoforma III. Estos y otros resultados sugieren que las enzimas α-Afs están codificadas por una familia multigénica sujeta a distintos comroles hormonales, cuyos miembros desempeñan diferentes funciones in vivo. Esto último se sustenta en la capacidad de extractos de las isoformas de α-Af para liberar arabinosa de diferentes fracciones de la pared celular. Se discuten además los resultados de la influencia de atmósferas controladas y estrés por altas temperaturas in vivo sobre la actividad de α- y β-Gal y α-Af. El sistema in vitro que utiliza pericarpo ACC-S[—] permitirá por vez primera la realización de estudios completos referidos a los efectos fisiológicos de diferentes reguladores sobre la expresión génica y la actividad de diversas enzimas, sin interferencia del etileno generado por heridas al tejido.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Parte 1 El mecanismo de glicosilación de los residuos de asparagina de las proteinas es similar en todos los eucariotas: un oligosacárido preformado es transferido co-traduccionalmente a la proteína en el reticulo endoplasmático. Comienza entonces en dicha localización subcelular el procesamiento del mismo. Posteriormente en el aparato de Golgi continúa este proceso que habrá de conducir finalmente a la gran diversidad de oligosacáridos unidos N-glicosidicamente a las proteínas. Los tripanosomátidos son parásitos de considerable importancia médica y económica dado que existe una gran variedad de organismos (vertebrados, invertebrados y plantas) que pueden ser infectados por dichos parásitos. La N-glicosilación en tripanosomatidos presenta caracteristicas especiales como la existencia de moleculas de dolicol extremadamente cortas, la incapacidad de sintetizar oligosacaridos glucosilados unidos a dolicol-P-P, la presencia de oligosacariltransferasas que en sistemas libres de células catalizan la transferencia de oligosacáridos glucosilados y no glucosilados a la misma velocidad, el hecho de que ciertas especies solamente transfieran compuestos truncados (Man6GlcNAc2y Man7GlcNAc2) y, uno ó dos oligosacáridos (Man7GlcNAc2 y/o Man9GlcNAc2 simultáneamente) dependiendo del estadío de diferenciación, la adición de galactofuranosas a compuestos de alta manosa y finalmente la adición de ácido siálico a través de una trans-sialidasa y no por una enzima dependiente de CMP-siálico. En base a esto se decidió estudiar a dos tripanosomátidos con el objeto de determinar la presencia de otras caracteristicas distintivas. Por un lado se analizó a Blastocrithidia culicis, un tripanosomátido monogenético que vive en forma libre en el intestino de varias especies de mosquitos. Ese protozoario transfiere Man6GlcNAc en N-glicosilación. En el presente trabajo se encontró que los oligosacáridos sensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H, obtenidos a partir de glicoproteínas totales del parásito, contienen residuos de manosa, xilosa y ramnosa. La composición de alguno de ellos fue la siguiente: Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rha1Man5GlcNAc2, Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha3Man6GlcNAc2 y Xyl2Rha3Man6GlcNAc2. En oligosacáridos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H pero sensibles a N-glicanasa, se halló la presencia de unidades de manosa, xilosa, ramnosa y ribosa. Por el otro lado se analizaron las glicoproteinas de Endotrypanum schaudinni, tripanósomátido digenético que alterna su ciclo de vida entre un invertebrado y un vertebrado (perezoso). Se encontró que este parásito transfiere Man7GlcNAc2en la N-glicosilación de proteínas. Los oligosacáridos sensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H se identificaron como Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rib1Man6GlcNAc2 y/o Gal1Man6GlcNAcl Man5GlcNAc2 conteniendo dos residuos de ribosa ó galactosa ó uno de cada uno, Rib1Man5GlcNAc2 y Gal1Man5GlcNAc2. Las galactosas se hallan en configuración furanosa. Los glicopéptidos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H que fueron retenidos por concanavalina A-Sepharose y eluídos con α-metilmanósido contienen residuos de manosa, galactosa y ribosa. Es importante de mencionar que es la primera vez que se describe la presencia de residuos de ribosa en glicoconjugados de eucariotas, de residuos de ramnosa en oligosacáridos unidos a asparagina y de unidades de xilosa en compuestos del tipo de alta manosa. Finalmente, la presencia de galactofuranosas habia sido descripta en varias especies monogenéticas, pero tan sólo en un tripanosomátido digenético como Trypanosoma cruzi. Parte 2 En el presente trabajo se muestra, en membranas de Dictyostelium discoideum, la presencia de una actividad enzimática que transfiere N-acetilglucosamina-I-P, a partir de UDP-GlcNAc, a las proteinas en residuos de serina (UDP-GlcNAc: Ser-proteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa). Dicha actividad fue parcialmente purificada por cromatografia de afinidad en concanavalina A-Sepharose y por cromatografia de intercambio iónico en una columna de Mono Q. La enzima mostró una absoluta dependencia de cationes divalentes, siendo el Mn++ más efectivo que el Mgˉˉ. Posee un amplio rango de pH óptimo (6.5-9.0). El Km para el UDP-GlcNAc fite de 18 μM. En ensayos libres de células se utilizaron como sustratos exógenos apomucina y tiroglobulina nativa ó desnaturalizada, mientras que proteínas como la sero albúmina bovina y la uteroferrina nativa o desnaturalizada no mostraron capacidad aceptora para dicha actividad. A partir de un cultivo de células realizado en presencia de [³²P]fosfato se aislaron proteínas celulares (solubles y de membrana) y del medio de cultivo. En todas las fracciones se encontró la estructura de GlcNAc-1-P-Ser, sin embargo, la mayor proporción se halló en las proteinas secretadas. Al someter microsomas a centrifugaciones en gradientes de sacarosa , la actividad apareció en membranas de menor densidad al compararla con la actividad que fosforila oligosacáridos de alta manosa. Esto mostró que la actividad que fosforila residuos de serina en las proteinas (UDP-GlcNAc: Ser-proteina N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa) es diferente a la que fosforila oligosacáñdos del tipo de alta manosa unidos a las proteinas (UDP-GlcNAc: glicoproteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa).

Los glicosilfosfatidilinositoles (GPIs) son una familia de compuestos que pueden actuar como anclas de proteínas a membranas celulares y también pueden estar libres en estas membranas. Por hidrólisis de GPI con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) se libera inositolfosfoglicano (IPG) que ha sido propuesto como segundo mensajero de insulina y otras hormonas. Resultados del laboratorio mostraron que ACTH es capaz de hidrolizar GPI y que un IPG con estructura conservada purificado de Trypanosoma cruzi es capaz de inhibir la acumulación de aldosterona mediada por ACTH en células adrenocorticales de vaca. El objetivo de este trabajo fue estudiar: a) GPIs presentes en corteza adrenal bovina, b) La participación de estos compuestos en la respuesta de ACTH y c) GPI y sus precursores en Schizosaccharomyces pombe, una sistema no estudiado hasta el presente, con el fin de buscar una fuente de GPI para los estudios biológicos. En este trabajo se mostró la presencia de anclas de GPI en corteza adrenal pues se encontraron compuestos suceptibles a ácido nitroso y se purificó parcialmente una enzima anclada por GPI la fosfatasa alcalina, FAL, cuyo ancla fue utilizada como fuente de IPG y se probó su efecto inhibitorio sobre la respuesta de ACTH. Con respecto a la participación de GPI en la respuesta de ACTH, se encontró que esta hormona es capaz de activar una PI-PLC, a través de una proteína G inhibible por toxina de pertussis, Gi/o, en células adrenocorticales, lo que muestra que el receptor de ACTH puede acoplarse a más de un tipo de proteína G (Gs, Gi). La activación de PI-PLC por la hormona sugiere la producción de IPG. Se encontró que un IPG purificado de T. cruzi, fue capaz de inhibir en células adrenocorticales la producción de aldosterona, corticosterona (en rata) y cortisol (en vaca). ACTH utiliza AMPc como segundo mensajero. Los resultados sugieren que el efecto inhibitoriode IPG estaría mediado por una activación de fosfodiesterasa, enzima que degrada AMPc, y una inhibición de PKA. Se sabe que IPG es liberado al medio extracelular y luego entra en la célula donde actúa. En concordancia con este hecho hemos visto que: a) los sobrenadantes de células tratadas con ACTH son capaces de inhibir la respuesta de la hormona y b) el agregado del anticuerpo anti-CRD contra IPG aumenta la acumulación de esteroides mediada por ACTH. Estos resultados muestran que ACTH es capaz de liberar IPG el cual inhibe su respuesta y reafirman la hipótesis de que el IPG participa en la respuesta fisiológica de esta hormona. Por otro lado, con el objeto de obtener una fuente de GPI para realizar los estudios biológicos, más fácil de trabajar que el trypanosoma, se estudiaron GPI y sus precursores, los inositolfosfolípidos, en S. pombe, pues se ha encontrado que en otra levadura, Saccharomyces cerevisiae, estas anclas son abundantes. S. cervisiae es la única levadura cuyos GPIs han sido estudiados hasta el momento por lo cual fue interesante encarar el estudio de otra levadura, Schizosaccharomyces pombe de caracteristicas biológicas diferentes a S. cervisiae. Se ha visto que los inositolfosfolípidos consisten principalmente en fosfatidilinositol y no contienen alquilglicerol ni ceramida. Se ha obtenido la estructura completa de estos inositolfosfolípidos por estudios en TLC, RPTLC y CGL, a partir de cultivos con o sin incorporaciones de palmitico radioactivo. Se encontró un único ácido graso esterificando la posición 2 de fosfatidilinositol y una mezcla en posición 1. A pesar de que no se incorporó ceramida en inositolfosfoceramidas, se demostró la existencia de [³H]-esfingomielina, esfingofosfolípido característico de mamíferos, conteniendo ceramida radioactiva. Se detectó una banda de proteínas de PM 19.000 aproximadamente que incorpora [³H]-ácido palmitico. Luego de digestión con proteasa e hidrólisis con GPI-PLD se liberaron lípidos marcados que prueban la existencia de anclas en esta fracción. Por otra parte, se evidenció la presencia de GPIs libres en extractos orgánicos por susceptibilidad a ácido nitroso y PIPLC. Estos compuestos, fueron utilizados como fuentes de IPG y se probó su efecto inhibitoriosobre la acumulación de corticosterona por ACTH.