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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016.

El VWF es una glicoproteína adhesiva, sintetizada en las CE y megacariocitos. Se sintetiza en forma monomérica, luego se organiza en dímeros y se multimeriza. El VWF media la adhesión de plaquetas al subendotelio vascular dañado y lel transporte del factor FVIII. La ADAMTS13, proteasa que cliva al VWF, pertenece a la familia de metaloproteasas ADAMTS, llamadas así por la combinación característica de una desintegrina y una metaloproteasa con motivos trombospondina tipo 1. La ADAMTS13 es sintetizada en el hígado. Además, se ha demostrado que se sintetiza y almacena en las CE, y que tiene actividad en los lisados celulares en condiciones estáticas y de flujo. La ADAMTS13 está involucrada en el proceso fisiológico de clivar a los multímeros extragrandes altamente trombogénicos, que cuando están presentes en el plasma o en la superficie de las CE llevan a una agregación intravascular y a la formación de un trombo plaquetario. Hemos observado que los niveles de ADAMTS13 descienden, mientras que los del VWF aumentan a medida que progresa el embarazo. En 1972, varios autores han descripto el aumento del 17β estradiol. También se ha observado que la administración de estradiol a las CE en dosis no fisiológicas produce un aumento de VWF. Hay antecedentes acerca de la acción de las hormonas determinantes del sexo en la muerte o proliferación celular en distintas líneas celulares y cultivos primarios. Se demostró la existencia de un factor embrionario liberador de histamina y una alta expresión de receptores para histamina durante la gestación en humanos. Además, se observó un aumento en los niveles de histamina en las últimas semanas de gestación en modelos de ratas y hamsters dorados. Los objetivos de esta tesis fueron: 1- analizar si los cambios hormonales que inducen o inhiben la síntesis o liberación de VWF y ADAMTS13 tienen influencia en la muerte o proliferación celular y 2- qué modificaciones producen las hormonas y concentraciones altas de histamina en la producción de VWF y ADAMTS13. Los experimentos se realizaron en cultivos de HUVEC. Se analizaron los efectos de las hormonas, a distintas dosis, en la proliferación o apoptosis, mediante el uso de técnicas de citometría de flujo y ensayo por colorimetría (MTS). Para evaluar el mecanismo de señalización se analizó la fosforilación de MAPK utilizando la técnica de SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se observó que el efecto proliferativo del estradiol en HUVEC, ocurre a través de un aumento de la fosforilación de ERK2, inducido por el estímulo de la deprivación del suero. La progesterona y testosterona en dosis suprafisiológicas promovieron la apoptosis de HUVEC vía activación de p38 y JNK. Además se analizaron los niveles de mRNA (por Real Time PCR) y proteína intracelular y liberada (por SDS-PAGE e inmunotransferencia y ELISA) de VWF y ADAMTS13, en respuesta a los distintos tratamientos hormonales y con histamina. El estradiol, la progesterona y testosterona, no produjeron ningun cambio en la liberacion de VWF en las HUVEC, sin embargo combinadas con histamina, agonista de la liberación de VWF, produjeron inhibición de la actividad de la histamina. Por otra parte el estradiol, la progesterona y la testosterona no produjeron cambios significativos en la liberación de ADAMTS13, sin embargo el tratamiento con histamina indujo una disminución en los niveles de ADAMTS13, que fue revertida en la combinación con estradiol y progesterona. Finalmente, el estradiol, produjo un aumento en los niveles de mRNA de VWF y ADAMTS13. En la síntesis de ambos mRNA, el estradiol y la histamina presentan un efecto antagónico y la combinación de la progesterona y la histamina presentarían un efecto sinérgico.

La toxina perfringens contenida en los cultivos de Clostridium welchii, tipo A., hemolisa los glóbulos rojos, y como demostró Todd (1941), es lábil al oxígeno y está relacionada con la streptolisina 0, con la cual posee comunidad antigénica. En este trabajo nos propusimos demostrar las condiciones o factores que favorecen o inhiben la acción del oxígeno. Además, como al parecer se trata ds un sistema de óxido reducción, intentamos llegar experimentalmente a determinar de que tipo era el referido sistema, es decir, que sustancia o grupo de sustancias, rigen por cambios sucesivos esta clase de fenómenos. El primer punto que debimos resolver fué el siguiente: encontrar una sustancia reductora tal que, al ser adicionada a la toxina, no permita la oxidación de ésta. Así se puede mantener el material con poder hemolítico lo suficientemente elevado, como para medir sus fluctuaciones, cuando se somete la toxina a otros procesos. Ademas, la toxina entera, es decir, el filtrado de los cultivos de Clostridium welchii, tipo A, posee una composición extremadamente compleja. Las sustancias inertes que acompañan al principio hemolítico, producen muchas veces reacciones que interfieren a las de la hemolisina propiamente dicha. Por esta razón, el segundo punto que tratamos de resolver fué el siguiente: separar y purificar el principio hemolítico. Para ello utilizamos los métodos clásicos de precipitación de la fracción proteica por acción del sulfato de amonio a saturación, y luego purificación posterior de esta por el método de diálisis. Así se obtuvieron varias fracciones, que al ser tratadas por agentes reactivantes, tales como el hidrosulfito de sodio o el ácido tioglicólico, nos condujeron a resultados - en base a los cuales podemos sugerir - la existencia de una sustancia particular, presente en las toxinas enteras, que permite la acción reactivadora del ácido tioglicólico, ya que al desaparecer esa sustancia, la acción es nula o contraria a la reactivación. Las experiencias de oxidación por otros agentes, tales como el iodo, o el ferricianuro de potasio, nos llevaron a demostrar que en estos casos, la inactivación de la toxina se lleva a cabo en forma irreversible, es decir al ser tratada nuevamente con hidrosulfito de sodio o con ácido tioglicólico no regenerar su capacidad hemolítica. Estas experiencias se hicieron en base a las que ya habían efectuado C.V.Smythe y T.H. Harris (1940), con un determinado grupo de estreptococos hemolíticos. La interpretación de los resultados de estas experiencias de oxidación, así como la individualización de las sustancias cuya existencia fué anteriormente sugerida, se hacen muy dificultosas debido a que, como todavia el Clostridium welchii, se cultiva en medios de composición compleja, las conclusiones de las experiencias efectuadas con esta clase de filtrados pueden ser, a veces, erroneas o dispares. Por eso creemos, que el estudio racional de estos sistemas podrá ser encarado con mayores perspectivas de éxito cuando se llegue a cultivar el Clostridium welchii, en medios sintéticos. Se puede atribuir además, a esa extrema complejidad en la composición de los flltrados, la inconstancia en los datos obtenidos cuando se trató de investigar la presencia de glutation y citocromo.

Igarza, Roberto

El propósito de este trabajo es obtener un antioxidante natural a partir de las semillas de uva (Vitis vinifera L.), para emplear en alimentos. Para ello se compararon distintos solventes para la extracción de fenoles de las semillas de la uva, de modo de obtener el extracto más concentrado en compuestos activos con la mínima degradación de su poder antioxidante durante el proceso de obtención. La concentración de fenoles totales de los extractos se determinó por el método Folin Ciocalteu. El poder reductor de los extractos se midió empleando el método de Oyaizu. Una vez seleccionado el solvente más adecuado para la extracción, se analizó la cinética de extracción, optimizando el tiempo de tratamiento. El extracto fue concentrado al vacío, y se veríficó la conservación del poder reductor en el extracto concentrado, por el método de Oyaizu. El extracto de semillas concentrado y sin concentrar se empleó en un sistema real sujeto a oxidación, tal como el jugo de manzanas. El grado de oxidación del jugo se midió por el método de Özoglu. El extracto concentrado fue deshidratado por secado en lecho de espuma y por liofilizado. En ambos casos se verificó el efecto del tratamiento de secado sobre el poder reductor. Finalmente, se evaluó la actividad antioxidante del extracto líquido concentrado de semillas de vid, respecto de otros antioxidantes comerciales como ácido ascórbico y dióxido de azufre. El sustrato oxidable fue el jugo de manzanas, y el grado de oxidación se midió por el método de Özoglu. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el análisis de la varianza; cuando no fue posible emplear el mencionado análisis, debido a que no se verificaban los supuestos básicos para su aplicación, se empleó la prueba de Kruskal –Wallis. En todos los casos, se utilizó el programa Statgraphics plus ®4.0. Para obtener un extracto antioxidante a partir de semillas de vid se utilizó una ex-tracción con agua a 90ºC, durante 4 horas. La relación sólido- líquido empleada fue de 1g de semillas enteras por 10 ml de solvente. El extracto obtenido presentaba una concentración de 12,587 mg de fenoles totales por gramo de semillas de uva extractadas y un poder reductor de 1,290 unidades. Como consecuencia del análisis de la cinética de extracción, el tiempo de tratamiento se redujo de 4 horas a 3 horas. La concentración del extracto se realizó al vacío a 60ºC, verificándose un aumen-to del poder reductor en el extracto concentrado, comprobado sobre jugo de manzanas. Comparando el extracto concentrado y el extracto sin concentrar se observa que la concentración de fenoles totales aumentó 29,57 veces, mientras que el poder reductor aumentó 37,39 veces. El deshidratado del extracto por medio del lecho de espuma permitió conservar el poder reductor del mismo, no ocurrió lo mismo en el deshidratado por liofilizado, donde se produjo un deterioro del poder reductor. Para un mismo contenido de fenoles totales agregado al jugo de manzanas, el ex-tracto líquido sin concentrar produjo un 28,4% de inhibición de la oxidación, mientras que el de extracto líquido concentrado produjo un 51,5 % de inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. El extracto de semillas de vid, aplicado como antioxidante en jugo de manzanas, inhibió el desarrollo de la oxidación en un 31,51%, considerando 24 horas el tiempo de tratamiento. Este desempeño supera al ácido ascórbico, que en iguales condiciones, inhibió el desarrollo de la oxidación en un 2,6%. Pero en las condiciones de tra-bajo, el dióxido de azufre resulta mejor antioxidante que ambos, ya que logró inhibir el desarrollo de la oxidación en un 97,40 %.

La relevancia de la investigación de Ilex brasiliensis (Spreng.) Loes. (Aquifoliaceae) se justifica en la proximidad filogenética y biogeográfica con Ilex paraguariensis (yerba mate), en su uso popular como sustituto o adulterante de la yerba mate y en la escasa información respecto a sus propiedades biológicas. Esta tesis estudia el órgano foliar que es la materia prima de uso popular para preparar las infusiones y se propone establecer características farmacognósticas, evaluar la actividad antioxidante y los efectos en la fisiopatología del daño miocárdico inducido por isquemia y reperfusión.\nEn el análisis micrográfico se distinguen caracteres morfoanatómicos diferenciales con I. paraguariensis, en particular: los tipos de estomas, la estructura del haz vascular y la vaina de esclerénquima de la vena media foliar.\nEl estudio de I. brasiliensis utilizando HPLC-PDA-UV demuestra dos características fitoquímicas diferenciales respecto I. paraguariensis: la ausencia total de cafeína y la mayor riqueza en isoquercitrina. El análisis con HPLC-ESI-MS pone en evidencia que I. brasiliensis posee una mayor variedad de flavonoides derivados de quercetina y kaempferol. Los métodos colorimétricos determinan una mayor concentración de fenoles totales y ácido ascórbico.\nI. brasiliensis posee una elevada actividad antioxidante in vitro como atrapador de radicales libres estables (DPPH y ABTS) y de especies reactivas derivadas del oxígeno y del nitrógeno (superóxido y peroxinitrito). También, la capacidad para inhibir la peroxidación lipídica enzimática y no enzimática de microsomas hepáticos de rata y proteger a las LDL de la peroxidación lipídica inducida por cobre. En comparación a I. paraguariensis, el extracto acuoso de I. brasiliensis tiene una mayor actividad antioxidante como atrapador de ABTS•+ y peroxinitrito y como reductor de Fe+3. Estos hallazgos se atribuyen a su mayor contenido de ácido ascórbico.\nLos resultados alcanzados demuestran, por primera vez, que un extracto acuoso de hojas de I. brasiliensis disminuye las alteraciones post-isquémicas de la función miocárdica y el daño oxidativo producidos como consecuencia del proceso de isquemia y reperfusión. Asimismo, que el mecanismo cardioprotector es dependiente de la NOS. Efectos similares se observan después del tratamiento con I. paraguariensis. Se postula que las acciones cardioprotectoras de I. brasiliensis no son simplemente debidas a sus propiedades redox; sino más bien, a la capacidad de algunos de sus constituyentes para unirse a proteínas dianas.

La relevancia de la investigación de Ilex brasiliensis (Spreng.) Loes. (Aquifoliaceae) se justifica en la proximidad filogenética y biogeográfica con Ilex paraguariensis (yerba mate), en su uso popular como sustituto o adulterante de la yerba mate y en la escasa información respecto a sus propiedades biológicas. Esta tesis estudia el órgano foliar que es la materia prima de uso popular para preparar las infusiones y se propone establecer características farmacognósticas, evaluar la actividad antioxidante y los efectos en la fisiopatología del daño miocárdico inducido por isquemia y reperfusión.\nEn el análisis micrográfico se distinguen caracteres morfoanatómicos diferenciales con I. paraguariensis, en particular: los tipos de estomas, la estructura del haz vascular y la vaina de esclerénquima de la vena media foliar.\nEl estudio de I. brasiliensis utilizando HPLC-PDA-UV demuestra dos características fitoquímicas diferenciales respecto I. paraguariensis: la ausencia total de cafeína y la mayor riqueza en isoquercitrina. El análisis con HPLC-ESI-MS pone en evidencia que I. brasiliensis posee una mayor variedad de flavonoides derivados de quercetina y kaempferol. Los métodos colorimétricos determinan una mayor concentración de fenoles totales y ácido ascórbico.\nI. brasiliensis posee una elevada actividad antioxidante in vitro como atrapador de radicales libres estables (DPPH y ABTS) y de especies reactivas derivadas del oxígeno y del nitrógeno (superóxido y peroxinitrito). También, la capacidad para inhibir la peroxidación lipídica enzimática y no enzimática de microsomas hepáticos de rata y proteger a las LDL de la peroxidación lipídica inducida por cobre. En comparación a I. paraguariensis, el extracto acuoso de I. brasiliensis tiene una mayor actividad antioxidante como atrapador de ABTS•+ y peroxinitrito y como reductor de Fe+3. Estos hallazgos se atribuyen a su mayor contenido de ácido ascórbico.\nLos resultados alcanzados demuestran, por primera vez, que un extracto acuoso de hojas de I. brasiliensis disminuye las alteraciones post-isquémicas de la función miocárdica y el daño oxidativo producidos como consecuencia del proceso de isquemia y reperfusión. Asimismo, que el mecanismo cardioprotector es dependiente de la NOS. Efectos similares se observan después del tratamiento con I. paraguariensis. Se postula que las acciones cardioprotectoras de I. brasiliensis no son simplemente debidas a sus propiedades redox; sino más bien, a la capacidad de algunos de sus constituyentes para unirse a proteínas dianas.

Con el fin de obtener conocimientos que sirvan de aporte para futuros desarrollos de alimentos funcionales que contengan a las proteínas de amaranto como uno de sus ingredientes, en este trabajo nos hemos propuesto estudiar los aspectos básicos de la actividad antitrombótica de las proteínas de amaranto. Se estudiaron diversos protocolos de hidrólisis sobre los aislados proteicos de amaranto como una herramienta que nos permitiese generar distintos polipéptidos y péptidos activos. En todos los casos se observó que el tratamiento enzimático sobre las proteínas de amaranto generó péptidos con potencial actividad antitrombótica, siendo mucho más efectivo cuando la hidrólisis fue realizada por las enzimas gastrointestinales utilizadas en la simulación. Los resultados prometedores obtenidos con el aislado sometido a la digestión gastrointestinal nos impulsaron a seleccionarlo para ahondar en la búsqueda de péptidos con actividad antitrombótica presentes en las proteínas de amaranto, realizándose determinaciones in vitro, in vivo y ex vivo sobre la muestra. En los ensayos realizados con animales se pudieron estudiar parámetros asociados a las distintas etapas de la hemostasia, sugiriendo los resultados que el aislado proteico de amaranto es un potencial agente antitrombótico. Los péptidos que se encuentran encriptados en las proteínas de amaranto, una vez liberados durante la digestión gastrointestinal serían capaces de ejercer un efecto antiplaquetario y/o anticoagulante. Con el objeto de intentar comprobar la hipótesis anteriormente mencionada, se buscó purificar aquellos péptidos responsables de la actividad antitrombótica y estudiar la potencial biodisponibilidad de los mismos. Se logró, de este modo, obtener una fracción con muy alta actividad antitrombótica in vitro y las pruebas de absorción realizadas utilizando esta fracción activa, junto con su secuenciación nos permitieron encontrar péptidos potencialmente bioactivos, algunos de los cuales lograron atravesar el epitelio intestinal representado por la monocapa celular desarrollada en el inserto. Los resultados encontrados a lo largo de este trabajo de tesis fueron consistentes y nos inducen a pensar que en las proteínas de amaranto se encuentran encriptados péptidos bioactivos capaces de ejercer una actividad antitrombótica. Queda aún pendiente esclarecer el o los mecanismos de acción involucrados.

Garona, J. (2015). Actividad antitumoral del nuevo análogo de desmopresina [V⁴Q⁵] dDAVP sobre células de carcinoma mamario. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.