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Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipo celular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, las pruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que pueden obtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embriones y con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lo tanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante para mejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción con factores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factores inducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso de reprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticas humanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, los hemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condiciones de generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación, moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir de ello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemos cultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fide de las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estado indiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro, e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhiben características morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios de células madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares en cultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estado pluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad de colonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con las colonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estado pluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas en hipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando las colonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, pero se indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa de proliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectores retrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células a reprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en los plásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a las proteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad de activación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectores generados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posible efecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en la célula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muerte celular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlar debido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con el agente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducir con estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollo de protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia. PALABRAS CLAVE células madre, células madre embrionarias humanas, células madre pluripotentes inducidas, hipoxia celular, reprogramación nuclear, pluripotencia, estado pluripotente, diferenciación

El peso al nacer es una de las medidas más utilizada como proxy de la salud y bienestar infantil en la literatura económica. Aquellos niños con bajo peso al nacer (LBW), convencionalmente definido como menos de 2500 gramos, suelen experimentar efectos severos sobre la salud, la mortalidad, la morbilidad y la discapacidad. Por otro lado, el bajo peso al nacer también se traduce en costos sustanciales en el sector de la salud e impone una carga significativa sobre la sociedad en su conjunto. El desarrollo corporal de las madres al igual que su estilo de vida determinarán el peso del bebé al momento de nacer. Este estudio se centra en el desarrollo de la vida fetal y explora cómo la desnutrición en el útero afecta al peso al nacer y durante los primeros años de vida mediante el uso de las fechas exactas de nacimiento de los niños menores de 5 años y la explotación de la naturaleza calendárica de la incidencia de las déficits nutricionales derivadas de la exposición con el mes de ayuno musulmán que ocurre durante el Ramadán. La estrategia de identificación econométrica utiliza a las variaciones en el tiempo de exposición al Ramadán durante la gestación y la religión para identificar el efecto el peso.

Fil:Rubinstein, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La actividad física ha estado presente en la vida diaria del hombre a lo largo del tiempo, modificándose su significancia dependiendo del momento socio-cultural que fue transitando. En las últimas décadas, el ejercicio de baja intensidad ha sido utilizado como uno de los tratamientos más efectivos para prevenir distintas patologías ya que reduce factores de riesgo cardiovasculares y la actividad del sistema nervioso simpático. Sin embargo, no es claro si los efectos benéficos del ejercicio sobre la función cardíaca y al menos algunas de las variables que regulan el remodelamiento ventricular post ejercicio, están relacionados con la intensidad del mismo. Por otro lado, si bien se conoce que durante el ejercicio hay una activación del sistema autónomo simpático, se desconoce si una sobreestimulación de éste modifica las respuestas obtenidas en condiciones normales. Por estos motivos, nuestro objetivo fue estudiar el efecto del ejercicio intenso y moderado sobre la función ventricular basal sistólica y diastólica y su respuesta al estímulo β-adrenérgico, así como también sobre variables histológicas que pueden modificar el remodelamiento ventricular post ejercicio. Para estudiar el efecto de la sobreestimulación simpática, utilizamos un modelo de ratón transgénico con sobreexpresión específica cardíaca de la proteína Gsα, que tiene la característica particular de inducir un estado de hiperactividad simpática, que se traduce en aumento de la frecuencia cardíaca y de la contractilidad. En este estudio, se utilizaron dos líneas de ratones machos de 3 meses de edad, una cepa normal no transgénica (noTG) y otra de ratones transgénicos (TG) con la característica mencionada. Se utilizó un protocolo de natación, por ser un tipo de ejercicio mixto, y fue realizado de forma grupal para generar un nado intenso y constante a lo largo del tiempo de protocolo. Se utilizaron dos intensidades de ejercicio, uno intenso (90 minutos de nado dos veces al día, 6 días a la semana por 4 semanas) y otro moderado (90 minutos de nado una vez al día, 6 días a la semana por 4 semanas). Por lo tanto, se realizaron 6 grupos experimentales: 2 grupos control sedentario (noTG y TG), 2 grupos con ejercicio intenso (noTG y TG) y 2 grupos con ejercicio moderado (noTG y TG). Una vez finalizados los protocolos, se realizó la evaluación de la función ventricular “in vivo” e “in vitro" basal, sistólica y diastólica, como así también de la reserva miocárdica (con isoproterenol). Posteriormente a la eutanasia de los animales, se calcularon los índices de hipertrofia, se realizó el análisis histológico del colágeno intersticial (colorimetría), la densidad capilar (inmunomarcación), el área de los miocitos (fluorescencia) y la expresión de la proteína Akt (western blot). Los resultados obtenidos mostraron que la función ventricular evaluada en condiciones basales estuvo conservada para ambas intensidades de ejercicio. Sin embargo, se observó una importante disminución en los animales noTG con ejercicio intenso, de la reserva miocárdica no sólo inotrópica, sino también cronotrópica y lusitrópica en el ejercicio intenso tanto “in vivo” como “in vitro", a diferencia del moderado, que no tuvo modificaciones significativas respecto al sedentario. Fue interesante observar que la realización del ejercicio intenso en los animales TG con la hiperactividad simpática, atenuó significativamente la alteración deletérea de la reserva miocárdica, sugiriendo un posible efecto benéfico. Desde el punto de vista estructural, no se detectó la presencia de fibrosis en ninguno de los grupos experimentales, mientras que la densidad capilar estuvo significativamente aumentada en los animales con ejercicio moderado, sin modificación significativa con el ejercicio intenso. El área de los miocitos, al igual que los índices de hipertrofia, aumentaron en los dos grupos de ejercicio intenso y se observó levemente aumentado aunque no significativamente en el grupo noTG con ejercicio moderado. Esta variable no se modificó en el grupo de ratones TG. Finalmente, la expresión de la proteína Akt no mostró cambios en ninguno de los 6 grupos experimentales. Por lo menos en nuestro conocimiento, no fue mostrado previamente que el ejercicio intenso puede inducir una marcada reducción de la reserva miocárdica no sólo inotrópica sino también cronotrópica y lusitrópica. Estas limitaciones al aumento no sólo de la contractilidad, sino también al llenado ventricular y al aumento de la frecuencia cardíaca podría limitar severamente la capacidad funcional miocárdica de pacientes que realizan esta intensidad de ejercicio. Por otro lado, también detectamos, que la hiperactividad simpática asociada al ejercicio, podría ser una herramienta útil para atenuar esta disfunción miocárdica. Con los datos obtenidos en el presente estudio no podemos afirmar si la hipertrofia inducida por el ejercicio intenso en nuestras condiciones experimentales es del tipo fisiológica o patológica. La severa disminución de la reserva miocárdica, si bien es compatible con un tipo de hipertrofia no adaptativa o patológica, no alcanza para definir qué tipo de hipertrofia induce esta intensidad de ejercicio, ya que por otro lado, otras variables como la ausencia de fibrosis o la conservación de la densidad capilar, sugieren una hipertrofia adaptativa. La falta de modificación de la proteína Akt, relacionada con la hipertrofia fisiológica, tampoco permite llegar a una conclusión definitiva. Debido a la originalidad de los resultados obtenidos, es importante continuar con las líneas de investigación relacionadas con el ejercicio para esclarecer los interrogantes que surgen del presente estudio. Finalmente, sería interesante continuar la investigación con diversos grupos de mayor cronicidad de ejercicio y de desentrenamiento, buscando la reversibilidad de la hipertrofia y de la disminución de la reserva contráctil encontrada tanto “in vivo” como “in vitro", para determinar la naturaleza de la hipertrofia desarrollada. El campo de investigación en el ejercicio tiene importantes proyecciones debido a estudios recientes en deportistas de alto rendimiento, como así también en la sobrevida de enfermedades cardiovasculares y del sedentarismo.

En Saladillo, Pcia de Buenos Aires, se realizó un estudio de los efectos que produce un emprendimiento de engorde a corral (feedlot) sobre el agua freática, bajo suelos Hapludoles característicos de la zona. Se realizaron mapas equipotenciales de nivel freático por estación, entre invierno de 2015 y otoño de 2016 y por prospección geoeléctrica, se determinó un gradiente de conductividad eléctrica que sigue la dirección de flujo de la freática, aumentando en el tiempo, aguas abajo de los corrales. Se realizaron análisis de concentraciones de nitratos, fósforo, conductividad eléctrica, sólidos totales disueltos, pH, y oxígeno disuelto, y también bacteriológicos en muestras obtenidas del agua subterránea. Si bien la concentración de nitratos no supera los límites establecidos de 45 ppm, por el CAA para agua potable, los análisis bacteriológicos la caracterizan como no potable, con presencia de Pseudomonas y E. coli por lo que podría significar un riesgo de salud, tanto para humanos como para el ganado. El fósforo presenta concentraciones elevadas respecto al valor que establece la EPA como límite superior de 0.1 ppm, con el objetivo de disminuir la eutrofización de aguas superficiales. En los pozos de la zona de descarga del agua, los valores de concentraciones de fósforo superan ampliamente el límite máximo recomendado. Este comportamiento lo tuvo también el agua superficial del bajo lindante a los corrales, donde fluye el agua por escorrentía. Los mapas realizados por el método de kriging, señalan una estacionalidad de los aportes de iones, de manera desfasada con la cantidad de animales manejados en los corrales. Por lo que se infiere que tipo de suelo, con un Bt nátrico, actuaría como amortiguador de dichos aportes, siendo la ZNS un reservorio de iones, demostrado, por la prospección geoleléctrica.

En el presente trabajo se estudia la influencia del medio ambiente en el que se encuentran las galaxias sobre su formación y evolución, a través de la interacción entre la galaxia y el gas caliente y difuso del medio intracúmulo (intracluster medium, ICM). Las galaxias en cúmulos pueden moverse a velocidades casi supersónicas, experimentando una considerable presión dinámica ejercida por el ICM sobre el medio interestelar de la galaxia en movimiento. Este efecto se denomina ram pressure stripping (RPS), y puede remover una fracción significativa del contenido de gas frío de la galaxia. Implementamos este proceso dentro de un modelo híbrido de formación de galaxias, que combina simulaciones hidrodinámicas no disipativas de cúmulos de galaxias con un modelo semianalítico de formación y evolución de galaxias que contempla los procesos físicos que afectan a los bariones. Para ello fue necesario desarrollar un método para calcular los tamaños de los discos galácticos, teniendo en cuenta los efectos del halo de materia oscura anfitrión y la presencia de bulbos galácticos. Una importante innovación respecto a trabajos anteriores es el uso de las partículas de gas de las simulaciones hidrodinámicas para obtener las propiedades cinemáticas y termodinámicas del ICM, logrando así un método autoconsistente. Caracterizamos las distribuciones de RP obtenidas con nuestro nuevo modelo para cúmulos de galaxias simulados de distintas masas, encontrando que la RP media crece con la masa del cúmulo y la edad del Universo. Los perfiles de RP en función de la distancia al centro del halo obtenidos con nuestra nueva implementación pueden aproximarse mediante perfiles analíticos, con parámetros que dependen de manera sencilla de la masa del halo y el corrimiento al rojo. Los ajustes determinados serán de gran utilidad para incluir RPS en otros modelos de formación de galaxias. Finalmente, cuando se considera la posibilidad de que las galaxias conserven su halo de gas caliente al convertirse en satélites, mostramos que la implementación de RPS como un proceso de dos etapas, afectando en primer lugar al halo de gas caliente y luego al gas frío, permite obtener una distribución de colores para las galaxias simuladas en mejor acuerdo con las observaciones, resolviendo un defecto común a los modelos semianalíticos actuales.

Existen dos zonas neurogénicas en el cerebro adulto. Una es la zona subventricular que da origen a interneuronas del bulbo olfatorio y otra es la zona subgranular del giro dentado del hipocampo que genera células granulares (CGs). Las CGs nacidas en animales jóvenes se desarrollan y maduran por varias semanas, durante las cuales establecen conexiones funcionales aferentes y eferentes, adquiriendo la capacidad de procesar información. Para estudiar de qué manera este proceso es alterado por la edad se marcaron células progenitoras neurales (CPNs) de ratones de distintas edades con la proteína fluorescente verde y se analizó su morfología a distintos tiempos post-inyección, obteniéndose así las curvas de maduración para neuronas nacidas en en distintos momentos. A partir de este análisis se pudo observar que a medida que avanza la edad, la tasa de maduración se ralentiza, notándose un mayor efecto en las primeras semanas del desarrollo de estas neuronas. A medida que el ratón envejece presenta niveles decrecientes de actividad basal del giro dentado que correlaciona con un desarrollo neuronal más lento. A pesar de dicho retraso, experimentos de electrofisiología demostraron que estas neuronas son capaces de integrar un estímulo excitatorio y disparar potenciales de acción de modo comparable a la de neuronas nacidas en el animal adulto joven. Para comprender las bases del efecto del envejecimiento en el desarrollo neuronal se plantearon diversas manipulaciones experimentales para modular su tasa de maduración. En primer lugar se sometió a los ratones envejecidos a ejercicio voluntario y se observó que este tratamiento aceleró la maduración neuronal en animales envejecidos, con efectos más dramáticos en animales más viejos. Los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se encuentran disminuidos en hipocampos de animales envejecidos, y los hipocampos de ratones corredores presentan mayores niveles de BDNF comparados con los sedentarios, indicando un posible efecto de este factor neurotrófico en el desarrollo neuronal de ratones envejecidos que realizan ejercicio físico. Para determinar si un efecto de aceleración de la maduración puede estar relacionado con la propia actividad eléctrica de las neuronas en desarrollo, se utilizó la transducción retroviral de receptores sintéticos acoplados a proteína G para activarlas en forma intrínseca. Esta manipulación también revirtió el efecto provocado por el envejecimiento. Para investigar el rol del BDNF en el desarrollo neuronal de animales envejecidos se utilizó la técnica de ARN de interferencia (short hairpin ARN) para Lrig1, un modulador negativo de la vía de BDNF. Se observó un aumento en el efecto dendritogénico en las CGs que sobreexpresan el shLrig1 en animales envejecidos. Esto sugiere un rol clave de la vía del BDNF en el desarrollo neuronal. Estos resultados demuestran que tanto la actividad del nicho neurogénico como la propia actividad de la célula cumplen un rol crucial en la tasa de maduración de las CGs. Palabras claves: Envejecimiento, neurogénesis adulta, desarrollo neuronal, plasticidad neuronal, ejercicio voluntario, actividad neuronal, BDNF.

A medida que envejece, el cerebro de los mamíferos sufre modificaciones bioquímicas, estructurales y funcionales que disminuyen la plasticidad de sus circuitos. Estos cambios han sido propuestos como responsables del déficit cognitivo y del aumento en la incidencia de las enfermedades neurodegenerativas que se presentan con la edad. El giro dentado del hipocampo cuenta con una forma de plasticidad singular dada por la producción de nuevas neuronas granulares a lo largo de toda la vida. Mediante transducción retroviral con proteínas reporteras y/o transgenes relacionados con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer se logró utilizar a estas neuronas como vehículo para monitorear los efectos del envejecimiento normal y patológico sobre la plasticidad neuronal. Utilizando inmunofluorescencia y microscopía confocal en ratones wild type envejecidos y en transgénicos modelando la enfermedad de Alzheimer pudimos observar que, aunque el número de neuronas generadas disminuye a lo largo de la vida, estas no se ven afectadas en su migración ni en la densidad de los contactos sinápticos aferentes que desarrollan durante el envejecimiento normal o patológico. Por otro lado, combinando registros electrofisiológicos con análisis morfológico encontramos que la expresión autónoma de célula de diferentes variedades de la proteína precursora de amiloide (APP) altera transitoriamente la forma en que estas neuronas se conectan al circuito del giro dentado. Llamativamente, este efecto parecería no estar mediado por el péptido β amiloide, sino por algún dominio contenido en el extremo C-terminal de APP. En conjunto estos resultados estarían indicando que a pesar de la diversidad de los cambios que se presentan en el cerebro durante el envejecimiento y la neurodegeneración, las neuronas granulares que se desarrollan en el giro dentado bajo tales circunstancias pueden incorporarse anatómica y funcionalmente al circuito. Sin embargo, la dinámica con que se da esta integración se ve afectada por la sobreexpresión de APP en forma autónoma de célula. Alteraciones sutiles como esta podrían subyacer a las manifestaciones cognitivas iniciales encontradas en la enfermedad de Alzheimer.

En el presente tabajo de Tesis se evaluaron las consecuencias de las interacciones de los lipopolisacáridos (LPS) y de los péptidos formilados de las bacterias Gram negativas sobre la activación de distintas funciones celulares involucradas en el desencadenamiento de la respuesta inflamatoria a la infección. En particular, se analizaron los efectos de estos dos componentes bacterianos sobre la activación del estallido respiratorio y la producción de TNF-α en células fagocíticas humanas. Los resultados presentados en este trabajo demuestran que para una más precisa interpretación de los procesos inflamatorios causados por bacterias Gram (-) se debe tener en cuenta el desencadenamiento de la cascada de eventos en respuesta a los distintos componentes bacterianos. Así, los LPS y los péptidos formilados, presentes en la circulación sanguínea desde el comienzo de la infección pueden inducir el incremento o la disminución de distintas funciones celulares llevadas a cabo por los neutrófilos y por las células mononucleares periféricas, dependiendo en la secuencia en que estos agonistas entran en contacto con las células. Aquí, se demuestra que el fMLP, un péptido formilado prototipo, cuando interacciona con las células antes que el LPS, es capaz de ejercer un efecto inhibitorio de las funciones celulares relacionadas con el metabolismo oxidativo y además bloquea la secreción de TNF-a. Esta observación. que en principio resulta paradójica, dado que el fMLP es un potente agente quimiotáctico que contribuye al proceso inflamatorio reclutando células en el foco infeccioso, sugiere la existencia de mecanismos de regulación que controlarían la intensidad y la duración de la inflamación. Estos hechos señalan un rol dual del fMLP, demostrando su capacidad de actuar como un agente antinflamatorio, bajo determinadas condiciones. Estos estudios sugieren que los mecanismos a través de los cuales el fMLP ejerce este rol estarían relacionados con la alteración del desencadenamiento de eventos intracelulares y/o transduccionales. En este trabajo se demuestra, además que la generación de intermediarios reactivos del oxígeno (IRO) está involucrada en la producción de TNF-α. El uso de agentes secuestradores de radicales libres permitió establecer la participación de los radicales OH en la producción de TNF-α mediada por células mononucleares, no así en la mediada por PMN, hecho que indica la existencia de distintos mecanismos involucrados en la producción de esta citoquina en los diferentes tipos celulares. Teniendo en cuenta que, el TNF-α es un mediador central responsable de los fenómenos patofisiológicos observados en los cuadros sépticos, la regulación de su producción mediante el uso de secuestradores de IRO, se presenta como una herramienta potencial, con actividad coayuvante, en el tratamiento de los fenómenos sépticos provocados por bacterias Gram (-).

La expansión de la frontera agrícola ha involucrado un notable incremento en el uso de biocidas en la Argentina. En este trabajo nos propusimos evaluar los impactos del glifosato (N-fosfonometilglicina, PMG) sobre dos especies no blanco: Cnesterodon decemmaculatus y Odontesthes bonariensis. Los resultados obtenidos indicarían que el PMG (en su forma ácida y grado analítico) no presenta un nivel significativo de toxicidad letal aguda (CL50-96h > 100 mg.L-1) para C. decemmaculatus. Sin embargo, la toxicidad de un formulado de PMG resultó notablemente mayor (CL50-96h = 29 mg.L-1). Al evaluar efectos subletales en esta especie, la exposición aguda a PMG provocó un aumento en la actividad de catalasa (defensas antioxidantes) e inhibición de la actividad de acetilcolinesterasa (biomarcador de neurotoxicidad). Por otra parte, la exposición crónica al formulado produjo una disminución significativa en la Carga Energética de Adenilatos (CEA) en hígado y músculo de O. bonariensis, manifestando efectos a nivel del metabolismo energético. Las branquias de estos animales, examinadas por MEB, mostraron alteraciones en su ultraestructura. Por último, se estudió el efecto de la exposición al formulado sobre la motilidad espermática y el desarrollo embrionario y larval de O. bonariensis, estableciéndose un aumento de la mortalidad de las larvas. Los resultados de este trabajo constituyen una contribución a los estudios sobre los efectos del glifosato en peces de agua dulce, así como a la evaluación y desarrollo de biomarcadores de estrés ambiental.