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El trabajo experimental presentado en esta tesis se realizó con el objeto de investigar el efecto que ejerce la ciclofosfamida (CF) sobre dos funciones de importancia como mecanismos inmunes citotóxicos: la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA)y la fagocitosis específica. Estas funciones dependen de la expresión y actividad de receptores para el fragmento Fc de IgG (RFcγ). El tratamiento de ratones BALB/c con una única dosis de 200 mg/kg de Cf induce un incremento muy significativo en la capacidad para mediar CCDA de las células esplénicas y en la actividad fagocítica de macrófagos y leucocitos polimorfonucleares del exudado peritoneal. El efecto de la Cf es dependiente de la dosis inoculada desapareciendo a dosis de 20 mg/kg. La actividad litica de los esplenocitos va aumentando paulatinamente desde el día de la inoculación de la droga y alcanza su pico maximo al septimo día post-tratamiento; luego, los porcentajes de CCDA disminuyen en forma gradual hasta llegar a valores normales alrededor del día 20. Fn el caso de 1a fagocitosis, el pico de incremento se alcanza al día siguiente del tratamiento y desciende gradualmente, normalizándose hacia el día 13 post-inoculación. Los hazos de animales tratados con CF poseen porcentajes de células con RFcγ similares a los bazos normales, por lo tanto se descarta que haya habido un enriquecimiento en celulas efectoras de 1a CCDA por efecto de la droga. La exacerbación de la capacidad para mediar CCDA o fagocitosis no se debe al incremento en la avidez del RFcγ , ya que cuando se sensibilizan las células "blanco" con cantidades decrecientes de anticuerpos, se observa que tanto las células normales como las tratadas disminuyen su actividad en forma parecida. El análisis de la cinética de la reacción de CCDA indica que las células de los animales tratados con Cf ejercen su actividad citotóxica a mayor velocidad que los esplenocitos normales. El efecto de la Cf para incrementar la CCDA se lleva a cabo, no sólo sobre células de bazo, sino también sobre leucoitos mononucleares y polimorfonucleares de sangre periférica y células del exudado peritoneal. El esquema de tratamiento con Cf utilizado en estos trabajos provoca la supresión de la producción de anticuerpos aglutinantes contra glóbulos rojos de carnero, juntamente con el aumento de la hipersensibilidad retardada hacia el mismo antígeno. La exacerbacíón de la fagocitosis inducida por la Cf y por agentes inflamatorios parecen mediarse a través de mecanismos distintos. Por un lado, el tratamiento con Cf no incrementa el número de células peritoneales como lo hacen las sustancias inflamatorias, Por otro lado, los esplenocitos tratados con tioglicolato no muestran aumento en su capacidad citotóxica. Los resultados presentados aportan datos para una mejor comprensión de los mecanismos regulatorios que modulan la actividad de células con RFcγ. Además, estos trabajos describen un efecto, hasta ahora desconocido de la Cf, como es la exacerbación de sistemas inmunes citotóxicos.

El objetivo de este trabajo surgió de la observación de que la progesterona tiene efectos antifibromatogénicos en cobayos y en el hombre. Se evaluó el efecto de la progesterona y del acetato de medroxiprogesterona (MPA) sobre el crecimiento de un fibrosarcoma murino tanto in vivo como in vitro. También se estudió su efecto sobre la inducción de sarcomas originados por la implantación subcutánea de un cuerpo extraño. (cilindro de vidrio). In vivo, los resultados obtenidos demuestran que el MPA disminuyó la incidencia tumoral cuando se lo inoculó junto con el transplante de fibrosarcoma. Cuando el tratamiento hormonal se comenzó días después del inóculo tumoral no hubo efecto sobre su crecimiento. Se obtuvieron resultados similares con un transplante de una leucemia linfoblástica mientras que no se observó una disminución en la incidencia tumoral con un carcinoma epidermoide indiferenciado. In vitro, también se demostró que los fibroblastos tanto embrionarios como tumorales fueron más sensibles a concentraciones altas (10-5 - 10-4M) de progestágenos que las células epiteliales que constituyen las líneas celulares WISH y HELA. Sobre fibroblastos normales y tumorales la progesterona no sólo tuvo un efecto citostático sino que también por encima de 10-4M se observó un efecto citolítico. Con MPA sólo se pudo evaluar el efecto citostático ya que no se pudieron obtener concentraciones superiores a 7x10-5M. Este efecto fue específico para fibroblastos ya que las células WISH no se inhibieron aún con las altas concentraciones de hormona. En base a la alta concentración de la hormona se postula una acción directa, no mediada por receptores sobre las células tumorales tanto in vivo como in vitro. En cuanto al efecto del MPA sobre la tumorigénesis por cuerpo extraño, se observó una disminución en la incidencia de sarcomas inducidos por la implantación subcutánea de un cilindro de vidrio. Esta disminución fue más evidente cuando se inoculó la hormona en la vecindad del cuerpo extraño que en el flanco contralateral; en el primer caso no sólo disminuyó la incidencia tumoral sino que también fue menor el ritmo de aparición de los sarcomas. Se postula que el efecto inhibidor del MPA sobre la inducción de sarcomas se debería a una disminución en la fibrosis que rodea al cuerpo extraño. Un resultado inesperado, pero de gran relevancia debido al uso indiscriminado de esta hormona, fue la aparición de adenocarcinomas en hembras portadoras de cilindro de vidrio y tratadas con MPA ya sea in situ o en el flanco contralateral. Se puede concluir que si bien los progestágenos tienen un efecto antifibromatogénico, su administración prolongada pude llevar al desarrollo de adenocarcinomas.

Los progenitores endoteliales poseen un enorme potencial terapéutico debido a su papel crucial en la formación de vasos sanguíneos de novo, a través de un proceso denominado vasculogénesis. Entre ellos, las células formadoras de colonias endoteliales (CFCE) poseen todas las características de un verdadero progenitor endotelial y son capaces de formar nuevos vasos in vivo. Aun así, teniendo en cuenta la limitada disponibilidad de progenitores endoteliales en sangre periférica y el hecho de que en pacientes con riesgo cardiovascular el número y/o función de los progenitores endoteliales se encuentran enormemente reducidos, en la actualidad se impulsa el desarrollo de nuevas estrategias para optimizar la expansión y diferenciación de estos progenitores ex vivo y por ende los resultados terapéuticos con fines regenerativos.Una característica común a diversas condiciones patológicas donde la formación de nuevos vasos ocurre activamente, como la isquemia, el daño tisular por traumas, quemaduras u otras heridas, es la presencia de un microambiente inflamatorio ácido. Previamente demostramos que la acidosis induce apoptosis de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+). Considerando que las CFCE son una subpoblación de las células CD34+ y que tienen un papel clave en la vasculogénesis, nuestro objetivo fue investigar el efecto de la acidosis en la sobrevida y funcionalidad de estos progenitores.Las CFCE fueron obtenidas por diferenciación de células CD34+ humanas de sangre del cordón umbilical o de sangre periférica en un medio de crecimiento endotelial EGM2 durante 14-18 días. El medio de cultivo fue acidificado por adición de un volumen precalculado de HCl isotónico (1N) y el preacondicionamiento se logró mediante la exposición de los progenitores a EGM2 ajustado a pH 7.4, 7.0 y 6.6, que luego fue reemplazado por EGM2 fresco ajustado a pH fisiológico (7.4).Nuestros resultados mostraron que la acidosis no indujo apoptosis de las CFCE y, aunque inicialmente se observó una reducción en sus funciones, una vez que el pH fue restaurado a valores de 7.4, varias respuestas angiogénicas de las CFCE aumentaron significativamente. Este procedimiento, conocido como preacondicionamiento ácido, ejerció un efecto proangiogénico máximo a las 6 horas de exposición a pH 6.6. In vitro, mejoró significativamente la proliferación de las CFCE, su adhesión a células endoteliales activadas y a componentes de la matriz extracelular, la quimiotaxis mediada por SDF1 y la formación de túbulos. In vivo, incrementó su capacidad regenerativa en un modelo de isquemia de miembro inferior, disminuyendo el grado de inflamación local y aumentando el número de vasos sanguíneos en el músculo gastrocnemio. El efecto proangiogénico del preacondicionamiento ácido fue similar en progenitores endoteliales tardíos derivados de sangre periférica, sugiriendo que esta estrategia es efectiva en células adultas que pueden ser utilizadas en trasplantes autólogos. Por otro lado, los beneficios del preacondicionamiento ácido no fueron observados en células endoteliales maduras de micro y macrovasculatura.Los mecanismos involucrados en el efecto proangiogénico de la acidosis incluyeron la activación de las vías de señalización AKT y ERK1/2 y la inhibición de la quinasa p38. Más aun, la supresión farmacológica de ERK1/2 y AKT suprimió el aumento en la proliferación inducido por el pH ácido, mientras que el inhibidor de p38 incrementó la tubulogénesis a pH 7.4 y potenció el incremento observado a pH 6.6. En cuanto a la adhesión celular, la quinasa de adhesión focal (FAK) se encontró activada en las CFCE preacondicionadas.Además, demostramos que el preacondicionamiento ácido es una estrategia efectiva en condiciones de estrés e inflamación, ya que protegió a los CFCE de la acción citotóxica de moléculas elevadas en el microambiente inflamatorio isquémico como los cristales de urato monosódico, las histonas extracelulares y el TNFα, así como también del efecto antiangiogénico del TNFα en condiciones normales y de alta glucosa.En conclusión, en el presente trabajo de tesis demostramos que el preacondicionamiento ácido representa una estrategia efectiva para optimizar la expansión ex vivo de CFCE, las cuales resultan más resistentes a condiciones adversas, típicamente presentes en pacientes con enfermedades cardiovasculares como la inflamación y la alta glucosa, y con un mayor potencial terapéutico.

Los espermatozoides de la cola epididimal pueden ser recuperados, congelados y almacenados para su posterior uso. La ciopreservación es una biotecnología reproductiva de gran importancia para ser utilizada en animales en vías de extinción. El objetivo del este trabajo de tesis fue estudiar diferentes modificaciones en los protocolos de congelación de espermatozoides felinos con el fin de introducir mejoras para aumentar la supervivencia espermática al descongelado. La hipótesis fue que la incorporación de disacáridos, detergentes y amidas a un diluyente Tris base provocará un efecto benéfico en la viabilidad espermática al descongelado. El trabajo de tesis se dividió en nueve experimentos. Se diseñaron 8 experimentos con el fin de evaluar el efecto sobre la supervivencia espermática al descongelado de la adición de dimetilformamida, SDS, trealosa o una combinación de estos componentes a un diluyente Tris base. Se diseñó un experimento en el cual se realizaron estudios ultramicroscópicos con el fin de estudiar el impacto protector de los diluyentes sobre la célula espermática. En los resultados de los experimentos 1-8 del plan podemos observar que con el agregado de disacáridos o amidas al diluyente Tris base no se mejoró la congelabilidad de los espermatozoides felinos. Sin embargo, se observó un efecto protector sobre los espermatozoides al agregar un detergente y al combinar un detergente y un disacárido al diluyente de congelación. En el experimento dirigido a estudiar la ultramicroscopía de los espermatozoides criopreservados, se observaron los daños ultramicroscópicos generados durante el proceso de congelación-descongelación en los espermatozoides felinos. Podemos concluir que en felinos, el agregado de detergente solo o en combinación con disacáridos al diluyente Tris base mejora la viabilidad espermática al descongelado. Así mismo el estudio ultramicroscopico permitió cuantificar y localizar los daños ocurridos durante el proceso de congelación-descongelación.

Tesis (Maestría en Reproducción Bovina) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias ; Instituto de Reproducción Animal Córdoba, 2017

En el presente estudio se plantearon los siguientes objetivos: 1) Evaluar los efectos de la administración de un progestágeno de larga acción en la reproducción del gato doméstico, mediante evaluaciones clínicas, endocrinológicas e histológicas. 2) Describir el desarrollo de las glándulas uterinas desde el período prenatal hasta la pubertad en la misma especie. 1) Veinticuatro felinos neonatos fueron asignados a los siguientes tratamientos: acetato de medroxiprogestrona 10mg sc (AMP; n=12) o placebo (PLC; n=12). Se realizó el seguimiento hasta la pubertad, cuando se realizaron pruebas de fertilidad. Posteriormente los gatos fueron castrados para la evaluación histológica gonadal. 2) Veinticuatro úteros desde el último tercio de la gestación hasta la pubertad fueron evaluados histológicamente y se realizaron pruebas de inmunohistoquímica utilizando el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA). 1) Siete gatas ovularon y quedaron preñadas (4/6 AMP y 3/4 PLC; p>0,1) y diez gatos resultaron fértiles (5/6 AMP y 5/6 PLC; p>0,1) sin diferencias en los tratamientos. Tampoco se observaron diferencias significativas en la histología gonadal entre los grupos (p>0,1). El área ocupada por glándulas y la altura del epitelio uterino de las gatas AMP no difirió del grupo PLC (p>0,1). Cuatro de las seis gatas AMP presentaron hiperplasia endometrial y 1/6 desarrolló una piometra. 2) Aunque los úteros prenatales no presentaron ninguna indicación de adenogénesis uterina se observó alta proliferación celular tanto del epitelio luminal como del estroma. La adenogénesis comenzó la semana 1 como una incipiente invaginación del epitelio luminal cilíndrico simple. Durante la semana 2 se incrementó la invaginación del epitelio hacia el estroma y fue posible observar un grado leve de tubulogénesis. De semana 3 a la 5 la tubulogénesis fue más marcada a lo largo del borde del epitelio luminal y comenzaron a observarse cortes transversales de pequeñas glándulas rudimentarias por debajo del epitelio. De la semana 8 y hasta el final del estudio se observó un incremento en la profundidad y ramificaciones de las glándulas. Del presente estudio se concluye que el AMP no altera ni la histología ni la función reproductiva en esta especie y que la adenogénesis uterina comienza durante la primer semana de vida y finaliza de la quinta a la octava semana posnatal.

La lidocaína puede ejercer efectos neuroprotectores sobre el sistema nervioso cuando se la administra por diferentes vías. Sin embargo, muy poco se sabe acerca de sus efectos luego de la administración intraparenquimatosa en la médula espinal. La excitotoxicidad es un proceso considerado fundamental para la progresión de las lesiones después de una injuria de la médula espinal. El ácido kaínico, es un reconocido agente excitotóxico que emula la liberación patológica de glutamato. Los objetivos del presente trabajo de tesis fueron determinar tanto si la inyección intraparenquimatosa de diferentes concentraciones de lidocaína en la médula espinal de rata ocasiona alteraciones tisulares y/o funcionales, como también, si la lidocaína ejerce efectos protectores/preventivos contra la excitotoxicidad desencadenada por el ácido kaínico. Para determinarlo, se utilizó un modelo experimental de rata, previamente validado. En una primera etapa, se inyectaron diferentes concentraciones de lidocaína, por vía intraparenquimatosa, en la médula espinal. Una vez determinada una concentración que no produjo alteraciones histológicas ni funcionales, se procedió a la segunda etapa, donde la inyección de lidocaína a la concentración establecida se llevó a cabo tanto en forma simultánea como posterior (por vía intraparenquimatosa e intra-Cisterna Magna, respectivamente) a la inyección del ácido kaínico. Se evaluaron las funciones motoras y sensitivas de los animales en diferentes días establecidos durante el experimento, y luego de la eutanasia, se evaluaron las alteraciones histológicas del segmento C5 mediante histoquímica, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. La menor concentración de lidocaína inyectada (0,5 %) no produjo daño aparente sobre la médula espinal. Más aun, al ser inyectada simultáneamente con el ácido kaínico redujo significativamente todas las lesiones ocasionadas por dicho agente excitotóxico. Por lo tanto, la lidocaína podría considerarse como un fármaco neuroprotector en modelos en los que la excitotoxicidad es el principal mecanismo de lesión.

La agriculturización y la estructura del paisaje pueden alterar la calidad del servicio de polinización a nivel de comunidad. Para evaluar esta premisa, se compararon áreas agriculturizadas con áreas recuperadas tras la supresión prolongada de la agricultura, en tres sitios de la región pampeana sujetos a diferentes manejos agronómicos e inmersos en paisajes de diferente nivel de estructura. En cada sitio se relevaron las plantas entomófilas, se capturaron sus visitantes florales, y se cuantificaron diversos aspectos de la interacción entre ambos gremios mutualistas. Para evaluar el servicio de polinización se describieron las redes planta-visitante floral y las redes de transporte de polen, y se cuantificó la deposición de polen sobre los estigmas. Además se evaluó de qué manera estas variables son afectadas por el grado de complejidad del paisaje circundante. Cuando el manejo agronómico predominante fue la agricultura, las redes de interacciones de los fragmentos agriculturizados tuvieron menor riqueza de visitantes florales que las de los recuperados, mientras que bajo ganadería se encontró mayor riqueza de plantas entomófilas en los fragmentos agriculturizados que en los recuperados. Las redes planta-polinizador de los fragmentos recuperados resultaron más especializadas que las de los agriculturizados. En fragmentos recuperados los visitantes florales transportaron mayor cantidad de granos de polen que en los agriculturizados, y el polen de plantas exóticas superó al de las nativas. Sin embargo, no se encontraron diferencias entre tipos de fragmentos en la magnitud del servicio de polinización agriculturizados la calidad del servicio (deposición de polen heteroespecífico sobre el estigma)fue menor. Finalmente, se encontró que la estructura del paisaje modula de manera diferencial el servicio de polinización y la riqueza de plantas y visitantes florales.

Trabajo Final (Especialización en Producción de Cultivos Extensivos)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2015.

Tesis para obtener el grado de Maestría en Horticultura, presentada en la Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo en 2016