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Las similitudes morfológicas y fenotípicas entre los carcinomas mamarios más frecuentes en mujeres (carcinomas ductales, positivos para los receptores de estrógenos (ER) y progesterona (PR)), y el modelo de carcinomas mamarios murinos inducidos con acetato de medroxiprogesterona (MPA), hacen de este modelo una herramienta útil para estudiar los mecanismos celulares asociados al tratamiento antitumoral con agentes endocrinos (antagonistas del ER y PR), e inhibidores de quinasas, entre otros. En este trabajo de Tesis hemos evaluado en el modelo de carcinomas mamarios inducidos con MPA, mecanismos tempranos de regresión tumoral asociados al tratamiento endocrino con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) y el inhibidor de PI3K wortmanin (WORT). En vista de la evidencia clínica actual, que demuestra que la combinación de agentes endocrinos e inhibidores de la vía PI3K/Akt resulta beneficiosa para el tratamiento adyuvante de pacientes con tumores ER y PR positivos, y de los estudios que señalan a los antiprogestágenos como una terapia válida para el tratamiento del cáncer de mama, creemos que este trabajo resulta valioso ya que constituye el primer estudio realizado en un modelo experimental de cáncer de mama en donde se evalúan los efectos de la terapia combinada de antiprogestágenos e inhibidores de PI3K. Analizando variantes tumorales que representan distintos estadios dentro de la progresión del cáncer de mama (desde la hormono-dependencia a la resistencia endocrina), comprobamos que los agentes MFP y WORT poseen mecanismos diferenciales de acción, tanto en el parénquima como en el estroma tumoral. Dichos mecanismos posibilitan en ciertas variantes que la combinación de ambos sea más efectiva que el tratamiento con cada droga por separado, y que en otras variantes, en cambio, la combinación no sea beneficiosa. De acuerdo a la creciente importancia que ha adquirido el microambiente tumoral tanto en la regulación del crecimiento de los tumores como en la respuesta a las terapias, demostramos que en algunas de las variantes analizadas el estroma tumoral juega un papel activo durante la regresión inducida por el tratamiento endocrino y por la inhibición de PI3K. Los resultados obtenidos en el modelo experimental plantean la posibilidad de que la expansión del compartimiento estromal que se asocia tempranamente con la regresión de los tumores (fenómeno definido como reacción estromal), actúe como un indicador de la eficacia de la terapia antitumoral utilizada. Hemos demostrado también que el modelo de cultivo tridimensional en Matrigel es una herramienta eficaz para evaluar in vitro la sensibilidad diferencial de las células epiteliales derivadas de las variantes tumorales a los distintos agentes ensayados, lo que apoya el uso de este sistema para predecir el comportamiento de las células neoplásicas frente a distintos compuestos antitumorales. En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen al estudio de la terapia endocrina del cáncer de mama, presentando evidencia que se suma a los trabajos que plantean el uso de los antiprogestágenos en el tratamiento de esta patología, y demostrando por primera vez el beneficio potencial, para determinado grupo de tumores, de una terapia combinada de antiprogestágenos con inhibidores de vías de señalización como la vía PI3K/Akt.

Armando, N. G. (2021). Caracterización de los mecanismos celulares y componentes moleculares involucrados en la señalización y el tráfico del CRHR2α en entornos neuronales. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

En Argentina, la podredumbre húmeda del capítulo, causada por el patógeno necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una enfermedad que provoca serias mermas en la producción y tiene una incidencia anual promedio sobre la producción de la pampa húmeda del 10-20%. Los síntomas de la enfermedad se manifiestan al final de la etapa de floración o durante el llenado de granos por lesiones en el receptáculo que pueden extenderse y afectar todo el capítulo, produciendo la caída del mismo. En estados avanzados de podredumbre, se forman esclerocios, estructuras de resistencia del hongo, que pueden permanecer en los tejidos o en suelo y mantenerse viables por más de 8 años constituyendo el inóculo para futuras infecciones. La resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol es compleja, habiéndose detectado varios loci de carácter cuantitativo (QTL) específicos de línea, órganos y condiciones ambientales de crecimiento. Dicha complejidad ha limitado el desarrollo de germoplasma resistente por medio del mejoramiento clásico, reforzando la necesidad de la utilización de herramientas genómicas que incluyan tanto marcadores neutros para el mapeo de QTL como el desarrollo de marcadores funcionales desarrollados sobre genes candidatos para la resistencia al patógeno. El conocimiento de los factores determinantes de la patogénesis y las respuestas de defensa del hospedante constituyen factores claves para la identificación de dichos genes candidatos. Uno de los aspectos más destacados del mecanismo de invasión de S. sclerotiorum es la degradación de la pared celular, siendo el ácido oxálico producido por el patógeno uno de los determinantes de la patogénesis, a través de la acidificación y el secuestro de Ca^2+ de la pared celular del tejido hospedante. Asimismo, el ácido oxálico ejerce una regulación dual de la producción de especies reactivas de oxigeno (ROS). Por un lado, en los primeros estadios de la infección el ácido oxálico induce la generación de ROS y la inducción de una muerte celular programada (PCD) en una marera dependiente del pH generando un ambiente favorable para el desarrollo del patógeno, la adquisición de nutrientes y el establecimiento de la relación necrotrófica. Por el otro lado a medida que la infección progresa y al ácido oxálico se acumula en los tejidos del hospedante, el pH disminuye acompañado de la inhibición del estallido oxidativo y la PDC provocando así la muerte celular pero de una manera necrotrófica. En el presente trabajo se abordó el análisis del perfil metabólico primario, el perfil transcripcional de genes candidatos y los perfiles hormonales de dos líneas de girasol con comportamiento contrastante frente a la infección producida por S. sclerotiorum (HA 89 susceptible y RHA801 moderadamente resistente). Aplicando un método de estudio de perfiles metabólicos basado en la técnica de GC/MS, fue posible detectar diferentes patrones involucrando 63 metabolitos entre ellos azucares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y algunos metabolitos secundarios en flores de girasol que constituyen el órgano principal de infección de este patógeno. Los análisis estadísticos paramétricos y multivariados mostraron diferencias metabólicas entre estos dos líneas, así como también efectos de interacción entre línea y los días post inoculación. Los análisis de correlación de redes sugieren que estos cambios metabólicos están sincronizados en una manera dependiente del tiempo en respuesta al patógeno. Se detectaron mayor cantidad de cambios metabólicos diferenciales en la línea susceptible que en la resistente, esto se evidencia en el mayor número de interconexiones que presenta la línea susceptible entre los módulos de metabolitos formados por compuestos pertenecientes a las mismas vías. Por otro lado, la línea resistente muestra mayor interconexión entre metabolitos pertenecientes a las mismas vías. La evaluación de estos datos también demuestra una regulación línea específica de las distintas vías metabólicas, sugiriendo la importancia de detección de patrones metabólicos, en lugar de cambios específicos de metabolitos individuales, cuando se buscan marcadores metabólicos que responden diferencialmente a la infección der patógenos. Por otra parte el análisis de patrones de actividad de enzimas claves del metabolismo primario del carbono (sacarosa sintasa y las invertasas de pared celular, citológica y vacuolar), foto-respiración (catalasa) y del metabolismo de los fenilpropanoides (fenilalanina-amonio-liasa-PAL), mostró también diferencias entre líneas a tiempos tempranos del proceso de infección. La actividad catalasa presentó un aumento significativo en la línea resistente, que indicaría una regulación diferencial de la fotorespiración frente a la infección del patógeno, disminuyendo el nivel de ROS. Para la identificación de nuevos genes candidatos involucrados en la resistencia a este patógeno se construyeron colecciones de ADNc basadas en la técnica SSH de flores de girasol inoculadas y no inoculadas a partir de una línea resistente a los 2 y 4 días post inoculación. Esta estrategia dio como resultado la obtención de secuencias diferencialmente expresadas entre las flores inoculadas y no inoculadas. La mayoría de estos genes están involucrados en los procesos de traducción de proteínas, en los procesos de óxido reducción entre los cuales se encuentra un gran número de genes de respuesta a estreses biótico y abiótico, numerosos genes involucrados en el metabolismo primario. Del mismo modo, también se detectó un alto porcentaje de secuencias sin similitud con secuencias disponibles en bases de datos, sugiriendo que podrían codificar para genes no descriptos previamente, involucrados en la respuesta del girasol frente a este patógeno. De las clonotecas generadas se seleccionó un conjunto de genes para validar su comportamiento por qRT-PCR. De este conjunto, los genes quitinasa, un elemento de respuesta a etileno y el factor de transcripción WRKY7 mostraron patrones de expresión diferenciales entre las muestras inoculadas y controles a los distintos días post inoculación, sugiriendo que estos genes se encuentran involucrados en la respuesta del girasol frente a S. sclerotiorum. Asimismo se identificó un número importante de genes asociados a defensa a patógenos que se expresan en altos niveles en flores de girasol de la línea resistente aún en condiciones control, sin inoculación con el patógeno. Se estudiaron los perfiles hormonales para el ácido salicílico y para el ácido jasmónico por medio de la técnica LC-ESI-MS/MS. Estos estudios corroboraron que el ácido salicílico no contribuye a la resistencia contra S. sclerotiorum y que además se acumula en los tejidos infectados por este hongo, particularmente en la línea susceptible. A su vez, estos estudios demostraron que el jasmónico estaría asociado a la resistencia frente a este patógeno en las flores de girasol de la línea resistente. La integración del análisis de perfiles metabólicos, transcripcionales y perfiles hormonales contribuyó a una mejor comprensión de los cambios en el metabolismo en los capítulos de girasol durante los primeros estadios de la infección facilitando la identificación de genes y vías metabólicas involucradas en la respuesta al patógeno necrotrófico S. sclerotiorum. Asimismo la identificación de cambios en perfiles metabólicos y transcripcionales de genes candidatos, entre líneas resistentes y susceptibles, posibilita el desarrollo de biomarcadores metabólicos y marcadores funcionales para su aplicación en el mejoramiento asistido del cultivo de girasol.

El receptor huérfano de tipo tirosina quinasa, ROR1, se expresa y cumple diversas funciones durante el desarrollo embrionario, mientras que en la adultez, su expresión en los tejidos normales es baja o nula. Sin embargo, se ha descripto que ROR1 se expresa abundantemente en diversos tipos de tumores y leucemias. A su vez, ROR1 actúa como un receptor celular de Wnt5a, un ligando extracelular que ha sido implicado en la tumorigénesis. Es por esto que decidimos determinar la expresión y participación de ROR1 en los procesos celulares y moleculares implicados en la progresión de melanoma. Nuestros resultados indican que ROR1 se expresa en líneas celulares y muestras tumorales de melanoma humano, y que su expresión se asocia con una menor sobrevida postrecurrencia de los pacientes. Empleando estrategias de pérdida y ganancia de función determinamos que ROR1 favorece el crecimiento celular, tanto de manera dependiente como independiente de un sustrato sólido. A su vez, ROR1 disminuye la adhesión y aumenta la motilidad y migración de las células de melanoma. Estos procesos son mediados, en parte, a través de la regulación positiva de la vía de Akt y del aumento de la expresión de los marcadores mesenquimales N-cadherina y vimentina. La regulación de N-cadherina depende tanto de la presencia de ROR1 como de la activación de la vía de Akt. En conclusión, demostramos que ROR1 contribuye a la progresión de melanoma y constituye un posible nuevo marcador pronóstico y blanco terapéutico.

Tesis (Doctora en Neurociencias) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Fil:Bilenca, David Norberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis para obtener el grado de Máster en Agroecología, de la Universidad Internacional de Andalucía, en 2007

Tesis para obtener el grado de Doctor en Veterinaria, de la Universidad de Córdoba (España), en 2000

La presencia de mutaciones en el gen que codifica al supresor tumoral p53 constituye una de las alteraciones genéticas más frecuentes en el cáncer. La mayoría de dichas mutaciones son del tipo missense, lo que conduce a la expresión abundante de proteínas mutantes de longitud completa. Las mutantes de p53 no solo pierden la función de supresor tumoral, sino que también pueden adquirir nuevas actividades que promueven la progresión tumoral. A pesar de las evidencias que demuestran que p53 mutante aumenta la agresividad tumoral, los mecanismos que subyacen a esta actividad han sido poco caracterizados. Un aspecto notable de muchas mutantes puntuales de p53 es su capacidad de alterar la expresión génica, aún cuando la mutación anula su capacidad de actuar como un factor de transcripción. Con el fin de comprender en mayor profundidad este fenómeno, en el presente trabajo de tesis estudiamos la relación entre la familia de p53 y la expresión de ICMT, identificado por nuestro grupo como un gen inducido por p53 mutante. ICMT juega un papel clave en la regulación de proteínas preniladas, catalizando la carboximetilación del extremo C-terminal. A pesar de las crecientes evidencias que sugieren que las alteraciones en la red de proteínas preniladas pueden afectar la progresión tumoral, la regulación de este complejo proceso de modificación post-traduccional y el papel específico de ICMT no se comprenden completamente. Nuestro trabajo revela un vínculo entre el procesamiento posterior a la prenilación y la vía de p53. Descubrimos que los miembros de la familia p53 afectan la expresión de ICMT de diferentes maneras. Las proteínas relacionadas con la supresión tumoral, como p53 wild type (wt) e isoformas TAp63 y TAp73, mostraron un efecto negativo sobre la expresión de ICMT, lo que sugiere que este gen está bajo una regulación precisa en células normales. Por el contrario, la expresión de ICMT se vio potenciada por los mutantes puntuales de p53, lo que apoya la noción de que el estado de p53 afectaría los niveles de ICMT durante la progresión tumoral. A su vez, demostramos que la sobreexpresión de ICMT contribuye con fenotipos agresivos in vitro e in vivo. Además, encontramos una correlación entre el estado de p53 y la expresión de ICMT en pacientes con cáncer de mama y pulmón. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la interrelación funcional entre los miembros de la familia p53 y las formas mutantes de p53 aumenta los niveles de ICMT durante la tumorigénesis, y de esta forma, coopera con la activación de mecanismos de agresividad tumoral.

Una de las estrategias terapéuticas actuales contra el cáncer está orientada a mejorar la efectividad de los fármacos anticancerígenos existentes mediante el desarrollo de sistemas innovadores de transporte [13,14] que permitan modificar las características farmacocinéticas y de biodistribución de los principios activos. En esta línea, recientemente desarrollamos una nanoestructura micelar compuesta por monosialoglicoesfingolípidos (GM1) capaces de transportar fármacos hidrofóbicos (Ptx) y anfipáticos (Doxo) con alta eficiencia [80,81]. En este trabajo se planteó modificar estas micelas mediante la incorporación de una molécula de reconocimiento celular, con el objetivo de focalizar la acción citotóxica del fármaco vehiculizado hacia las células tumorales. Se evaluó la incorporación de moléculas de reconocimiento celular como el ácido fólico, anticuerpos, espermidina y lipoproteínas en las micelas de GM1, se caracterizaron las estructuras resultantes y se determinó la actividad farmacológica de las micelas modificadas. Algunas de las estructuras obtenidas, como GM1-espermidina y GM1-LDL mostraron diferencias significativas respecto a las micelas de GM1 en la internalización de fármacos frente a líneas tumorales in vitro. En el caso de GM1-IgG, si bien los resultados de actividad biológica in vitro de los fármacos vehiculizados no mostraron diferencias respecto al efecto de los mismos fármacos transportados en micelas de GM1 sin anticuerpos, se demostró que los anticuerpos forman complejos estables con las micelas, mantienen su capacidad de reconocimiento específico y no son desplazados por otras proteínas plasmáticas. Esto permite proponer al complejo GM1-IgG/fármaco como un sistema mixto, en el cual se puede combinar la acción efectora de los anticuerpos con el efecto biológico de los fármacos. Finalmente, se demostró que moléculas pequeñas como el ácido Fólico (AF) pueden ser incorporadas en la estructura micelar aplicando diferentes estrategias. En las condiciones evaluadas, las micelas modificadas con AF no revelaron diferencias significativas de actividad respecto a las micelas de GM1 frente a células tumorales RF positivas. El conjunto de resultados presentados en este trabajo nos permiten concluir que es posible modificar las micelas de GM1 con moléculas de reconocimiento celular de diferente naturaleza, posibilitando el diseño de micelas funcionales con características adecuadas para aplicaciones farmacológicas.