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La presencia de Mn en aguas subterráneas para consumo humano causa problemas de orden estético y de aceptabilidad, organolépticos, operativos y sanitarios. Los métodos empleados para la remoción de Mn en el agua subterránea se pueden clasificar en: fisico-químicos y biológicos. En estos últimos, el Mn contenido en el agua es oxidado y precipitado con la ayuda de bacterias ambientales que suelen aparecer en forma natural en las aguas subterráneas que contienen Mn. Sin embargo, en estos procesos se alcanza una óptima remoción de Mn únicamente cuando los sistemas contienen comunidades bacteriana apropiadas, es decir, bacterias oxidantes de Mn y formadoras de biofilm.En este trabajo, se evaluaron los microbiomas de dos plantas de tratamiento biológico de aguas subterráneas que actualmente eliminan Mn(II) con alta eficiencia. Por otro lado, se cultivó un gran número de MOB conocidos y varios aislamientos que nunca antes se habían informado como MOB. La cepa MOB-181 del género Pseudomonas, se destacó de las demás por mostrar características de interés. La misma estuvo presente en el sistema de filtración de LT representando alrededor del 4 % del total de las Pseudomonas y pudo cultivarse con facilidad en el laboratorio. Asimismo, demostró buena capacidad de oxidación de Mn(II) en diferentes medios de crecimiento analizados; a diferentes temperaturas; y en presencia de metales inhibidores como el Fe y el propio Mn en altas concentraciones. Resultó ser una excelente formadora de biofilms y pudo oxidar Mn(II) presente en agua cruda mientras estuvo inmovilizada sobre arena. El estudio del rendimiento de la oxidación de Mn(II) de diferentes MOB aisladas en este trabajo permitió postular a MOB-181 como el mejor candidato con potencial para el desarrollo de un inóculo bacteriano aplicable para mejorar el proceso de eliminación de Mn(II) de aguas subterráneas.La oxidación de Mn y la formación de biofilms son dos características deseables para la elección de cepas con potencial uso en los procesos de remoción de Mn de aguas. A fin de determinar si estos dos procesos están relacionados en las MOB, se aplicaron ensayos de morfología de macrocolonia en agar y crioseccionamiento/microscopía para tratar de comprender la oxidación de Mn y la producción de EPS in situ en el modelo de biofilm de macrocolonia. Mediante el simple modelo de biofilm de macrocolonia, se pudo visualizar a los biofilms como sistemas biológicos complejos, donde los distintos grupos celulares están influenciados por un montón de factores, resultando en grupos de células diferentes dependiendo del entorno en el cual se encuentran.Finalmente, se construyó un sistema de filtros a escala laboratorio donde se evaluó la funcionalidad de la inoculación de filtros con MOB-181 en la remoción de Mn del agua. Se demostró que un ensayo de bioaumentación con esta bacteria fue capaz de acelerar el inicio de la remoción de Mn en aguas naturales. Asimismo, se observó que los tiempos requeridos para alcanzar la fase estacionaria de la remocion estaban fuertemente influenciados por las temperaturas, alcanzando más rapido la mayor eficiencia a temperaturas más altas. Estos resultados se utilizarán para optimizar los procesos de remoción de Mn de aguas y para el diseño de mejores tecnologías.

La exposición a contaminantes ambientales conocidos como perturbadores endocrinos altera el desarrollo y función del sistema endocrino afectando a diversas especies. Ciertos perturbadores endocrinos imitan las acciones de estrógenos y se denominan xenoestrógenos. En nuestro trabajo estudiamos los xenoestrógenos, bisfenol A, endosulfán y atrazina. Para el monitoreo de la contaminación ambiental y la evaluación de los efectos de los contaminantes, es importante una adecuada selección de especies centinelas y biomarcadores. El Caiman latirostris (yacaré overo) se encuentra ampliamente distribuido en el noroeste argentino y se utiliza en programas de rancheo. El yacaré posee características ecológicas y fisiológicas que lo convierten en potencial organismo centinela de exposición a xenoestrógenos. Dichas características permiten identificar y seleccionar posibles biomarcadores de exposición a contaminantes con actividad estrogénica. Los xenoestrógenos pueden alterar el desarrollo e histoarquitectura de gónadas, y los perfiles hormonales, aportando potenciales biomarcadores para evaluar en los yacarés. La vitelogenina es una proteína precursora sintetizada en hígado de vertebrados no mamíferos e inducida por acción de estrógenos. La detección de vitelogenina en plasma de yacarés macho podría se utilizada como una herramienta muy importante para el monitoreo de exposición a xenoestrógenos ambientales. Los biomarcadores evaluados en esta tesis resultaron herramientas útiles para determinar actividad estrogénica in vivo. Los estudios realizados permiten mejorar el conocimiento de la biología reproductiva del yacaré y caracterizar biomarcadores para monitorear exposición a xenoestrógenos en diferentes momentos de la vida de los caimanes. Las evidencias obtenidas apoyan la utilidad de Caiman latirostris como centinela de contaminación por xenoestrógenos.

Tesis (Magister en Ciencias Agropecuarias. Mención Producción Animal)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2007.

Fil:Pardo, Patricia Susana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El objetivo del presente trabajo de Tesis fue caracterizar las células stem tumorales de melanoma cutáneo, en particular si las células obtenidas luego del tratamiento con inhibidores de la vía de MAPK presentan características de células stem tumorales. En primer lugar se analizó la expresión de CD271 y CD133, marcadores de células stem tumorales de melanoma, en líneas celulares de melanoma humano y en biopsias de pacientes de melanoma metastásico y se encontró que la expresión de los mismos no permite identificar una población con características de células stem tumorales. Con el objetivo de enriquecer en células con características stem tumorales, y considerando que entre las propiedades que se le atribuyen a esta población se encuentra la resistencia a drogas, se estudió el efecto del tratamiento prolongado con inhibidores de BRAF (PLX4032) y MEK (GDC-0973) en líneas celulares de melanoma que presentan la mutación BRAF V600 y son sensibles a estos inhibidores. Se encontró que luego del tratamiento in vitro con los inhibidores PLX4032 y GDC-0973 durante varias semanas, la mayoría de las células moría pero algunas permanecían viables y quiescentes. Se denominó a esta población celular SUR. Al discontinuar el tratamiento, las células SUR retomaron su crecimiento y mantuvieron una sensibilidad a los inhibidores similar a las células parentales. Las células SUR presentan elevados niveles de expresión de los marcadores de células stem tumorales CD271 y ABCB5, pero no de CD133, y presentan características asociadas a senescencia, como la actividad de -galactosidasa. Las células SUR retienen su capacidad tumorigénica, ya que son capaces de generar tumores en ratones inmunodeficientes. Para caracterizar a la población de células SUR en profundidad se realizaron experimentos de secuenciación del exoma y del transcriptoma, además de microarreglos de expresión y microarreglos de proteínas. Las células SUR son lisadas de forma eficiente por linfocitos T citotóxicos que reconocen los antígenos de diferenciación melanocítica MART-1 y gp100. Proponemos la adquisición de un fenotipo con características de células stem tumorales como un mecanismo de resistencia plástico a los inhibidores de BRAF y MEK.

El objetivo general de este trabajo fue estudiar diferentes aspectos de la compleja interacción entre genotipos bacterianos definidos y caracterizados como de alta y baja adaptación a la glándula mamaria (GM) con el hospedador, para poder comprender en parte, el establecimiento y cronicidad de las infecciones intramamarias (IIM) causadas por Staphylococcus aureus en bovinos. Se seleccionó la cepa 806 transitoria (T), cap8, icaACD, agrII, fuerte productora de biofilm, pulsotipo D, ST350 y poco invasiva en células epiteliales mamarias (MAC-T); y la cepa 5011 persistente (P), cap5, icaACD, agrI, blaZ, débil productora de biofilm, pulsotipo O, CC188 y altamente invasiva. La cepa P presentó mayor sobrevida intracelular en MAC-T y macrófagos. MAC-T infectadas con ambas cepas murieron por apoptosis, induciendo la cepa P mayores porcentajes de muerte. Los macrófagos infectados con la cepa P mostraron mayor capacidad fagocítica. La producción de especies reactivas de oxígeno y de óxido nítrico (ON) fue similar para ambas cepas. Los resultados de la IIM experimental difirieron entre ambas cepas, la T indujo aumento del recuento de células somáticas (RCS), ON, IL-1β, IL-6 e IgG total en leche a las 48 hs post-infección (pi); en sangre, indujo una disminución de los monocitos, linfocitos T y CD8. La cepa P, indujo un aumento del RCS a los 7 días pi y del ON 14 días pi. La combinación de factores de virulencia de S. aureus podría determinar el inicio de la interacción patógeno-hospedador e influenciar la respuesta inmune de la GM y la evolución del proceso infeccioso.

Fil:Engel, Juan Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (MCI Mención Recursos Hídricos)--FCEFN-UNC, 2015

Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son los mediadores de las respuestas celulares a una gran cantidad de estímulos, así como también el blanco de muchas drogas terapéuticas. El rol clásico de los GPCRs es acoplar la unión de ligandos a la activación de proteínas G heterotriméricas, que a su vez regulan a múltiples proteínas efectoras. Recientemente se ha demostrado que los modos de señalización de los GPCR son mucho más complejos, involucrando también mecanismos independientes de proteínas G y señalización dependiente de la internalización del receptor. La hormona liberadora de corticotropina (CRH) ejerce un rol clave en la respuesta integrada al estrés. Además de regular la activación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), CRH está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central, donde funciona como un neuromodulador, integrando aspectos comportamentales y afectivos de la respuesta a estrés. Se ha demostrado que la desregulación de la acción de CRH a través de su receptor de alta afinidad, CRHR1, se encuentra involucrada en el desarrollo de estadios patológicos asociados al estrés como ansiedad y depresión. CRHR1 es un GPCR de clase B, que al activarse principalmente se acopla a proteína Gs y lleva a un aumento del segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) y la activación de múltiples vías de señalización. Es de particular interés la fosforilación de la MAPK ERK1/2, que induce la transcripción de Pomc para activar el eje HPA en corticotrofos, y se dispara en estructuras del cerebro asociadas a aspectos comportamentales de la respuesta a estrés frente a la estimulación con CRH. Habíamos descripto previamente que CRHR1 activa mecanismos de señalización dependientes de proteína G y otros dependientes de la endocitosis del receptor. Estos dos componentes de respuesta pueden evidenciarse como dos fases diferentes de activación de ERK1/2 en la línea celular hipocampal murina HT22 transfectada establemente con CRHR1 (HT22-CRHR1). En este trabajo, nos focalizamos en la respuesta de cAMP mediada por CRHR1, utilizando métodos clásicos de biología molecular en combinación con biosensores basados en la transferencia de energía resonante de Förster (FRET) para estudiar por visualización dinámica de célula única los mecanismos de señalización de CRH. En primer lugar demostramos que al estimular CRHR1, el aumento en los niveles de cAMP no sólo está mediado por las adenilil ciclasas transmembrana (tmACs) sino también por una adenilil ciclasa soluble (sAC) en las células HT22-CRHR1. sAC es una fuente atípica de cAMP ya que es insensible a proteína G y es regulada por calcio y bicarbonato. Además, se ha reportado que sAC está presente en distintas localizaciones subcelulares, formando microdominios de señalización. La respuesta de cAMP a CRH también se encontró mediada tanto por tmAC como por sAC en la línea celular derivada de corticotrofos AtT20, pero no así en las células 3T3L1-CRHR1. Sin embargo, observamos que tanto en células HT22-CRHR1 como en AtT20, sAC no participa en la señalización de otros ligandos de GPCRs, como isoproterenol o PACAP38, respectivamente. Estos resultados indican que el rol de sAC en la transducción de señales de un GPCR depende del contexto celular y del receptor involucrado. La estimulación con CRH genera un aumento en los niveles de calcio intracelular, y al bloquear la respuesta de calcio se observó un patrón de cAMP y ERK1/2 en respuesta a CRH similar al que se obtiene al bloquear sAC. Esto sugiere que calcio es el activador de sAC río abajo de CRHR1. Luego, nos propusimos caracterizar si ambas fuentes de cAMP contribuyen a un pool común de cAMP o si pueden identificarse roles particulares para cada adenilil ciclasa en la respuesta. Observamos que tanto tmACs como sAC participan en la fase aguda de activación de ERK1/2, pero que en la fase sostenida de fosfo-ERK1/2, dependiente de la internalización de CRHR1, sólo sAC está involucrada. Más aún, demostramos que el CRHR1 continúa generando cAMP desde estaciones endocíticas, y que es sAC la responsable de esta producción una vez internalizado CRHR1. En conclusión, a través de la caracterización de los mecanismos moleculares activados por CRHR1, se hallaron nuevas evidencias que refuerzan el modelo emergente de señalización por GPCR en el que la respuesta de cAMP no ocurre exclusivamente a nivel de la membrana plasmática y donde sAC representa una fuente alternativa de cAMP regulada por GPCRs.

A pesar de la importancia del proceso de fertilización, es aún muy escasa la información disponible acerca de las moléculas involucradas. Las evidencias de nuestro laboratorio indican que las proteínas de la familia CRISP, miembro de la superfamilia CAP, serían claros mediadores del proceso de interacción de gametas. Teniendo en cuenta que las CRISP se expresan principalmente en el tracto reproductor masculino, el primer objetivo de esta Tesis ha sido investigar si las mismas también se expresan en el tracto reproductor femenino y cumplen un rol en el proceso de fertilización. Los resultados obtenidos utilizando los modelos de rata y ratón indicaron que mientras CRISP1 se encuentra presente en útero, oviducto, ovario, y células del cúmulus, CRISP2 se detecta sólo en ovario, y CRISP4 no se expresaría en el tracto de la hembra. Ensayos de fertilización in vitro utilizando espermatozoides y COC (complejos ovocito-cúmulus) provenientes de ratones knockout para CRISP1 indicaron que la proteína presente en el cúmulus cumpliría una función en el proceso de fertilización. Estudios posteriores revelaron que CRISP1 exhibe propiedades quimioatractantes hacia los espermatozoides, sugiriendo que éste podría ser el mecanismo por el cual CRISP1 del cúmulus participa en el proceso de fertilización. Dada la gran homología entre las CRISP y las GLIPR1, las cuales constituyen las dos familias mejor caracterizadas de la superfamila CAP, el segundo objetivo de este trabajo consistió en estudiar la presencia de proteínas GLIPR1 en el tracto reproductor masculino y su participación en la fertilización. Los resultados indicaron la expresión de GLIPR1L1 a nivel testicular y de GLIPR1L2 tanto en testículo como en epidídimo de ratón. La generación de ambas proteínas en forma recombinante y de sus correspondientes anticuerpos confirmó la presencia de las mismas en el espermatozoide y su participación específica en la primera etapa de unión a la zona pellucida. La información obtenida acerca del rol de las proteínas CRISP y GLIPR1 contribuirá a una mayor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la interacción de gametas como así también al desarrollo de futuros métodos de regulación de la fertilidad tanto en animales como en el humano.