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Los perturbadores endocrinos (PE) son sustancias que alteran las funciones del sistema endocrino provocando efectos adversos en la salud de un organismo intacto o su progenie. Bisfenol A (BPA), es un PE liberado de selladores odontológicos, envases de bebidas y alimentos. En roedores, la exposición prenatal a BPA produjo efectos profundos y duraderos en tejidos hormonodependientes. La exposición a dosis bajas de BPA durante períodos críticos de organogénesis/diferenciación genera cambios histomorfológicos en la glándula mamaria (GM) que modificarían la regulación endocrina y aumentarían la susceptibilidad a un carcinógeno químico. Ratas Wistar preñadas fueron expuestas a BPA (25 o 250 μg/kg/día) o vehículo. Sub-grupos de crías hembras recibieron una dosis subcarcinogénica de NMU en día postnatal (DPN) 50. Se obtuvieron muestras de suero y GM de crías hembras sacrificadas en DPN 30, 50, 110 ó 180. La exposición prenatal a BPA modificó la histoarquitectura de la GM, promovió el desarrollo de lesiones pre-neoplásicas y aumentó la susceptibilidad carcinogénica frente a NMU administrado finalizada la exposición. La exposición prenatal a BPA indujo, en la GM de ratas ciclando, respuesta fibrosa en el estroma asociada con reclutamiento de mastocitos, promovió angiogénesis y repuestas mediadas por REalfa. La exposición prenatal a dosis bajas, ambientalmente relevantes de BPA puede aumentar el riesgo de desarrollar tumores mamarios. Estos resultados enfatizan la implicancia de adhesión al “Principio de Precaución” respecto a contaminación ambiental con PE y refuerzan conceptos que asocian esta evidencia a la mayor incidencia de tumores hormonodependientes en humanos en las últimas décadas.

La Fibrosis Quística es la más frecuente de las enfermedades humanas severas, de origen genético, en la población caucásica (Welsh MJ, 1995). Se produce por mutaciones en un único gen, que codifica para el canal de Cl- CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)(Kerem et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989). Aún no ha sido establecida una relación clara entre el defecto genético y los mecanismos que gobiernan esta enfermedad. Todas las citoquinas proinflamatorias que han sido estudiadas en el ambiente inflamatorio de los pulmones FQ [factor de necrosis tumoral (TNF-α), interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6 (IL-6) e interleuquina-8 (IL-8)] están elevadas y la concentración de la citoquina antinflamatoria interleuquina-10 (IL-10) está considerablemente reducida (Khan et al., 1995). A su vez, la IL-1β regula la expresión del CFTR (Cafferata E G A, 2001; Cafferata et al., 2000). Por otro lado, las proteínas proinflamatorias TNF-α, IL-1β y IL-6 regulan positivamente los genes de las mucinas muc2 y muc5 (Dohrman et al., 1998) e incrementan la quimioatracción de neutrófilos (Ohishi, 2000) que liberan gran cantidad de proteínas, especies reactivas de oxígeno y NO, que pueden causar daño celular. Entonces, es posible que genes diferencialmente regulados por IL-1β tengan una participación en los mecanismos que llevan a la muerte celular, la exacerbación de los procesos inflamatorios o la acumulación de mucinas en el tracto respiratorio FQ. Con el fin de identificar nuevos intermediarios en la vía de señalización de IL-1β, o de identificar genes que tuviesen una regulación similar al CFTR, se realizó un "Differential Display" sobre las células T84 tratadas con distintas concentraciones de IL-1β. Se aisló un gen regulado por dicha citoquina, que poseía el mismo patrón de modulación que el CFTR. La banda aislada fue clonada y secuenciada. La misma mostró una homología del 99% con otras del banco de datos que codificaban para proteínas cuya actividad es desconocida. A este gen diferencial se lo denominó hsccl (Homo sapiens T84 colon carcinoma cell line IL-1beta regulated mRNA 1). Por el análisis de la secuencia completa del ARNm se determinó que hscc1 contiene dominios que se hallan conservados en la familia de las proteínas transportadoras. Mediante "Northern blots" se observó una doble banda correspondiente a 3,5 kb, que mostraba un máximo de activación cuando las células fueron tratadas con 0,5 ng/ ml de IL-1β. Por otro lado, la expresión de hscc1 se inhibió a concentraciones de IL-1β mayores a 1 ng/ml. La IL-1β induce al factor de transcripción NF-κB cuando se encuentra presente en el medio de cultivo a una concentración de 0,5 ng/ml (Cafferata E G A, 2001), mientras que con 2,5 ng/ml de IL-1β se inducen los factores c-jun y c-fos, pero no NF-κB. Usando un virus que sobre-expresa a un dominante negativo de NF-κB, se determinó que la inducción de este factor es necesaria para que se produzca el aumento en la expresión de hscc1 por IL-1β, en forma similar a lo que ocurre con CFTR. Por otro lado, el inhibidor de proteína quinasa C, GF109203X (Battle et al., 1998) y los inhibidores de proteína quinasas de tirosina Genisteína (Rao et al., 1997) y Herbimicina A (Taylor et al., 1997), bloquearon la inducción mediada por IL-1β, sugiriendo que estas proteína quinasas estan también involucradas en el camino de transducción de la señal de IL-1β. Otro objetivo de este trabajo fue identificar genes cuya expresión fuese dependiente de la actividad del CFTR, con el fin de determinar cuales eran las funciones celulares dependientes del canal CFTR y de identificar factores que contribuyesen a la deficiencia pulmonar en fibrosis quística. Realizamos un "Differencial Display" usando células de epitelio de traquea fibroquística (CFDE) y las mismas células transfectadas con el CFTR normal (CFDE/6RepCFTR). Aislamos e identificamos un ARNm de expresión diferencial que codifica para la quinasa de tirosina c-Src. Este mensajero se encontró sobre-expresado en las células CFDE. Cuando las células CFDE/6RepCFTR fueron tratadas con el inhibidor del canal CFTR NPPB, los niveles del ARNm c-Src se elevaron. Es decir, la actividad del canal CFTR sería necesaria para la regulación de c-src. Asimismo, los análisis de la proteína c-Src por inmunohistoquímica mostraron que ésta se encuentra elevada en los pulmones FQ. La fibrosis quística se caracteriza por la acumulación de mucus que obstruye los conductos de distintos órganos (Hutchison and Govan, 1999). A su vez, este aumento en la producción de mucinas puede hacer a los enfermos más susceptibles de sufrir infecciones pulmonares por Pseudomonas aeruginosa (Parmley and Gendler, 1998). Se sabe que MUC1 se encuentra elevada en el colon de los ratones FQ, pero los ratones FQ que no producen MUC1 (ratones "knock out" para MUC1) tienen una obstrucción intestinal mucho menor. Además, a c-Src se la ha involucrado en la producción de mucinas en respuesta a diversas injurias (Bausbaum et al., 1999). Era posible entonces que el aumento de c-Src inducido por la falla en CFTR fuese responsable de la acumulación de mucus. Para corroborar esta hipótesis, se midió la expresión de la MUC1. Esta fue encontrada elevada en células CFDE respecto de las células CFDE/6RepCFTR. Además, cuando las células CFDE fueron tratadas con un dominante negativo o con un inhibidor de c-Src (PP2) los niveles de MUC1 disminuyeron. Estos resultados indican que c-Src estaría involucrada en el camino de señalización que lleva el aumento de MUC1. Estos datos sugieren, además, que la falla en el CFTR produciría un incremento en la expresión de MUC1 en el sistema respiratorio y que esto ocurre previamente a la infección pulmonar. En consecuencia, la quinasa c-Src podría ser el nexo entre la falla del CFTR y la acumulación de mucinas en fibrosis quística.

La enfermedad quística ovárica (COD) constituye uno de los principales desórdenes reproductivos en vacas lecheras. La etiopatogenia de la COD es un proceso complejo que involucra disfunción en la foliculogénesis y en la ovulación, postulándose un desequilibrio neuroendócrino a nivel del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal como hipótesis más aceptada, aunque en la persistencia folicular también intervienen factores intraováricos. En la presente Tesis nos propusimos examinar la localización y expresión de receptores de las hormonas gonadotróficas, de los receptores de hormonas esteroides y de las proteínas correguladoras en las estructuras foliculares del ovario de vacas con COD en comparación con las estructuras de los ovarios de las vacas controles. Los resultados evidenciaron una baja expresión del ARNm de RFSH y RLH en las células foliculares de los folículos quísticos espontáneos. Asimismo, dichas estructuras mostraron una mayor expresión del ARNm de RE alfa y una menor expresión del RE beta. Los quistes foliculares también mostraron una fuerte expresión del ARNm de RA en granulosa. Así, un incremento significativo fue observado en la isoforma b del RP en granulosa de los folículos quísticos. Además, la inmunomarcación de REA, SMRT y SRC-3 mostraron diferencias entre animales controles y animales con COD inducida. Un patrón diferencial del ARNm de SRC-1, SRC-2 y SRC-3 fue demostrado en los folículos quísticos. Los resultados obtenidos sugieren que pequeños cambios y/o alteraciones en los mecanismos de transcripción y/o regulación de los receptores de hormonas esteroides y gonadotrópicas; y de las proteínas correguladoras podrían ser cruciales en la patogenia de esta enfermedad.

Para que se produzcan procesos de proliferación celular, tanto en tejidos normales como tumorales, es necesaria la presencia de vasos sanguíneos. La formación de estos se realiza a través de un complicado proceso denominado angiogénesis y es estimulado fundamentalmente por el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), que es el más específico y potente, tanto para la angiogénesis como para la vasculogénesis. La aparición de una neoplasia ocurre como consecuencia de una alteración en el ciclo celular normal que lleva a una proliferación excesiva, y teniendo en cuenta que, uno de los aspectos críticos para el desarrollo de tumores sólidos es la formación de una fuente de irrigación sanguínea, tanto el conocimiento del crecimiento tisular como el de los procesos involucrados en la angiogénesis son fundamentales para enfrentar una de las principales causas de muerte en el hombre y en los animales domésticos, el cáncer. Por otro lado en la regeneración hepática, la formación de nuevos capilares a partir de la microvasculatura existente es un requerimiento fundamental, lo que convierte al hígado remanente a una hepatectomía parcial, en un excelente modelo experimental para estudiar algunos de los mecanismos involucrados en la cronobiología de la angiogénesis. En el presente trabajo de tesis se analiza la evolución de la expresión del VEGF, la síntesis de ADN y la actividad mitótica (AM) a lo largo de un periodo circadiano en los hepatocitos del ratón macho adulto durante la regeneración hepática y el efecto que ejerce la portación de un tumor maligno sobre dichos índices. Se utilizaron 252 ratones machos adultos que fueron sometidos a una hepatectomía parcial, la mitad de los cuales fueron además injertados con un tumor maligno. Estos animales se usaron para la realización de 3 experimentos: 1) estudio de la expresión del VEGF en ratones hepatectomizados portadores y no portadores del tumor; 2) estudio de la ADNs en ratones hepatectomizados portadores y no portadores del tumor y 3) estudio de la AM en ratones hepatectomizados portadores y no portadores del tumor. En cada experimento, los ratones fueron divididos en lotes de 6 a 8 animales y sacrificados cada 4 horas a lo largo de un período circadiano desde las 26 hasta las 50 horas poshepatectomía. En todos los casos se tomaron muestras de la porción triangular del lóbulo derecho del hígado que fueron procesadas con las técnicas histológicas adecuadas según los experimentos diseñados. Tanto para la detección de la expresión del VEGF como para la ADNs se utilizaron técnicas inmunohistoquímicas y para la evaluación de la AM se utilizó H-E. A partir de los registros individuales se estableció el índice de expresión del VEGF, ADNs y AM expresado en porcentaje. A partir de estos índices individuales se calculó la media aritmética ± error estándar de cada lote y de cada grupo. Estos datos se analizaron estadísticamente mediante el análisis de varianza (Anova), en caso de que las diferencias fueran significativas se realizó el Test de Tuckey. Los resultados correspondientes a los ratones hepatectomizados no portadores muestran la existencia de curvas circadianas tanto para la expresión del VEGF con un valor máximo a las 08/46 (hora del día/hora poshepatectomía) de 2.6±0.1; en la ADNs con un valor máximo a las 16/30 de 3.4±0.3 y en la AM cuyo valor máximo se produjo a las 12/50 de 2.3±0.01. La presencia del tumor injertado ES2 genera cambios detectables en las curvas circadianas de la expresión del VEGF, en la ADNs y AM de los animales hepatectomizados, provocando modificaciones en la distribución espacial y temporal de los valores correspondientes a los mismos. El valor máximo de expresión del VEGF se encontró a las 16/30, 8 horas después (00/38) se observó el de ADNs. Por su lado el valor máximo de AM se produjo 8 horas más tarde al mismo a las 08/46. Finalmente, se puede concluir que los factores de crecimiento producidos por las células del tumor maligno ES2, de ratones machos de la cepa C3HS hepatectomizados que son liberados a la circulación general, podrían reconocer al tejido regenerante con una alta tasa proliferativa como una metástasis y serían entonces los responsables de alterar el microambiente del tejido hepático determinando de esta forma cambios en la cronobiología de la síntesis de ADN, de la actividad mitótica y de la expresión del VEGF.

La enfermedad quística ovárica (COD) es una importante causa de infertilidad en bovinos, y el estrés uno de los principales factores que influyen en su presentación. La hormona adrenocorticotrópica (ACTH), principal hormona relacionada al estrés, ha sido implicada en mecanismos relacionados con la ovulación, la esteroidogénesis y la función luteal. El presente estudio fue diseñado para determinar la acción del estrés en la COD mediante la evaluación de la influencia de la ACTH in vitro e in vivo sobre la esteroidogénesis, los patrones de expresión de los receptores de melanocortinas (MCRs), las isoformas de la 11beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (11bHSD) y los receptores de glucocorticoides (GR), comparándolo con lo que ocurre en animales que presentan la enfermedad de forma espontánea. Mediante RT-PCR pudo detectarse ARNm para los cinco tipos de MCRs en el ovario bovino. La estimulación in vitro con ACTH produjo un incremento en los niveles de cortisol y en la expresión de 11bHSD1 en folículos terciarios y quísticos, y una disminución en la expresión de 11bHSD2 en quistes. In vivo, los quistes espontáneos e inducidos mostraron un aumento en los niveles de expresión de 11bHSD1 en granulosa en relación a los folículos terciarios controles. Por otro lado, la expresión del GR en granulosa fue mayor en folículos terciarios y quísticos de animales con COD, en relación a los folículos terciarios de animales sanos. Estos resultados indican que la ACTH puede estar implicada en los mecanismos regulatorios relacionados a la función ovárica y la patogenia de la COD.

En los últimos a˜nos, la cantidad de información clínica disponible en formato digital ha crecido constantemente debido a la adopción del uso de sistemas de informática médica. En la mayoría de los casos, dicha información se encuentra representada en forma textual. La extracción de información contenida en dichos textos puede utilizarse para colaborar en tareas relacionadas con la clínica médica y para la toma de decisiones, y resulta esencial para la mejora de la atención médica. El dominio biomédico tiene vocabulario altamente especializado, local a distintos países, regiones e instituciones. Se utilizan abreviaturas ambiguas y no estándares. Por otro lado, algunos tipos de informes médicos suelen presentar faltas ortográficas y errores gramaticales. Además, la cantidad de datos anotados disponibles es escasa, debido a la dificultad de obtenerlos y a temas relacionados con la confidencialidad de la información. Esta situación dificulta el avance en el área de extracción de información. Pese a ser el segundo idioma con mayor cantidad de hablantes nativos en el mundo, poco trabajo se ha realizado hasta ahora en extracción de información de informes médicos escritos en espa˜nol. A los desafíos anteriormente descriptos se agregan la ausencia de terminologías específicas para ciertos dominios médicos y la menor disponibilidad de recursos linguísticos que los existentes para otros idiomas. En este trabajo contribuimos al dominio de la biomedicina en espa˜nol, proveyendo métodos con resultados competitivos para el desarrollo de componentes fundamentales de un proceso de extracción de información médico, específicamente para informes radiológicos. Con este fin, creamos un corpus anotado de informes radiológicos en espa˜nol para el reconocimiento de entidades, negación y especulación y extracción de relaciones. Publicamos el proceso seguido para la anotación y el esquema desarrollado. Implementamos dos algoritmos de detección de entidades nombradas con el fin de encontrar entidades anatómicas y hallazgos clínicos. El primero está basado en un diccionario especializado del dominio no disponible en espa˜nol y en el uso de reglas basadas en conocimiento morfosintáctico y está pensado para trabajar con lenguajes sin muchos recursos linguísticos. El segundo está basado en campos aleatorios condicionales y arroja mejores resultados. Adicionalmente, estudiamos e implementamos distintas soluciones para la detección de hallazgos clínicos negados. Para esto, adaptamos al espa˜nol un conocido algoritmo de detección de negaciones en textos médicos escritos en inglés y desarrollamos un método basado en reglas creadas a partir de patrones inferidos del análisis de caminos en árboles de dependencias. También adaptamos el primer método, que arrojó los mejores resultados, para la detección de negación y especulación en resúmenes de alta hospitalaria y notas de evolución clínica escritos en alemán. Consideramos que los resultados obtenidos y la publicación de criterios de anotación y evaluación contribuirán a seguir avanzando en la extracción de información de informes clínicos escritos en espa˜nol.