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ResumenInicialmente, este trabajo de Tesis doctoral se orientó a aislar y purificar arqueolipidos polares totales (APT) de la membrana celular de la arquebacteria Halorubrum tebenquichense. A tal fin se puso a punto un protocolo, que consistió en el fraccionamiento de la mezcla de APT mediante cromatografía en columna con Silica 60. Esta técnica permitió obtener fracciones enriquecidas en los lípidos manosilados SDGD-5 y SGDG-5PA, y en el fosfolípido PGP-Me. Luego, con cada una de estas fracciones arqueolipidicas se prepararon dos tipos de nanovesiculas: unas enriquecidos en cada una de estas fracciones, otras combinando cada una de dichas fracciones con fosfolípidos de soja. Las nanovesiculas se prepararon por el método de resuspensión de la película lipídica, que luego se homogeneizaron mediante sonicación y extrusión, hasta lograr tamaños promedios entre 100 y 200 nm medidos por dispersión dinámica de la luz. Nuestra hipótesis inicial fue que el enriquecimiento de nanovesiculas en glicoarqueolipidos como SDGD-5 y SGDG-5PA, aumentaría la extensión de su captura celular, y de esta forma podrían usarse como poderosos agentes de delivery intracelular de drogas. Para verificarlo, se determinó la captura de cada uno de estas nanovesiculas, por macrófagos cultivados in vitro. A tal fin, se analizó mediante citometría de flujo la internalización celular por la línea de macrófagos J774A.1, de los diferentes tipos de nanovesiculas marcados con el fluoroforo de membrana RhPE. Sorprendentemente, observamos que los nanovesiculas enriquecidas en glicoarqueolipidos (y carentes de PGP-Me) se capturaron en muy baja extensión, en tanto aquellas enriquecidos en PGP-Me (y carentes de glicoarqueolipidos), o los preparados con arqueolípidos sin fraccionar (APT; nanovesiculas conocidas como arqueosomas [ARQ], conteniendo PGP-Me y glicoarqueolípidos), fueron los más extensamente capturadas. Se concluyo que fue el PGP-Me y no los glicoarqueolipidos los que jugaron un rol clave en la extensión de captura por macrófagos. Para elucidar el mecanismo responsable, se llevó a cabo un ensayo de competición de captura por células J774A.1. A tal fin, ARQ marcados con RhPE se incubaron con células J774A.1, en presencia o ausencia de competidores de captura y su internalización se determinó por citometría de flujo. Como competidores de captura, se utilizaron ligandos conocidos de receptores de membrana, involucrados en mecanismos de captura endocitica, a saber: ácido poli-inosinico (ligando de receptores scavenger clase A), fosfatidilserina (ligando de receptores scavenger clase B), y un polisacárido de manosa (ligando del receptor de manosa). Observamos que la captura se vio inhibida en un 80 ± 20%, únicamente en presencia de ácido poliinosinico. Se concluyó entonces que los ARQ (o nanovesiculas conteniendo APT) fueron los más extensamente endocitados, principalmente mediante receptores scavenger clase A. Por esta razón en esta Tesis empleamos nanovesiculas preparadas en base a APT, ya como arqueosomas (únicamente APT) o combinados con otros lípidos. En segundo lugar, se exploró la citotoxicidad de ARQ sobre macrófagos por distintos métodos, a saber: MTT, LDH y apoptosis/necrosis mediante microscopia de fluorescencia con Ioduro de propidio, Hoeschst y YO-PRO y ensayo del TUNEL. Supimos que hasta un valor de 100 µg/ml los ARQ no afectan la viabilidad celular, ni la estructura de la membrana plasmática, aunque podrían al cabo de 24 h, inducir apoptosis sobre una fracción de esta línea celular. Los detalles experimentales y resultados hasta aquí descriptos se discuten extensamente en el Capítulo 2. En el Capítulo 3, se presentó el diseño de nanovesiculas capaces de aumentar la extensión del delivery citoplásmico respecto del provisto por ARQ o nanovesículas fosfolipidicas ordinarias. Para esto modificamos la estructura de ARQ, tal que fueran capaces de responder a cambios de pH: consideramos que una vez endocitados, la disminución de pH ofrecida por el interior endosomal gatillaría una transición de fase responsable del vuelco de su contenido interno al citoplasma. Partiendo entonces de la matriz pH sensible DOPE:CHEMS 7:3:0 (LpH) a la que se le incorporaron cantidades crecientes de APT, nació el diseño de los llamados arqueosomas pH sensibles. Para evaluar la pH sensibilidad de estas formulaciones frente a la acidez, el par fluoroforo quencher HPTS-DPX fue incorporado a su interior acuoso. Primeramente, se evaluó la pH sensibilidad de los distintos nanovesiculas en ausencia de células. Para ello, se las incubo por 10 minutos a 37°C a distintos pH y luego se midio la intensidad de fluorescencia del HPTS dequencheado, liberado al ocurrir la transición de fase y desestabilización de la membrana nanovesicular. Hallamos que a pH 4,5 la formulación conteniendo DOPE y CHEMS LpHa liberó 50 % de su contenido acuoso. Hallamos además que dicho porcentaje decreció a medida que las formulaciones aumentaban su proporción de APT, hasta ser nulo para los ARQ. Esto significo que los ARQ son completamente pH-insensibles, en tanto que pudieron obtenerse formulaciones pH-sensibles conteniendo una fracción relativamente pequeña de APT. El siguiente paso fue evaluar la capacidad de las distintas formulaciones para ejecutar delivery citoplásmico sobre varias líneas celulares: J774A.1, NR8383 (macrófagos alveolares de rata) y A549 (neumocitos tipo II humanos). Para esto se utilizaron nanovesiculas con doble marca, RhPE y HPTS-DPX. De esta forma se pudo evaluar, por un lado, la cantidad de contenido acuoso liberado al citoplasma por cada nanovesicula, y por otro la extensión de su captura (ya que aquellas formulaciones con baja proporción de APT podían ser menos capturadas). Así determinamos que los nanovesiculas ApH3, formulación pH sensible con mayor proporción de APT, proporcionaron la máxima cantidad de HPTS citoplásmico. El máximo delivery citoplásmico en este caso resulto de la combinación única de una elevada tasa de captura con una relativa pHsensibilidad. Las nanovesiculas ordinarias (no pH sensibles) no son herramientas útiles para entregar drogas hidrosolubles al citoplasma celular: luego de ser endocitadas, su contenido acuoso queda atrapado en el interior endo-lisosomal, resultando inaccesible al citoplasma celular. Por el contrario, una de las importantes prestaciones de nanovesiculas como ApH3, radica en su capacidad para ofrecer delivery masivo de drogas hidrosolubles al citoplasma celular. Tal es el caso de la forma hidrofílica del anti-inflamatorio dexametasona fosfato (DEX-P) cuya acción depende de la unión al receptor de glucocorticoide citoplasmático. DEX-P fue incorporada al interior acuoso de distintos nanovesiculas- incluyendo ApH3- y se evaluó su citotoxicidad sobre las líneas celulares J774A.1, macrófagos THP-1 (macrófagos transformados a partir de monocitos humanos) y A549. Hallamos que ninguna formulación afecto la viabilidad celular hasta concentraciones 10 µg/ml de DEX-P y 50 µg de LT luego de 24 horas de incubación con J774 y THP1, mientras que en células A549 la viabilidad no disminuyó hasta 50 µg/ml DEX-P y 250 µg/ml de LT. En estas mismas líneas celulares se evaluó la actividad anti-inflamatoria de DEX-P incorporada en distintas nanovesiculas - incluyendo ApH3-, luego de co-incubar y pre incubar las células con LPS o PMA y medir la liberación de citoquinas pro-inflamatorias mediante Elisa de captura. Hallamos que ApH3-DEX-P indujo la máxima disminución de liberación de TNF-α e IL-6 por células J774A.1. En células A549, observamos que solo disminuyo significativamente la liberación de IL-6, sin diferencias significativas entre muestras. En células THP-1 finalmente, determinamos que tanto nanovesiculas vacías como conteniendo DEX-P disminuyeron la liberación de TNF-α, IL-1β e IL-6 más pronunciadamente que DEX-P libre. También se testeó la actividad anti-inflamatoria de nanovesiculas-DEX-P midiendo su capacidad para inhibir la generación de especies reactivas de oxigeno (ERO). Para ello se cuantificó la intensidad de fluorescencia generada por la sonda DCFDA, luego de ser incubada durante 24 horas con células J774A.1 o THP-1 activadas con LPS en presencia o ausencia de nanovesiculas, mediante un equipo Cytation 5. DCFDA es una molécula que una vez endocitada se desacetila y en presencia de ERO se oxida a una forma fluorescente. Así, determinamos que ApH3 produjo una disminución de ERO significativamente mayor que con LpH o DEX-P libre. El conjunto de estos resultados permite sugerir que los ApH3 constituyen una herramienta eficaz para aumentar el delivery citoplásmico de DEX-P -y por ende su actividad anti-inflamatoria- en cultivos celulares in vitro. Por otra parte, se evaluó la estabilidad coloidal de los distintas nanovesiculas (con y sin APT) luego de almacenados durante tres y seis meses a 4°C. Hallamos que todas las formulaciones mantuvieron tamaños en el orden de los 200 nm con índices de polidispersidad menores a 0,4. Luego, determinamos su capacidad (fundamentalmente de LpH [formulación ph sensible y carente de arqueolípidos] y de ApH3) para resistir el estrés de nebulización. La técnica de nebulización elegida fue la de malla vibradora, que permite formar microgotas de tamaño de 2 a 4 micrones, facilitando su acceso a los alveolos donde los macrófagos allí residentes juegan un rol clave en el establecimiento de procesos inflamatorios pulmonares. Se determinaron así los cambios en tamaño, concentración de lípidos y liberación de HPTS antes y después de la nebulización de las suspensiones nanovesiculares, luego de recolectarlas en un balón conectado al nebulizador. Hallamos que tras nebulizadas, ApH3 y LpH mantuvieron sus tamaños. Sin embargo, mientras que de las nanovesiculas ApH3 nebulizadas se recuperó el 70% del HPTS encapsulado, para LpH solo se recuperó el 50%. Esta diferencia es aún mayor al nebulizar nanovesiculas almacenados durante seis meses; mientras que ApH3 mantuvo su performance, la cantidad de nanovesiculas LpH nebulizadas estuvo por debajo del límite de detección. La determinación de su performance como agente de delivery citoplásmico de drogas antiinflamatorios estructuralmente resistente al estrés de nebulización, fue complementada con el estudio de su interacción con el surfactante pulmonar (SP). El SP recubre el epitelio alveolar y debe ser atravesado por toda nanovesicula nebulizada antes de contactar las células (macrófagos o células epiteliales alveolares) subyacentes. A tal fin se trabajó en conjunto con el grupo de Biofísica del CIBAAL de la Universidad de Santiago del Estero. En el Capítulo 4 se describe la preparación de monocapas de SP en balanza de Langmuir. Se determinó a continuación si ARQ, L, LpH y ApH inyectados o nebulizados a la interfase acuosa en distintas condiciones de compresión, perturbaban la presión superficial de SP a lo largo de ciclos dinámicos de compresión-expansión del SP, en un intento de simular la dinámica respiratoria. Hallamos que las formulaciones ApH3 no solo no indujeron inactivación de surfactante, sino que hasta conseguían mejorar su función reductora de tensión superficial. Además, observamos que nebulizados sobre células cubiertas con SP, su extensión captura y subsiguiente capacidad de delivery citoplásmico se mantenían prácticamente intactas. En el Capítulo 5, la actividad de nanovesiculas preparadas en base a APT como agentes antiinflamatorios nebulizables, derivo en otra potencial aplicación terapéutica: su uso como agente antimicrobiano. En este caso, buscamos aumentar el delivery al sistema endo-lisosomal (sitio donde residen ciertos agentes infecciosos pulmonares), y en paralelo, aumentar el acceso a biofilms formados por bacterias que colonizan las vías respiratorias superiores. Así, el antibiótico ácido lábil azitromicina (AZ) fue incorporado en la formulaciones nanovesiculares no pH sensibles ARQ y L. Se determino su citotoxicidad sobre células THP-1 convertidas a macrófagos y sobre células A549. Observamos que la estabilidad de las nanovesiculas ARQ-AZ frente a nebulización fue muy superior a las del resto. Medimos la actividad antibacteriana de las distintas formulaciones sobre biofilms de Staphylococcus aureus. Los resultados preliminares mostraron que AZ mantuvo su efecto antimicrobiano aun incorporada en las nanovesiculas.En el Capítulo 6 por último, una única aplicación ajena a nebulización de las nanovesiculas preparadas en base a APT, busco explotar la combinación de su elevado potencial Z negativo con su naturaleza estructural responsable de alta estabilidad frente al almacenamiento. Dada su capacidad de disminuir la actividad de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2), hipotetizamos aquí que los ARQ tendrían un rol como agentes antivenenos, complementario al uso de sueros antiofídicos. La PLA2 es un componente enzimático de venenos de Bothrops responsable de generar intermediarios de inflamación, dolor, hemolisis y mionecrosis. Se llevaron a cabo ensayos preliminares de inhibición de actividad de venenos de yarará sobre cultivos celulares de fibroblastos (L20B) y células musculares (RD), células target de los venenos, en donde se demostró que ARQ de tamaños > 200 nm a una concentración de 50 mg/mL lograron inhibir la actividad citotóxica del veneno de la serpiente Bothrops neuwidi diporus.

El objetivo general de esta tesis doctoral fue evaluar la capacidad de nanovesículas ultradeformables conteniendo arqueolípidos (AUD) de funcionar como adyuvantes tópicos. Es decir, por un lado, que puedan desencadenar una respuesta inmune antígeno especifica humoral, celular y de memoria tras su aplicación tópica al combinarlos con diferentes antígenos. Por otro lado, que cumplan con ser seguros, eficaces, estables, que no requieran cadena de frio para su almacenamiento, que se puedan producir por procesos simples y que se puedan mezclar con el antígeno antes de su administración. Previamente mostramos que AUD preparados a partir de arqueolípidos polares totales (APT) extraídos del arquebacteria hiperhalófila Halorubrum tebenquichense, fosfatidilcolina de soja (SPC) y colato de sodio (ColNa) (3:3:1 p/p) aplicados tópicamente pueden penetrar el estrato corneo (SC) e inducir títulos de IgG séricos antígeno-específicos. En el Capítulo 2, en primer lugar, estudiamos la estabilidad coloidal y perdida del contenido interno de AUD sometidos al estrés producido por cambios de temperatura, y la comparamos con la estabilidad de liposomas ultradeformables convencionales carentes de APT (LUD, SPC:ColNa 6:1 p/p). Luego se evaluó la estabilidad de AUD y LUD sometidos a esterilización por autoclave y se puso a punto un proceso de liofilización con el objeto de obtener un producto estéril y seco. La hipótesis fue que los APT les brindarían mayor estabilidad estructural a las bicapas frente a diferentes procesos por sobre vesículas carentes de APT. Los liposomas sufren cambios estructurales significativos cuando son calentados, por ejemplo, liposomas de SPC y colesterol o liposomas peguilados incrementan sustancialmente su tamaño y pierden su contenido interno cuando son autoclavados. Aquí hallamos que AUD, a diferencia de LUD pueden ser calentados sin perder su estabilidad coloidal: autoclavados o incubados por 6 h a 80 °C, mantienen su tamaño, aunque pierden su contenido acuoso. La liofilización es el método estándar para remover el agua y así prolongar la vida media de las formulaciones liposomales al almacenamiento. Previamente habíamos reportado que debido al contenido de colato de sodio, los LUD no pueden ser liofilizados, aún en presencia de altas concentraciones de sacarosa (10 y 20 % p/v). Especulamos que el contenido del disacárido manosaglucosa (0,072 % p/v provisto por el 8,2 % p/p del SDGD-5 en la mezcla de APT) sumado a la alta carga negativa (provista por el 55 % p/p de PGP-Me en la mezcla de APT) podrían proteger a los AUD frente a la liofilización. Esta asunción resultó parcialmente correcta: los AUD fueron más estables que los LUD al congelamiento, pero no a la deshidratación durante la liofilización. Los resultados sugieren que los APT son en parte crioprotectores, pero no lioprotectores. La crioprotección total se alcanzó agregando bajas cantidades de glucosa (0,07 % p/v) y glicerol (2,5 % v/v). Finalmente, la estabilidad coloidal tanto de las suspensiones como de los liofilizados tras 5 meses de almacenamiento a 4 y 40 °C mostró que AUD permanecieron sin cambios, en contraste LUD se agregaron. En suma, demostramos que los APT le confieren a los AUD estabilidad frente a esterilización por autoclave y almacenamiento en ausencia de cadena de frio. Los APT, sin embargo, fueron insuficientes para proteger a los AUD de la liofilización, lo que requirió la adición de glicerol y glucosa. A continuación, evaluamos las estrategias de administración de antígeno y adyuvante (encapsulación en el interior acuoso, adsorción superficial o administración separada) sobre la respuesta inmune generada tras la administración tópica en modelos animales y finalmente evaluamos la conservación de las propiedades adyuvantes de AUD luego de ser esterilizados y liofilizados. Sorprendentemente, no hallamos diferencias en la magnitud ni duración de la respuesta medida como títulos de IgG séricos totales tras la administración de ovoalbúmina (OVA) incluida en el espacio acuoso interno de los AUD o adicionada externamente. La administración separada en el tiempo de AUD y OVA, en contraste, generó menor respuesta. Estos resultados sugieren que no es necesaria la incorporación del antígeno en los AUD para desencadenar la respuesta inmune sistémica, pero sí es necesaria la mezcla de ambos para su aplicación. El proceso de liofilización no modificó la respuesta inmune generada tras la aplicación tópica de AUD. Por último, el screening de la activación de esplenocitos mostró que no se consiguió una activación celular antígeno específica, sin embargo, AUD produjo mayor número de esplenocitos y liberación de IFN-, tanto estimulados con concanavalina A como con OVA, que LUD. Esto significaría que los AUD, aunque no son inmunogénicos per se, causarían un tipo de estímulo general inespecífico de la inmunidad celular una vez asociados a un antígeno. En definitiva, se logró obtener una formulación estéril, seca y estable, que no requiere del uso de cadena de frío, lista para usar tópicamente que puede ser mezclada con el antígeno de interés en el momento de su administración, para la generación de reacción antígeno específica. La respuesta inmune producida por AUD, sin embargo, es menor a la alcanzada mediante la administración parenteral de vesículas hechas completamente de APT y los títulos del isotipo IgG2a son menores que los del isotipo IgG1, lo que sugiere una respuesta más del tipo humoral (Th2) que celular (Th1). La mayoría de las enfermedades generadas por virus o bacterias requieren de una inmunidad celular además de humoral y de memoria. Por lo tanto, en el Capítulo 3 se incorporó el inmunomodulador imiquimod (IMQ) a la estructura de los AUD para incrementar la respuesta de tipo celular. Nuestra hipótesis fue que la combinación de la penetración en la piel y el direccionamiento específico a células presentadoras de antígenos (CPA) de AUD con la actividad inmunomoduladora de IMQ mejoraría la respuesta inmunogénica tras su aplicación tópica, comparada con la generada por AUD sin IMQ e IMQ libre. En el Capítulo 3 preparamos y caracterizamos AUD incorporando y asociando IMQ a su estructura y evaluamos su captura, citotoxicidad y capacidad de inducir la liberación de citoquinas proinflamatorias en macrófagos y queratinocitos, su penetración en piel humana y sus propiedades adyuvantes in vivo utilizando OVA como antígeno modelo. El IMQ, es un ligando sintético del receptor intralisosomal TLR7 aprobado por la agencia regulatoria estadounidense (FDA) para el tratamiento tópico de la queratosis actínica, el carcinoma de células basales superficial y neoplasmas de piel inducidos por virus. IMQ induce la producción de ciertas citoquinas como IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 y IL-12 en células inmunes como monocitos/macrófagos, células dendríticas, células B, queratinocitos y granulocitos. IMQ produce la movilización rápida de las células dendríticas plasmacitoides y la activación de sus funciones citotóxicas. Aplicado tópicamente, IMQ induce la maduración de células de Langerhans y estimula la migración de CPA hacia los nódulos linfáticos donde promueven una respuesta celular específica. El IMQ, sin embargo, es prácticamente insoluble en solventes tanto hidrofóbicos como hidrofílicos. Sólo es soluble en soluciones acuosas ácidas (pH 2), en ácido láctico y ácidos grasos como ácido oleico, esteárico y linoleico. Por este motivo, no es posible la incorporación de IMQ en grandes cantidades en las nanovesículas ultradeformables. Considerando ese aspecto, sumado a que las drogas no necesariamente deben estar encapsuladas en el interior de las nanovesículas ultradeformables para penetrar el estrato corneo, preparamos AUD y LUD con IMQ en dos pasos: 1) IMQ disuelto en ácido linoleico se incorporó en la matriz/espacio interno de las vesículas (AUD1 y LUD1); 2) inmediatamente antes de su uso AUD1 y LUD1 se suplementaron con IMQ disuelto en ácido láctico (AUD2 y LUD2). AUD2 y LUD2 tuvieron un pH de 5,5 compatible con una formulación de uso tópico y no presentaron precipitado de IMQ. AUD2 presentó un tamaño de 250 ± 94 nm y potencial Z de -26 ± 4 mV, mientras que LUD2 presentó un tamaño de 280 ± 160 nm y potencial Z de -14,4 ± 4 mV. Estudios de deformabilidad y análisis del orden y fluidez de las bicapas realizado con la sonda Laurdan mostraron que parte del IMQ se incorporó en el espacio acuoso interno de las vesículas y parte se asoció electrostáticamente con la superficie de carga negativa de los AUD1 y en menor medida con los LUD1. A continuación, estudiamos la captura de AUD2 y LUD2 en macrófagos murinos (células J774A.1 como modelo de CPA) y queratinocitos (células HaCaT, principal tipo celular de la epidermis) utilizando vesículas con una doble marca fluorescente (rodamina-PE como marca de la bicapa lipídica y HPTS/DPX como marca del espacio acuoso interno) por citometría de flujo. Encontramos que AUD2 fueron más internalizados que LUD2 por los macrófagos, debido que APT son ligandos específicos de receptores scavenger de tipo A, expresados en células fagocíticas y CPA. Adicionalmente, hallamos que AUD2, una vez internalizadas, liberan su contenido acuoso de modo tal de incrementar la disponibilidad de IMQ intracelularmente. El IMQ es entonces reconocido por el receptor de TLR7 intraendosomal y es capaz de iniciar la secreción de citoquinas proinflamatorias. En queratinocitos, ambas formulaciones fueron internalizadas en menor magnitud que en los macrófagos, merced su interacción con el receptor de adenosina A2A superficial, encontrándose mayor captura tras la incubación con AUD2. A continuación, evaluamos la citotoxicidad e inducción de liberación de citoquinas proinflamatorias de IMQ libre, AUD2 y LUD2 en células J774 y HaCaT. La viabilidad de los macrófagos descendió en forma dosis- y tiempo-dependiente tras la incubación con IMQ libre, AUD2 y LUD2, resultando igualmente toxicas: a  8,5-13 µg/ml IMQ se redujo 85-90 % la viabilidad tras 48 h de incubación. Por otro lado, la viabilidad de los queratinocitos descendió solo tras la incubación con AUD2 y LUD2: 13,3 µg/ml y 4,7 µg/ml IMQ de AUD2 y LUD2, respectivamente redujeron 50% la viabilidad de células HaCaT tras 48 h de incubación. En macrófagos, el IMQ libre, así como AUD2 y LUD2 (a concentraciones no citotóxicas) indujeron la misma producción de IL-6 que fue menor a la inducida por lipopolisacárido (LPS); sin embargo, AUD2 indujo significativamente mayor cantidad de TNF- que el resto de las muestras incluyendo LPS. Por otro lado, en células HaCaT, AUD2 indujo mayor cantidad de IL-6 que el resto de las formulaciones, aunque ninguna indujo la producción de TNF-. Estos resultados sugieren que debido al mayor delivery del IMQ intraendosomal en los macrófagos y la mayor interacción con el receptor superficial de adenosina A2A en queratinocitos, AUD2 indujo mayor cantidad de citoquinas proinflamatorias que IMQ libre y LUD2. Tras realizar la caracterización fisicoquímica, y el estudio de citotoxicidad, captura y liberación de citoquinas proinflamatorias, evaluamos la penetración del IMQ en forma libre y como AUD2 y LUD2 en explantos de piel humana. La acumulación total del IMQ en la piel fue 3 veces mayor cuando se aplicó como AUD2 (30 ± 8 g/cm2 ) que como LUD2 (10 ± 3 g/cm2 ) y 1,5 veces mayor que como IMQ libre (20 ± 6 g/cm2 ). Finalmente evaluamos la respuesta inmune generada tras la aplicación tópica de IMQ, AUD2 y LUD2 utilizando OVA como antígeno modelo. AUD2 y LUD2 indujeron mayores títulos de IgG en comparación con IMQ libre. Además, mientras que IMQ libre no produjo isotipos IgG2a, la relación IgG2a/IgG1 (indicativa de la polarización Th1/Th2 en ratón) de LUD2 fue  0,5, similar a la obtenida previamente (Capitulo 2) para AUD (sin IMQ), lo que sugiere una respuesta de tipo humoral. AUD2, por otro lado, indujo una relación de isotipos 1, sugiriendo una respuesta mixta humoral/celular. Adicionalmente, evaluamos el efecto de la vacunación sobre la inmunidad celular, midiendo la liberación de IFN-γ y el índice de estimulación (IE) de los esplenocitos de los ratones vacunados re-estimulados con el antígeno (OVA). Los títulos de INF-γ normalizados por el IE de los esplenocitos de los ratones inmunizados con AUD2 fueron significativamente mayores que los correspondientes al resto de los grupos. En contraste los animales inmunizados con IMQ libre indujeron bajos títulos de INF-γ, mientras que los inducidos por LUD2 se hallaron debajo del límite de detección. En suma, los resultados sugieren que solo AUD2 indujo una respuesta de tipo celular. Por último, AUD1 permaneció estable coloidalmente por hasta 5 meses de almacenamiento a 4°C. La estabilidad de LUD1, en contraste, se perdió más rápidamente, luego de 1 mes de almacenamiento. A continuación, en el Capítulo 4 evaluamos la capacidad de AUD2 aplicado tópicamente de inducir inmunidad contra antígenos de influenza. Nuestra hipótesis fue que debido a las propiedades adyuvantes AUD2 podría mezclarse en el momento de su administración con una vacuna comercial y aplicado tópicamente inducir respuestas inmunes que podrían ser similares a la obtenida tras la administración parenteral, reduciendo así las desventajas del uso de aguas y jeringas (seguridad, disconformidad, necesidad de personal capacitado y rápida disponibilidad ante la necesidad de vacunaciones masivas en casos de pandemias). En este Capítulo, se evaluaron dos aspectos diferentes: i) la actividad del inmunomodulador IMQ como adyuvante, para lo que se observó si hay inducción de variaciones en el tipo y/o magnitud de la respuesta obtenida y ii) la performance de la administración tópica con respecto a la administración parenteral de la vacuna comercial. Para ello, se midió la respuesta inmune tras la aplicación tópica de IMQ, AUD vacíos, AUD + IMQ, AUD1 y AUD2 mezclados con una vacuna estacional comercial contra influenza sin adyuvante (Nilgrip, HA) y se comparó con la vacuna subcutánea. En primer lugar, hallamos que si bien la presencia de IMQ no indujo diferencias significativas en cuanto a los títulos de IgG séricos antígenoespecíficos respecto de vesículas sin IMQ, su presencia moduló el tipo de respuesta, lo que se puso de manifiesto tras la administración de AUD2, la formulación que más cantidad del inmunomodulador posee. Encontramos que su administración tópica indujo la generación de una relación de isotipos IgG2a/IgG1~1 y, además, la liberación de cantidades de INF-γ significativamente altas. Estos resultados, sugieren que AUD2 induce una respuesta de tipo celular que no se manifiesta con la aplicación tópica de AUD sin IMQ. Por otro lado, hallamos que la vacuna subcutánea comercial y la aplicación tópica de AUD2 mezclados con la vacuna, aunque no la vacuna tópica mezclada con IMQ, produjeron títulos de IgG séricos totales similares y relación de isotipos IgG2a/IgG11. Remarcablemente, los esplenocitos de los animales vacunados tópicamente mostraron mayor IE y liberación de mayor cantidad de INF- que los vacunados subcutáneamente. Adicionalmente, evaluamos si el sitio de administración podría modificar la respuesta tras la administración tópica. Hallamos que tanto la administración en las axilas, donde se encuentra una gran población de ganglios linfáticos, como en el lomo generó la misma magnitud y tipo de respuesta. Estos resultados sugieren que, al menos en términos de las medidas realizadas, la aplicación tópica de AUD con IMQ podría ser una opción a la vacunación subcutánea. Finalmente, en el Capítulo 5 estudiamos la actividad antitumoral de AUD2 contra melanoma. Nuestra hipótesis fue que la actividad pro-apoptótica TLR-7 independiente antitumoral del IMQ podría incrementarse o modificarse incorporado o asociado a AUD. En primer lugar, medimos la citotoxicidad utilizando el método de MTT y liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de IMQ libre, AUD2 y LUD2 como indicativos de la actividad metabólica y la integridad de la membrana citoplasmática de células de melanoma humano (Sk-Mel-28), respectivamente. A continuación, estudiamos la captura celular de AUD2 y LUD2 por células SkMel-28, y determinamos la existencia de muerte celular por necrosis o apoptosis mediante el estudio de la luz dispersada por citometría de flujo y microscopia de fluorescencia tras la tinción con YO-PRO/ioduro de propidio Hallamos que IMQ redujo 50 % la viabilidad medida por MTT, produjo un 100 % liberación LDH a 100 µg/ml tras 48 h de incubación y generó apoptosis sobre células Sk-Mel-28. La incorporación de IMQ en LUD y AUD modificó su farmacodinamia de dos modos diferentes. Por un lado, la incorporación de IMQ en LUD incrementó la toxicidad del IMQ (< 50 % de viabilidad y 80 % de liberación LDH tras 24 h a 13 µg/ml IMQ) conservando la capacidad de inducción de apoptosis del IMQ. Por otro lado, la incorporación de IMQ en AUD no incrementó la toxicidad del IMQ, aunque, produjo una toxicidad intrínseca de las matrices lipídicas (mayor a la generada por LUD2) con un incremento de la proporción de células necróticas. Encontramos que AUD2 fue significativamente más capturada que LUD2 por las células Sk-Mel-28. La mayor captura de AUD en comparación con LUD, sumado al contenido de ácido linoleico y arqueolípidos podrían relacionarse con la mayor toxicidad y disrupción de la integridad de la membrana plasmática. Estos resultados sugieren que AUD2 podrían tener un potencial en la terapia adyuvante de melanoma que sería necesario continuar investigando. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen al desarrollo de adyuvantes tópicos estables y listos para usar.