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La tos convulsa es una enfermedad aguda, respiratoria y altamente contagiosa que a pesar de ser inmunoprevenible, hoy en día es considerada una enfermedad resurgente. Surge entonces la necesidad de aplicar refuerzos de inmunización de forma de prolongar la duración de la inmunidad contra la enfermedad, así como también de mejorar las vacunas actuales de manera tal que no solo ofrezcan una protección duradera en el tiempo sino que también protejan contra cepas circulantes antigénicamente distintas. Es por esto que la inclusión de antígenos expresados por cepas circulantes en las formulaciones vacunales podría ofrecer una mejora en el control de esta enfermedad Por otra parte, ante las vacunas parenterales convencionales, una vacuna mucosal podría ser una alternativa válida para mejorar las vacunas existentes, ya que imita a la infección natural y puede prevenir la colonización de B. pertussis mediante la generación de anticuerpos en la mucosa. Sin embargo, la inducción de una respuesta inmune protectora es difícil de lograr mediante inmunización por vía mucosal con antígenos recombinantes solubles. Es por ésto que el uso correcto de adyuvantes es fundamental a la hora de diseñar vacunas recombinantes administradas por vía de mucosas. En este sentido, se ha demostrado que la subunidad B de la toxina colérica es un potente inmunoestimulador que puede actuar como adyuvante estimulando la respuesta inmune sistémica y de mucosas contra antígenos administrados por vía mucosal, además de ser seguro para su uso en humanos. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una vacuna recombinante acelular para la mejora de la prevención de la infección por B. pertussis, el objetivo general de este trabajo fue generar herramientas moleculares que resulten útiles en el control de la infección causada por B. pertussis. Nuestro trabajo contempló la identificación, caracterización, y la validación de proteínas de B. pertussis como candidatos vacunales así como el estudio de la respuesta del huésped a dichas proteínas. Nuestra hipótesis es que proteínas recombinantes de B. pertussis fusionadas con CTB son buenos candidatos vacunales para ser utilizados por vía mucosal.

El trabajo que se resume aconsiste en un estudio de las proteínas aéricas de dos peces del Atlántico Sur (se encuentran también en otras aguas), que fué realizado con los siguientes fines: 1) Reunir datos sobre las proteínas séricas del Cynoscium striatus y Raya microps sobre las que no existía ninguna información. Dear técnicas apropiadas y adaptar técnicas conocidas para trabajar con muestras individuales de sangre de peces (muy poca cantidad y rápida descomposición). Averiguar si hay especificidad en las proteínas séricas de los peces estudiados, y, si hay, cual es el cuadro de variación entre las de uno y otro pez. Resultados: Concentración: Cy. st. (pescadilla):4.47 +- 0.47 gr en 100 ml Raya mi. (Raya): 6.41 +- 0.44 gr en 100 ml. Se efectuaron 173 determinaciones para el Cy.st. y 135 para la Raya mi. Fraccionamiento: a) Por electroforesis sobre papel en buffer de veronal-veronal sódico de pH 8.6 y fuerza iónica 0.05. Se obtuvieron 6 fracciones desplazadas hacia el ánodo que se designaron I, II, III, IV, V y VI en orden creciente de movilidad. Se efectuaron 60 fraccionamientos para el Cy. st. y 40 para Raya mi. los siguientes resultados: % Fracción Cy. st. Raya mi. I 7.0+-0.9 7.9+-0.7 II 10.2+-1.2 10.5+-1.3 III 11.5+-1.3 11.9+-1.1 IV 14.0+-0.8 13.9+-0.7 V 18.8+-1.8 18.0+-1.1 VI 38.5+-3.1 37.6+-2.4 Se determinó la concentración de cada fracción en gr %. b) Por diferencias de solubilidad (Método de Howe). En sulfato de sodio 22.2 gr % se separan 2 fracciones: soluble (FS) e insoluble (FI). Los datos preparaci propereionados por el dosaje y la electroforesis de la FS está formada por las fracciones I y VI y la FI por las restantes. Se efectuaron 10 determinaciones. Análisis de cada fracción: Cynoscium striatus Fracción I: Mezcla de proteínas simples que se separa en dos fracciones por electroforesis en buffers de pH entre 2 y 7. Punto isoeléctrico: (de la mezcla) 7.4 (40 determinaciones). Composición de hidrolizados ácidos y alcalinos (19 cromatogramas): cisteína, cistina, histidina, arginina, ácido aspártico, glicocela y metionina. En el caso de esta peculiar fración I, no podemos encontrar analogía con ninguna de las fracciones del suero humano. Por su punto isoeléctrico, solubilidad y composición en aminoácidos, aventuramos la hipótesis de que se trata de una histona muy simple. Por los cualitativamente escasos aminoácidos que la componen se asemeja a una protamina, pero no es tan básica y además las protaminas conocidas no contienen azufre, en cambio la fracción I tiene cisteína, cistina y metionina. Fracción II: Lipoproteínas o mezcla de proteínas simples y lopoproteínas. Punto isoeléctrico: entre 5.8 y 5.9 (15 determinaciones). Globulinas. Composición de hidrolizados (24 cromatogramas): histidina, arginina, ácido aspártico , ácido glutámico, lisina, serina, alfa alanina, prolina, glicocola, leucina, triptófano y 3 aminoácidos no identificados (C, D y E). Debemos señalarque la calificación "no identificados" no tiene otro sentido en este trabajo, que el de aminoácidos cuyos Rf no coinciden con los utilizados como testigos. Fracción III: Lipoproteínas o mezcla de proteínas simples y lipoproteínas. Punto isoeléctrico: 5.6 (12 ensayos). Globulinas. Composición de hidrolizados: arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, histidina, treonina, alfa alanina, prolina, metionina, triptófano y 4 no identificados, A, B, C y F. (19 cromatogramas). Fracción IV: Lipoproteínas. Punto isoeléctrico: 5.3 (14 ensayos). globulinas. Composición de hidrolizados: ácido aspártico, ácido glutámico, treonina, lisina, alfa alanina, triptófano, cisteína, arginina, metionina, A, B, C, E y F (18 cromatogramas). Fracción V: Mezcla de proteínas simples y lipoproteínas. Punto isoeléctrico: 5.0 (20 ensayos). Globulinas. Composición de hidrolizados: histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina, glicocola, prolina, leucina, triptófano, C, D, y E (18 cromatogramas). Fracción VI: Glucoproteínas o mezclas de proteínas simples y glucoproteínas. Punto isoeléctrico: 4.4 (18 ensayos). Albúminas. Composición de hidrolizados: ácido glutámico, ácido aspártico, histidina, arginina, treonina, prolina, metionina, leucina, A, B, C, D y E (20 cromatogramas). Rava microps: Fracción I: Composición de hidrolizados (C de h): igual a la fracción I del Cy. st. (8 cromatogramas). Fracción II: C de h: Aparece isoleucina; por lo demás igual a la fracción II del Cy. st. Fracción III: C de h: Aparecen valina y G además de los de la fracción III del Cy. st. excepto E. G es un aminoácido no identificado que aparece solamente en la Raya mi. (4 cromatogramas). Fracción IV: C de h: Aparece G además de los de la F IV del Cy. st. (4 cromatogramas). Fracción V: C de h: Aparecen isoleucina y fenilalanina además de los de la F V del Cy. st (4 cromatogramas). Fracción VI: C de h: Aparecen valina y fenilalanina además de los de la F. VI del Cy. st. Algunos análisis en otros peces: Se efectuó fraccionamiento electroforético del suero de algunos ejemplares de: Mugil brasiliensis, Percophis brasiliensis, Urophycis brasiliensis, Micropagon sp., Galaus canis, Basilichthys bonariensis y Paralichthys brasiliensis. Se obtuvo consistentemente, desplazamiento hacia el ánodo. La fracción de mayor movilidad es siempre la más abundante. Paralichthys brasiliensis: Concentración: El promedio de 5 determinaciones da 2.16 +- 0.14 gr de proteínas séricas en 100 ml de suero. Fraccionamiento electroferético: En buffer de veronal.veronal sódico de pH 8.6 se obtuvieron 5 fracciones desplasadas hacia el ánodo. Fracción Porcentaje Concentración en gr % I 8.1 +- 1.2 0.17 II 10.5 +- 0.8 0.23 III 12.2 +- 1.3 0.27 IV 18.7 +- 1.2 0.41 V 50.4 +- 2.6 1.08 Métodos: Dosaje: a) Marenzi, Moglia y Villalonga (biuret). b) Wong (micro Kjeldhal). c) Whillimpa y Van Slyke modificado (densimétrico). Fraccionamiento: a) Electroforesis sobre papel. Se utilizaron técnicas distintas según se quisiera: ver el número de fracciones y hacer elución o densitometría; aislar cada fracción para utilizarla en otras determinaciones; averiguar qué fracciones contenían lipo o gluciproteínas. b) Método de Howe (diferencias de solubilidad). Se dosaron las fracciones soluble e insoluble. La soluble se dializaba contra agua destilada y en pequeños volúmenes se concentraba en desecador al vacío, para efectuar luego electroforesis. Análisis de cada fracción: Los puntos isoeléctricos se determinaron por electroforesis (buffers de de varonal sódico- ácido clorhídrico de distintos pH) de cada fracción asilada previamente por electroforesis. De cada fracción se aislada previamente por electroforesis. De cada fracción se preparen hidrolizados ácidos y alcalinas (Zahn modificado y método del hidróxido de bario modificado). De cada hidrolizado se efectuaron cromatogramas sobre papel (Ascendente, descendente y circular) para investigar aminoácidos. Conclusiones: Antes de exponer las conclusiones se quiere señalar que cuando se habla de acuerdo o desacuerdo con otros autores no es refiriéndose a los datos particulares de Cy. st. y Raya mi., sino a las generalizaciones hechas por quienes han estudiados otros peces. De los resultados expuestos se deduce, para estos peces, lo siguiente: 1°) La cantidad de proteínas séricas (en un estrechi rango), al número de fracciones separadas por electroforesis, sus concentraciones, movilidades, signos, puntos isoeléctricos y composición cualitativa en aminiácidos, son respectivamente iguales en ejemplares de una misma familia. 2°) En ejemplares de distintas familias, la concentración de proteínas séricas es distinta sin que llegue a ser un dato característico. La probabilidad es pequeña pero pueden encontrarse Cy. st. con concentración de R. mi. y viceversa. En el caso de las fracciones proteicas se encuentra una diferencia característica solo en el número de aminoácidos correspondientes a las fracciones II, III, IV, V y VI de uno y otro pez. 3°) No se encuentra variación significativa en el valor de A/G. Si, al igual que Field y col. (1) y Frieden y col.(2), hubiéramos considerado como globulinas a todas las fracciones excepto la de mayor movilidad (por analogía con las del suero humano), habríamos obtenido para ambos peces el mismo valor: 0.62 (sin cosiderar la fracción I obtuvimos 0.70 y 0.69 para Cy. st. y R. mi. respectivamente. Al comparar estas conclusiones con las de algunos trabajos que se mencionan en la introducción del trabajo que aquí se resume, se ve que hay coincidencia en el punto primero con Deutsch y Mc Shan (3), pero en el segundo punto se difiere con los mismos autores en que no todos los datos iguales son característicos. Hay desacuerdo con los autores Frieden y col. (2) pues encontramos una variación consistente entre las fracciones proteicas respectivas II, III, IV, V, y VI en ambas familias. Referencias (de este resumen) (1) Field, Elvehjem y Juday; J. Biel.Chem. 148, 261 (1943) (2) Frieden, Herner, Fish y Casson Lewis; Science, N° 3273 (1957) (3) Deutsch y Mc Shan; J.Biol. Chem. 180, 219 (1949)

La capa S es una estructura de envoltura glico-proteica constituida por subunidades que se auto-ensamblan para formar una matriz bidimensional que cubre completamente la superficie de diferentes especies de bacterias y Arqueas. Debido a su capacidad de formar productos auto-ensamblados en solución, son herramientas atractivas para ser utilizadas como carriers de antígenos o como adyuvantes. Teniendo en cuenta las características funcionales y estructurales extraordinarias que poseen las proteínas de capa S, el objetivo general de este trabajo de tesis fue realizar una caracterización estructural y funcional de las proteínas de capa S de diferentes cepas de Lactobacillus kefiri con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas biotecnológicas. En cuanto a la caracterización de la estructura primaria, utilizando técnicas proteómicas y genómicas fuimos capaces de determinar las secuencias de aminoácidos de las proteínas de capa S en dieciséis cepas de L. kefiri, y las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para estas proteínas. Teniendo en cuenta la naturaleza glicoproteica de las proteínas de capa S de L. kefiri, seleccionamos 4 proteínas de capa S provenientes de diferentes cepas de L. kefiri y analizamos la estructura de glicanos unidos a estas proteínas. En las cepas L. kefiri CIDCA 8321 y CIDCA 8348, se encontraron O-glicanos en el mismo motivo de glicosilación descripto para L. buchneri, sustituido por hasta 22 unidades de glucosa. La cepa L. kefiri CIDCA 83111 presenta el mismo glicopéptido, pero sustituido en 4 residuos de serina con un promedio de ocho unidades de glucosa, decoradas con ácido galacturónico. Además, la SLP-83111 cuenta con otro péptido O-glicosilado, con una estructura Glc5-8GalA2, y dos péptidos N-sustituidos con estructuras cortas: GlcNAc4Man3dHex y GlcNAc2dHex. La cepa L. kefiri JCM 5818 cuenta con un O-glicano en la misma posición mencionada para las otras tres cepas, sustituido en promedio con ocho unidades de glucosa, y un N-glicano de estructura compleja con ácido siálico en su estructura. Por último, analizamos las propiedades inmunoestimulatorias de las glicoproteínas de capa S de L. kefiri (SLPs) y el rol funcional que tienen los glicanos sobre estas propiedades. Utilizando líneas celulares de macrófagos demostramos que las proteínas de capa S de las cepas L. kefiri CIDCA 8321, L. kefiri CIDCA 8348, L. kefiri CIDCA 83111 y L. kefiri JCM 5818, si bien no son capaces de inducir una activación de los macrófagos, potencian la respuesta a un agonista TLR, en un proceso dependiente de la presencia de Ca+2 y de la actividad biológica de los glicanos presentes en las glicoproteínas de capa S. Utilizando BMDCs derivadas de ratones deficientes de CLRs específicos, pudimos identificar que la SLP-8321 y SLP-8348 son reconocidas y señalizan a través de Mincle, mientras que la SLP-5818 lo hace a través de SignR3. Esta interacción entre las SLPs y BMDCs induce una activación celular que resulta en un aumento en la capacidad estimulatoria de células T en ensayos de proliferación antígeno-específico. Finalmente, demostramos que la SLP-8348 posee capacidad adyuvante utilizando OVA como antígeno modelo, y que este efecto depende de la actividad biológica de los glicanos presentes en esta glicoproteína de capa S.

Las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs) son proteínas funcionales que carecen de estructura secundaria y terciaria definidas en solución. Este tipo de categoría estructural se encuentra sobrerepresentada en proteínas virales, otorgándole multifuncionalidad y versatilidad en las interacciones que establecen. Debido a flexibilidad asociada a las distintas transiciones conformacionales que presentan, las IDPs son muy difíciles de caracterizar estructuralmente, debiéndose recurrir principalmente a técnicas de estudio en solución. En este trabajo se estudiaron dos modelos de IDPs virales: el dominio amino-terminal de la oncoproteína E7 (E7N) del virus del papiloma humano (HPV-16) y la fosfoproteína P del virus sincicial respiratorio humano (RSV). En primer lugar, utilizando un abordaje de fragmentación en conjunto con medidas de dicroismo circular y resonancia magnética nuclear, se estudiaron las tendencias conformacionales del dominio E7N. Identificamos tres regiones con estructura secundaria local y transitoria: dos α- hélices dentro de las regiones conservadas CR1 y CR2, y una región que adopta hélice de poliprolinas tipo II (PII) dentro del CR2. Las dos α-hélices se encuentran pobladas en forma parcial, representando solo al 20% de la población de moléculas de E7N. Por otro lado, demostramos que la hélice-II presenta transiciones conformacionales entre PII y α-hélice moduladas por cambios de pH. Estas regiones de estructura local coinciden con los motivos lineales de interacción descriptos para este dominio, así como con sitios que experimentan modificaciones post-traduccionales. Estas características sugieren que dichas transiciones estructurales podrían modular la accesibilidad a estos motivos, regulando la interacción con sus proteínas blanco. En segundo lugar, utilizando distintas proteínas recombinantes, demostramos por primera vez la naturaleza IDP de la proteína P de RSV. La misma contiene dos módulos intrínsecamente desordenados, los cuales presentan distinto contenido de desorden. Definimos al dominio Cterminal de P como un dominio con características en solución de tipo pre-molten globule like IDP, y al dominio N-terminal como un dominio con características de tipo random-coil like IDP. Describimos que P presenta un comportamiento térmico anómalo, conteniendo en el dominio C-terminal un elemento marginalmente estable modulable por variaciones de temperatura dentro del rango de temperaturas fisiológico. En conclusión, estos ejemplos resaltan la flexibilidad funcional inherente de las IDPs, la cual les permite ser moduladas por cambios en el entorno. Esta capacidad permite a su vez explicar la plétora de procesos biológicos en los cuales se encuentran involucradas.

El presente trabajo de pone en evidencia el efecto que tienen los componentes de las semillas de amaranto en animales alimentados con una dieta alta en grasa y rica en colesterol. Este efecto es dosis/tiempo dependiente y es diferencial para el caso de la fibra y la proteína. Los animales que fueron alimentados con la dieta con HA durante un tiempo corto mostraron un aumento en la excreción de colesterol y ácidos biliares por heces y una marcada disminución en el contenido de colesterol del hígado. Este efecto no se observó en los animales alimentados con la dieta con proteína de AA. Los animales alimentados durante un período prolongado con la dieta más rica en fibra HA, excretan una mayor cantidad de colesterol y ácidos biliares que los alimentados con una la dieta con proteína de AA. En este último caso los animales mostraron además un menor contenido de colesterol en hígado. Estos resultados sugieren que la fibra de amaranto ejerce un efecto importante a nivel intestinal, mientras que, las proteínas de amaranto actuarían a través de un mecanismo dual, aumentando la excreción de colesterol y ácidos biliares a nivel intestinal y, modificando el metabolismo del colesterol a nivel hepático. En los ensayos in-vitro observamos que, tanto la proteína como la fibra provenientes de semillas de amaranto impiden parcialmente que el colesterol forme parte de las micelas modelo. Este impedimento se observa a concentraciones menores cuando se utilizaron muestras de amaranto ricas en fibra aunque la fracción proteica digerida, produjo valores de desplazamiento de colesterol más altos que el resto. En el presente trabajo de tesis, confirmamos que las proteínas y péptidos de amaranto tienen la capacidad de interaccionar captar ácidos biliares y que las fracciones de péptidos con mayor carácter hidrofóbico serían las responsables de esta capacidad. Finalmente podemos aceptar nuestra hipótesis de trabajo planteada y afirmar que las proteínas y fibra de amaranto ejercen su efecto sobre el metabolismo del colesterol a través del desplazamiento del colesterol en micelas y la captación de ácidos biliares.