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Con el propósito de investigar la potencia fototóxica de Pcs lipofílicas, decidimos evaluar la eficacia de la ftalocianina 9 (Pc9) en una línea de células de adenocarcinoma orofaríngeo. Cuando se determinó la potencia de Pc9 disuelta en DMSO-agua se obtuvo un valor de IC50 de 120 nM, sin presentar toxicidad en la oscuridad. Sobre la base de este resultado, evaluamos luego si su capacidad fototóxica podía ser mejorada al ser incorporada en algún tipo de vehículo o carrier. Demostramos que Pc9 vehiculizada, ya sea en liposomas o micelas, induce la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares y se localiza principalmente en lisosomas. Asimismo, mientras que algunos de estos vehículos resultaron tóxicos per se, otros permitieron reducir el valor de IC50, obteniendo la máxima potencia (IC50 = 10 nM) cuando Pc9 fue incorporada en las micelas de poloxamina denominadas T1107 y T1307. La mayor fotoestabilidad de Pc9 vehiculizada en T1107 con respecto a T1307 nos llevó a seleccionar la formulación Pc9-T1107 como la más potente y promisoria para continuar nuestros estudios. Teniendo en cuenta la importancia epidemiológica tanto a nivel mundial como nacional del carcinoma colorrectal (CCR), decidimos en una etapa posterior evaluar la eficacia de la TFD con Pc9-T1107 en líneas humanas y murinas de CCR. Puesto que en las distintas líneas ensayadas se obtuvieron valores similares de IC50 en cultivos bidimensionales (aproximadamente 10 nM), seleccionamos la línea celular murina CT26 como modelo de CCR para investigar el mecanismo de acción antitumoral de Pc9. El motivo de esta decisión obedeció no solo a las capacidades adquiridas en el laboratorio para generar modelos celulares más complejos, como esferoides o cultivos 3D, sino también a la posibilidad de estudiar modelos in vivo de esta patología originados a partir de esta línea celular. El análisis de los eventos moleculares involucrados en el proceso de muerte desencadenado en cultivos 2D por Pc9-T1107 reveló que la generación de ROS en lisosomas y retículo endoplásmico (RE), las principales organelas donde se localizó Pc9 intracelularmente, promovió la activación de una serie de blancos moleculares. La permeabilización de la membrana lisosomal, inducida por las ROS, produjo la liberación de una serie de proteasas al citosol, entre ellas Catepsina D, que contribuyó al clivaje de la proteína pro-apoptótica Bid y la activación de la procaspasa iniciadora 8. La fotoactivación de Pc9 en el RE activó una respuesta denominada UPR (del inglés unfolded protein response), indicio de estrés del RE. La UPR se caracterizó por un aumento en los niveles de expresión de ciertas chaperonas (GRP78/BIP, Calnexina, Hsp90 y Hsp110) que tienden a mantener la homeostasis celular. Además, se describió un incremento en los niveles de calcio intracelular que desencadenó la activación de calpaínas. Estas proteasas, a su vez, clivaron la procaspasa 12, una enzima que contribuye a la activación de una respuesta apoptótica. Asimismo, la participación de la vía de apoptosis mitocondrial fue evidenciada por la reducción en el potencial de membrana de esta organela, la disminución en los niveles de expresión de 168 proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 y la activación de procaspasa 9. La consiguiente activación de procaspasa 3 provocó el clivaje de PARP-1 y el desenlace apoptótico con daño a nivel nuclear. En paralelo, la TFD promovió alteraciones del ciclo celular, mediante arresto en la fase G2/M y prolongación de la fase S, así como la activación de una respuesta macroautofágica tendiente a contrarrestar el efecto citotóxico de Pc9- T1107. Es sabido que la eficacia de una terapia antitumoral en cultivos bidimensionales no implica necesariamente su efectividad en la clínica. Existen numerosos aspectos de un cultivo que resultan simplificaciones con respecto al contexto en un paciente. En consecuencia, resulta indispensable evaluar las terapias en fase preclínica en modelos celulares y animales más complejos que los cultivos 2D. Teniendo en cuenta estas consideraciones, demostramos que la TFD con Pc9-T1107 fue efectiva también en un cultivo tridimensional de células de carcinoma de colon CT26. El valor de IC50 obtenido (370 nM) fue considerablemente mayor al valor previamente descripto en cultivos 2D (10 nM), indicando que en modelos más complejos se requieren mayores cantidades de FS para alcanzar el mismo efecto fototóxico. Demostramos también la inducción de un mecanismo de muerte celular apoptótico en los cultivos de esferoides de células CT26. Finalmente, decidimos evaluar la terapia en un modelo aún más complejo, como es el modelo in vivo. En el trabajo con animales se añaden las complicaciones resultantes de la posible degradación de la formulación administrada por opsonización u otros procesos, la participación del sistema inmune, la biodistribución del FS, etc. Demostramos que la TFD con Pc9-T1107 en ratones Balb/c desafiados con células CT26 produjo un enlentecimiento significativo en la progresión del crecimiento tumoral, un incremento de áreas histológicamente necróticas en el tumor y un aumento en la sobrevida de los animales tratados. El tratamiento no generó toxicidad sistémica, ni en tejidos fisiológicamente relevantes, ni particularmente a nivel hepático. Además, se demostró que, al igual que en cultivos 2D y 3D, se desencadenó un mecanismo apoptótico de muerte celular. En su conjunto, los resultados obtenidos demostraron que la TFD con Pc9-T1107 resultó un tratamiento eficaz y potente para el tratamiento del CCR tanto en modelos in vitro (bi y tridimensionales) como in vivo (ratones Balb/c). La caracterización realizada del mecanismo de muerte celular facilitará en un futuro la evaluación de terapias combinadas con otras alternativas que posibiliten potenciar la eficacia terapéutica de Pc9-T1107, entre las cuales podríamos mencionar el empleo de inhibidores de autofagia - que participa como un mecanismo de sobrevida -, el uso de moléculas que promuevan el estrés del RE, o el empleo de FSs que inicien el daño oxidativo en otra organela, como por ejemplo FSs de localización mitocondrial. 169 En conclusión, nuestros estudios nos permiten postular a la formulación Pc9-T1107 como un agente de potencial interés terapéutico que podría, en un futuro cercano, ser utilizado en ensayos clínicos dirigidos a combatir, de manera más eficiente, una de las enfermedades malignas gastrointestinales más usuales, como es el carcinoma colorrectal.

En este trabajo se muestra que los microtúbulos de diversas fuentes y obtenidos por distintos métodos tienen asociados lípidos fosforilados, identificados como fosfolípidos, entre los cuales el más abundante es la lecitina. Además de fosfolípidos, los microtúbulos tienen asociada una actividad de diglicérido quinasa, capaz de fosforilar, a partir de ATP, diglicéridos también asociados a las preparaciones microtubulares o bien exógenos, para dar ácido fosfatídico. Esta diglicérido quinasa no es una parte de la actividad del sobrenadante, y sus propiedades son muy semejantes a las de otras diglicérido quinasas. La diglicérido quinasa asociada a microtúbulos no presenta propiedades diferentes a la proteína quinasa de la misma fuente, pero los sitios activos de ambas actividades serían diferentes. La alteración en la estructura o contenido en fosfolípidos asociados a microtúbulos por diversos tratamientos producen alteraciones que no se deben a desnaturalización en el desarrollo de turbidez o viscosidad de las preparaciones microtubulares, indicando que estos fosfolípidos pueden tener algún papel en la reacción de polimerización.

Las soluciones macromoleculares se convierten en birrefringentes y dicroicas al aplicar sobre ellas un campo eléctrico externo. Tanto la birrefringencia como el dicroísmo eléctricos se deben a que las moléculas en solución tienen, en general, propiedades ópticas anisotrópicas, y a que el campo eléctrico induce para éstas una orientación preferencial en el espacio. En el presente trabajo se estudia la birrefringencia y el dicroísmo eléctricos de fragmentos de la molécula ácido desoxirribonucleico (ADN) en solución salina. Se proponen tres objetivos específicos que, aunque se definen en términos de aplicaciones al ADN, contribuyen al desarrollo de las teorías electro-ópticas y a su aplicación a soluciones macromoleculares en general. El primer objetivo es analizar el efecto de la electroforesis junto con el acoplamiento hidrodinámico traslación-rotación de moléculas rígidas sobre la birrefringencia y el dicroísmo eléctricos del ADN. A tal fin se resuelve la ecuación de Fokker-Planck del sistema y se obtiene la función de distribución orientacional de las moléculas al aplicar el campo eléctrico, una vez alcanzado el estado estacionario. Los resultados obtenidos muestran que el acoplamiento hidrodinámico influye en las señales electro-ópticas en un amplio rango de intensidades de campo eléctrico, aunque resulta particularmente importante para intensidades relativamente bajas. Los desarrollos teóricos realizados se utilizan para ajustar datos experimentales de dicroísmo eléctrico de soluciones de ADN sonicado. El segundo objetivo consiste en estudiar el efecto del tamaño finito de las moléculas con respecto a la longitud de onda de la luz sobre las propiedades ópticas del ADN. El estudio se realiza utilizando la aproximación de dipolos discretos para describir las propiedades ópticas de las moléculas. Los resultados demuestran la importancia de incluir la inhomogeneidad del campo eléctrico de la luz incidente a través de las partículas y las interacciones intramoleculares, para estudiar cómo las diferentes partes de una molécula contribuyen a las propiedades ópticas de la misma. El tercer y último objetivo es estudiar la orientación de fragmentos de ADN en un campo eléctrico con métodos de simulación computacional. En virtud de la relativamente baja capacidad de cálculo que requiere, en este trabajo se optó por utilizar simulación dinámica de Langevin. Las moléculas se describen mediante un modelo simple constituido por una cadena de subunidades esféricas unidas mediante potenciales elásticos. Se introduce una función de orientación que describe el orden orientacional de las moléculas al aplicar un campo eléctrico. Los resultados muestran como el grado orientacional incrementa con la intensidad del campo eléctrico y como este orden tiende hacia la saturación.

La mayoría de los organismos posee al menos un simbionte que afecta su relación con el ambiente con consecuencias para la estructura y el funcionamiento de la comunidad. Los simbiontes de plantas incrementan su crecimiento al protegerlas contra herbívoros (p.ej.: hongos endófitos asexuales de pastos) o al proveerles de nutrientes (p.ej. bacterias fijadoras de nitrógeno de leguminosas). El objetivo general de esta tesis fue detectar vías por las cuales la presencia simultánea de dos tipos de simbiontes puede modular la relación entre plantas y sus consecuencias sobre procesos clave del ecosistema. La hipótesis fue que la interacción entre simbiontes genera beneficios tanto a las plantas hospedantes como no-hospedantes vecinas que favorecerían su coexistencia. Se desarrolló una serie de experimentos en los que se manipuló la presencia del hongo endófito Epichloë occultans en Lolium multiflorum y de rizobios (Rhizobium leguminosarum bv trifolii) en la leguminosa Trifolium repens. Se evaluó la capacidad de los simbiontes de modificar la relación entre hospedantes y no-hospedantes al afectar los intermediarios más importantes involucrados en su interacción: nutrientes, herbívoros y otros simbiontes. Se demostró que los endófitos y los rizobios afectan interactivamente la herbivoría de sus hospedantes. Además, los cambios en el suelo inducidos por el endófito incrementaron el crecimiento y la adquisición de nutrientes de la leguminosa en condiciones de baja disponibilidad de rizobios. Dado que cada simbionte solo afectó el crecimiento y la adquisición de nitrógeno de su hospedante, la presencia de ambos generó efectos aditivos en términos de captura total de nitrógeno y productividad primaria neta. En conclusión, la presencia simultánea de simbiontes en distintos hospedantes indujo múltiples cambios en el ambiente aéreo y subterráneo y propiedades emergentes que contribuyeron a los mecanismos de facilitación y complementariedad en el uso de los recursos de las plantas.

La soja es un miembro importante de la familia de las leguminosas y desempeña un papel primordial en la nutrición saludable. En Oriente, desde hace más de 5000 años, se emplea con éxito en la alimentación humana como poroto entero, harina tostada, poroto germinado y fermentado, leche, queso y salsa de soja, etc. Fue identificada como uno de los cinco granos sagrados conjuntamente con el arroz, el trigo, la cebada y el mijo, considerados esenciales para la supervivencia de su civilización. En el mundo occidental fue incorporada a través de los Estados Unidos recién a partir del siglo XX al conocerse su alto tenor en proteínas de alta calidad nutricional y las posibilidades tecnológicas de su utilización. Actualmente su uso se extendió como fuente de aceite y de proteínas en distintos alimentos proteicos a América del Sur (principalmente Brasil) y Europa (Erickson 1995). En Argentina, el cultivo de soja se realiza en forma consistente desde hace unos 30 años y se convirtió desde hace una década en el cultivo más importante del país haciéndolo el mayor productor per cápita del mundo, y el mayor exportador absoluto de aceite y de harina desgrasada. El complejo de la soja (poroto, aceite y pellets/harinas) se destina a exportación (>85%). Los pellets y las harinas se destinan fundamentalmente a la alimentación del ganado (Franco 2004). La proteína de soja se genera como un subproducto de la industria aceitera.

Este trabajo tuvo como objetivo general generar nuevos conocimientos que sirvan de base para el desarrollo de nuevos agentes tensioactivos derivados de amaranto. Se evaluó la incidencia que poseen cambios conformacionales de la estructura de proteínas y polipéptidos de reserva del grano de amaranto sobre su desempeño como posibles ingredientes tensioactivos, estudiando las propiedades de superficie de las proteínas de amaranto a nivel de interface y en el seno de la solución. El variado comportamiento detectado en las espumas preparadas en diferentes condiciones de pH, fuerza iónica y concentración, así como con las proteínas sometidas a los distintos tratamientos aplicados, térmico e hidrolítico, permitió pensar en el posible uso de estas proteínas en la formulación de diferentes alimentos espumados. Este amplio espectro de aplicación tecnológica tiene como base los cambios de conformación que experimentan estas proteínas frente a modificaciones del medio y a la repercusión de estos cambios a nivel de la interface aire-agua.