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Se ha demostrado que los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) atenúan ciertas modificaciones tisulares asociadas al envejecimiento. Numerosas evidencias indican que las especies activas del oxígeno (EAO) están involucradas en el proceso de envejecimiento. El objetivo de esta tesis fue investigar si los IECA poseían algún efecto sobre el metabolismo de las EAO. Con este fin se condujeron experimentos, in vitro e in vivo, para estudiar la posibilidad que los IECA pudieran a) atrapar radicales libres per se, y/o b) inducir las defensas antioxidantes endógenas. Los IECA utilizados fueron enalapril, lisinopril y captopril. Los estudios existentes en la literatura acerca de los efectos protectores de los IECA durante el envejecimiento utilizaron dosis hipotensoras de estos compuestos. Por ende, los resultados no pueden separarse de la acción de los mismos sobre la presión arterial. En el presente trabajo, a fin de poder independizar el efecto beneficioso de los IECA de su acción hipotensora, se estudió en primer lugar el efecto del tratamiento crónico (24 meses) con dosis de enalapril que no afectaran la presión arterial sobre cambios histológicos asociados al envejecimiento normal en ratones. Los resultados indican que, aún en las dosis utilizadas, el tratamiento crónico con enalapril atenúa i) las modificaciones en el peso del riñón y el corazón, ii) las fibrosis renal intersticial y cardíaca, y iii) la disminución del número de mitocondrias en los miocardiocitos asociadas al proceso normal de envejecimiento. En base a estos resultados, se emplearon tratamientos prolongados (11 semanas) con dosis no hipotensoras de enalapril o captopril para estudiar su efecto sobre parámetros de estrés oxidativo en el cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, eritrocitos y plasma de ratón. Se evaluaron las actividades de las enzimas superóxido dismutasa, selenio-glutatión peroxidasa, catalasa, glutatión reductasa, el contenido de glutatión, a-tocoferol, Bcaroteno, ubiquinol, y los niveles de marcadores de daño oxidativo a los lípidos y las proteínas. Ambos tratamientos incrementaron los niveles de las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas con respecto a los controles no tratados, aunque los resultados no fueron uniformes en cuanto a su magnitud, ni a la variedad de los tejidos involucrados. Esto podría explicarse por la diferente metabolización y/o penetración tisular del enalapril y el captopril. En los eritrocitos, utilizados como un sistema modelo ín vitro, el aumento de las defensas antioxidantes estuvo acompañado por protección contra el daño oxidativo. En ensayos in vitro se evaluó la capacidad antioxidante directa del enalapril, lisinopril y captopril. El captopril es un IECA que posee un grupo sulfhidrilo al que se le han atribuido propiedades antioxidantes, mientras que el enalapril y el lisinopril están desprovistos del mismo. Los resultados indicaron que el captopril posee capacidad atrapadora de radicales libres, aún en las bajas concentraciones plasmáticas que se alcanzan en los usos terapéuticos. Por el contrario, no se pudo detectar una acción antioxidante directa del enalapril y el lisinopril. Por último, se investigó el efecto de la administración prolongada de enalapril sobre las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas en pacientes sometidos a tratamiento hemodialítico crónico. En este modelo se utilizaron dosis hipotensoras de enalapril. Los datos demuestran que los pacientes en hemodiálisis (HD) crónica se encuentran en condiciones de estrés oxidativo cuando se los compara con controles sanos. Además, la administración de enalapril durante por lo menos 6 meses incrementa varias de las defensas antioxidantes en los eritrocitos y el plasma, en relación a los pacientes en HD crónica no tratados con enalapril. La incubación de superóxido dismutasa o de selenio-glutatión peroxidasa en presencia de enalapril o captopril no tuvo efecto sobre las actividades enzimáticas. Esto sugiere que los IECA aumentarían la actividad de las defensas antioxidantes enzimáticas por un mecanismo indirecto. Los niveles plasmáticos de óxido nítrico estaban elevados en los ratones tratados con enalapril o captopril durante 11 semanas. Debido a que se ha demostrado que la sobreproducción de óxido nítrico conduce a un moderado estrés oxidativo, y que éste último es capaz de actuar como un estímulo para la síntesis de las defensas antioxidantes en diferentes sistemas, se postuló que el aumento de las defensas antioxidantes de síntesis endógena inducido por los tratamientos prolongados con enalapril o captopril estaría mediado por la producción de oxído nítrico derivada de la acumulación de bradiquinina. Se concluye que el aumento de las defensas antioxidantes enzimáticas y no enzimáticas sería uno de los mecanismos mediadores de los efectos protectores demostrados por los IECA en el envejecimiento, así como en diversas situaciones experimentales y clínicas. Este efecto de los IECA abriría nuevas perspectivas con respecto a los mecanismos que subyacen las acciones terapéuticas de estas drogas.

El presente trabajo se realizó para aportar información sobre el comportamiento contráctil del miocardio frente a los agentes inhibidores de las fosfodiesterasas de nucleótidos - cíclicos y su relación con dichos nucleótidos. Se decidió investigar la interacción entre los niveles - intracelulares de AMPc y GMPc y la actividad de la proteína - quinasa AMPc-dependiente luego de la administración de los in hibidores de las fosfodiesterasas en corazón de rata aislado y perfundido,debido a los resultados contradictorios previamente descriptos para dichos inhibidores en diferentes especies (41,84-85,104-105,118,145-147). Como así también para - tratar de esclarecer el rol del GMPc en la mecánica cardíaca ya que se ha sugerido que dicho nucleótido modula el efecto - inotrópico positivo del AMPc (71,130-131,143,148-154).

Se sabe que los productos naturales constituyen una de las mayores fuentes de materia prima para el desarrollo de medicamentos y agentes antimicrobianos, debido a su diversidad química y a que se les supone una toxicidad inicial limitada al encontrarse en seres vivos. Requieren menor costo de obtención y procedimientos relativamente sencillos, si se comparan con los procedimientos de obtención por la vía de la síntesis química. Las fuentes vegetales de inhibidores peptídicos de proteasas (IPPs) han sido escasamente exploradas y tienen la ventaja de su extraordinaria riqueza y diversidad y, en muchos casos la inexistencia de patentes y procedimientos de extracción, dificultan su explotación. Los estudios referidos a material botánico de la flora latinoamericana son más escasos aún. Por ello, resulta de sumo interés el estudio de nuevos IPPs de origen natural para su potencial implementación como aditivo natural alimentario; así como el estudio de su vehiculización al sistema gástrico cuando forman parte de alimentos, sus absorciones, estabilidades y acciones orgánicas en tejidos centrales y periféricos.

Dentro de este marco actualizado sobre el conocimiento de la lixiviación bacteriana, el presente trabajo de tesis doctoral ha sido dedicado precisamente al estudio del problema de la adherencia del Thiobacillus ferrooxidans sobre algunos soportes utilizables en la formación de bio-películas (vidrio, silicagel y también ganga de mineral sulfurado que está, por razones obvias, disponible en grandes cantidades en zonas donde pudiera aplicarse el proceso de lixiviación bacteriana) mientras que la adherencia del Thiobacillus thiooxidans fue limitada al caso de azufre elemental como soporte y sustrato simultáneamente debido a que este microorganismo no utiliza substratos solubles de interés en zonas mineras. El estudio de la adherencia del Thiobacillus ferrooxidans fue dirigido inicialmente a la influencia de la presencia de cada uno de los soportes elegidos sobre el crecimiento bacteriano y sobre la evolución de los productos de la acción bacteriana en el cultivo, en particular los insolubles. En una segunda etapa se estudió la importancia de estos depósitos insolubles en la formación de las bio-películas lo que provocó la necesidad de analizar la incidencia del pH inicial del cultivo en la formación de aquellos depósitos y, por ende, en la formación de las bio-peliculas. Posteriormente, el estudio estuvo dedicado a la formación de bio-películas de Thiobacillus ferrooxidans sobre los soportes elegidos en columnas percoladoras analizando la productividad de hierro(lll) en función del número de ciclos de crecimiento y de la velocidad de dilución. Paralelamente, se realizo la formación de bio-peliculas de Thiobacillus thiooxidans inmovilizado sobre azufre elemental para la producción continua de ácido sulfúrico.

Fil:Coulombié, Félix Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

INTRODUCCIÓN: La interacción de MICA con el receptor activador de citotoxicidad NKG2D (expresado en células NK y linfocitos T Ɣδ y αβ CD8+), desencadena una respuesta citotóxica contra células que expresan MICA. MICA se induce por estímulos de estrés, infecciones, neotransformación o linfocitos T activados con fitohemaglutinina. OBJETIVOS: a) estudiar la expresión de MICA en linfocitos T activados con estímulos fisiológicos; b) investigar los mecanismos moleculares involucrados y; c) investigar las consecuencias funcionales de dicha expresión. RESULTADOS: Por Western Blot, RT-PCR y citometría de flujo se observó que MICA se induce en linfocitos T presentes en células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) por estimulación con células alogeneicas, por microagregación del complejo TCR/CD3 o por coestimulación con la molécula CD28 y PMA. Los niveles de expresión de MICA alcanzaron una meseta a los 4-7 días post-estímulo. Empleando inhibidores farmacológicos, observamos que la expresión de MICA inducida por la microagregación del complejo TCR/CD3, o la coestimulación a través de CD28 y PMA involucran a Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56 y Jak. Asimismo, la inhibición farmacológica de NF-kB bloqueó la expresión de MICA en linfocitos T activados de la misma manera. Detectamos un sitio de unión KB localizado en el primer intrón del gen de MICA, y por ensayos de supershift observamos que esta secuencia une a los dímeros p65(RelA)/p50 y p50/p50 presentes en extractos nucleares de linfocitos T activados. Asimismo, la sobreexpresión de RelA en células HeLa por transfección transitoria incrementó los niveles de MICA, confirmando que la expresión de dicho gen es regulada por NF-kB. Además, por Western Blot observamos que CMSPs estimuladas con las citoquinas mitogénicas IL-2 e IL-4, lo mismo que linfocitos T polarizados hacia un perfil Th1 o Th2 inducen la expresión de MICA. Linfocitos T CD4+ purificados y activados con PMA e Ionomicina, pero no linfocitos T CD4+ presentes en CMSPs, expresan MICA en su superficie. Por ensayos de transwell, observamos que este fenómeno se debe a un factor soluble liberado por CMSPs activadas. Además, linfocitos T CD4+ activados con PMA e Ionomicina son blancos de citotoxicidad por células NK autólogas activadas con IL-2 (LAK). El bloqueo de la interacción MICA-NKG2D con AcMo anti-MICA mostró que MICA juega un rol menor en dicha respuesta. CONCLUSIONES: MICA se induce en linfocitos T activados por estímulos fisiológicos e involucra a la señalización de Lck/Fyn, ERK1/2, calcineurina, p38 MAPK, p70 56k, Jak y al factor de transcripción NF-kB. La expresión de MICA en superficie de linfocitos T tiene un rol menor en la lisis por células NK activadas. En esta tesis se describen por primera vez algunas de las vías de transducción de señales y un factor de transcripción involucrados en la expresión de MICA. Los resultados presentados sugieren además que la interacción MICA-NKG2D podría constituir un nuevo mecanismo de regulación de la respuesta inmune adaptativa.

La alergia a las proteínas que contiene la leche de vaca (LV) es la alergia alimentaria más frecuente en nuestro país, y en muchas regiones del mundo, y se presenta principalmente en niños menores de 3 años (6 á 8%). La alergia puede presentarse desde los primeros meses de vida debido a la exposición temprana a las proteínas de leche de vaca, y se estima que en el 80-90% de los pacientes aproximadamente se inducen los mecanismos de tolerancia específica a partir de los 3 a 6 años de vida que permiten un adecuado control inmunológico de estos alergenos en la mucosa gastrointestinal. Para su tratamiento la primera elección terapéutica es la dieta de supresión, evitando toda estimulación antigénica. Sin embargo, en lactantes significa una tarea muy difícil y debe reemplazarse por un sustituto lácteo, que generalmente son hidrolizados extensivos de las proteínas de LV. Un sustituto alternativo frecuentemente empleado en nuestro medio son las fórmulas a base de proteínas de soja. Aunque suelen ser tolerados por la mayoría de los pacientes la literatura internacional describe que un 15-40% de los pacientes alérgicos a las proteínas de LV no toleran las proteínas de soja, aún cuando no han sido previamente expuestos a la soja. Nuestro grupo ha descripto la existencia de reactividad cruzada entre las proteínas de LV y de soja lo cual permite explicar la intolerancia descripta (Rozenfeld et al.2002; R Curciarello et al. 2008; Smaldini et al. 2011). Otra dificultad que el médico debe considerar con la familia del chico alérgico, y no es menor, es el hecho que las proteínas de la leche (y de la soja) son frecuentemente utilizadas por la industria alimenticia como suplemento por sus propiedades funcionales. Esto determina que la educación del paciente y su entorno en cuanto a qué alimentos pueden comer y cuáles no es un punto fundamental en el tratamiento. Inclusive estas proteínas también pueden presentarse como alergenos ocultos no declarados por el fabricante, o como contaminantes de un alimento. A partir de estas observaciones, en este trabajo se decidió optimizar un modelo murino de alergia a proteínas de leche bovina, previamente desarrollado por el grupo, para su posterior empleo como herramienta in vivo para distintos tipos de estudios. En este trabajo de tesis, el mismo se ha empleado para evaluar potenciales estrategias terapéuticas basadas en la inmunomodulación. De esta manera hemos logrado re-direccionar el sistema inmune, o la respuesta inmune Th2-dependiente específica de alergenos de la leche bovina administrando por mucosas proteínas de membrana de Brucella abortus, bacterias muertas del género Actinomycetales, y proteínas de leche de vaca o de soja. En los 3 casos los mecanismos inmunológicos inducidos son diferentes, pero tienen en común que cuando el animal alérgico y tratado es expuesto a proteína de leche bovina por vía oral, los síntomas inducidos son más suaves en comparación con un ratón alérgico no tratado. Estos resultados son alentadores para el desarrollo de futuras terapias inmunomodulatorias a aplicar en pacientes con alergia alimentaria explotando la posible modulación de la inmunidad sistémica a través de la manipulación del sistema inmune asociado a mucosas, y de la interconexión que existe entre las mismas. Es importante resaltar que en un individuo no alérgico la tolerancia oral es el proceso que evita la instauración de mecanismos de hipersensibilidad frente a la exposición a antígenos de la dieta y de la flora comensal en la mucosa gastrointestinal. En individuos alérgicos, y por razones aún no completamente dilucidadas, fallas en los mecanismos de tolerancia a los alergenos que ingresan por la vía oral determinan una activación aberrante del sistema inmune local y sistémico, y la consiguiente instauración de un proceso inflamatorio en la mucosa. Hay trabajos que demuestran que el balance tolerancia vs activación en estos pacientes no funciona adecuadamente (Sicherer y Sampson 2006; J. Wang y Sampson 2011) y los estudios aquí planteados podrían ser la base experimental para el desarrollo de futuras terapias preventivas o correctivas.