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Triatoma infestans es un insecto de alta importancia sanitaria en Latinoamérica debido a su rol como vector de la enfermedad de Chagas. Este insecto es controlado mediante el rociado de las viviendas con insecticidas. A partir de las década de 1980, las medidas de control se focalizaron en el uso de la deltametrina, un insecticida de alta efectividad triatomicida y baja toxicidad en humanos. Sin embargo, a fines de la década de 1990 se detectaron fallas de control que fueron correlacionadas con una disminución de la efectividad del compuesto en las poblaciones de insectos. El desarrollo de resistencia a deltametrina fue detectado en diferentes localidades de Argentina y Bolivia, y durante los primeros años de la década 2000 ha sido causal de la disminución de la efectividad de los rociados con deltametrina. En este trabajo de tesis se determinó el alcance de la zona resistente en las provincias de Salta, Santiago del Estero y Chaco. Se evaluaron distintas localidades en cada provincia y se demostró que existen poblaciones de vinchucas con alto y mediano grado de resistencia, como así también prevalecen las áreas con T. infestans susceptibles a la deltametrina. Con el fin de determinar la posible reversión de la resistencia a deltametrina, resultó de interés determinar el modo de herencia de la resistencia a deltametrina en T. infestans. Se condujeron cruzamientos recíprocos de insectos susceptibles y resistentes, y se evaluó el grado de resistencia en la descendencia. Se demostró que la resistencia a este insecticida se hereda de manera autosómica y semidominante, y que se trata de un carácter determinado por al menos un gen mayoritario. Además, se evaluó la respuesta a la deltametrina en generaciones sucesivas de T. infestans resistentes, y se determinó la estabilidad de esta característica en poblaciones de campo y laboratorio. Mediante el uso de bioensayos se determinó la toxicidad de la deltametrina en los distintos estadios de desarrollo de T. infestans. Este ensayo demostró que la cantidad de insecticida necesario para eliminar al cincuenta por ciento de los insectos de una población susceptible aumenta con el estadio, y que la ninfa V es el estadio más tolerante al tratamiento químico. Por otra parte, se verificó que la resistencia a la deltametrina se expresa en todos los estadios de desarrollo. Además, se verificó que la ninfa V representa el estadio más resistente al insecticida en estudio, en comparación con la cepa susceptible. La confección de una tabla de vida permitió determinar las variaciones en el ciclo de vida del vector, en relación a la expresión de la resistencia. La evaluación de la duración de los estadios permitió demostrar que existen diferencias significativas entre la duración de los estadios II, III y V de las cepas susceptible y resistente. La mayor contribución a las diferencias estuvo dada por la duración de la ninfa V, la que presentó una duración significativamente mayor en la cepa resistente. Estos resultados sugirieron que la ninfa V ocupa un lugar clave en la estructura de las poblaciones resistentes a insecticidas mediante un mecanismo doble de resistencia: un alto grado de resistencia toxicológica, y un posible comportamiento de letargo de desarrollo asociado al refugio de la aplicación de insecticida. Además, la estructura poblacional fue evaluada mediante la confección de una matriz poblacional de estadios para las cepas susceptible, resistente, y sus cruzas recíprocas. La proyección de esta matriz demostró una menor tasa reproductiva en las cepas resistentes, en relación a la susceptible. El análisis prospectivo y retrospectivo de los parámetros poblacionales demostró que la causa fundamental de las diferencias en la tasa de crecimiento está asociada a una importante disminución de la fecundidad de las hembras resistentes. Además, se detectó una fuerte contribución de la duración de la ninfa V en este estadio, posiblemente debido a su asociación directa con la muda al estadio reproductivo. Los resultados de este trabajo de tesis indican que la resistencia a la deltametrina está presente en las provincias de Salta y Chaco. Además, se demuestra que es posible el cruzamiento entre insectos de zonas distantes geográficamente, y que el cruzamiento entre insectos susceptibles y resistentes genera una disminución amplia del grado de resistencia. Sin embargo, se observa que existen diferencias reproductivas entre las poblaciones susceptibles y las resistentes a deltametrina. Estas diferencias podrían estar asociadas a la resistencia a deltametrina y manifestarse no sólo con una menor fecundidad, sino como un cambio en la estructura poblacional y las tasas de muda al estadio adulto.

El desarrollo de herramientas computacionales para el cálculo y análisis de datos se encuentra actualmente en constante expansión en diferentes campos de la ciencia, particularmente en el campo de las ciencias de la vida, donde la cantidad de datos disponibles, generados por nuevas técnicas experimentales convierte en fundamental la implementación de técnicas computacionales para el análisis y manejo de datos y su transformación en conocimiento. En este sentido, focalizándose en el campo de la bioinformática estructural de proteínas y la quimioinformática, nos hemos concentrado en la generación de herramientas y aplicación de las mismas en problemas relacionados con la salud humana. El presente trabajo de tesis tiene como primer objetivo proponer nuevos procedimientos para el descubrimiento de blancos proteicos relevantes en organismos bacterianos, usando como caso de estudio Mycobacterium tuberculosis . El segundo objetivo de esta tesis es el de, seleccionado el blanco proteico dentro de un genoma de interés, estudiar cuáles son las características que debiera cumplir una molécula para tener buenas probabilidades unirse a dicho blanco y a partir de la misma proponer posibles ligandos derivados de bases de datos de compuestos. El tercer objetivo de esta tesis es poder comprender y predecir cuáles serán los efectos en la función de una proteína determinada (potencialmente cualquiera que sea de interés del usuario) de mutaciones no sinónimas que se produzcan en su secuencia. Los tres objetivos han sido abordados desde un punto de vista computacional y todos los métodos desarrollados pueden considerarse herramientas i nsilico. Más allá de su aplicación en organismos o proteínas puntuales como casos de estudio, todos los desarrollos pueden ser extendidos y reutilizados de manera directa y automática sobre otros organismos o proteínas. Los resultados obtenidos han sido validados contra la literatura existente, permitiendo reproducir resultados experimentales y/o manualmente curados de una manera automática, lo que supone una reducción de tiempo y recursos en los procesos en los que estas herramientas están involucradas.

Durante la última decada, varios estudios han mostrado que la anotación automática de genomas resuelve muy bien el problema de recuperar informaci ón a partir de una secuenciación. A su vez, esto favoreció el crecimiento desmedido en la cantidad de genomas depositados en bases de datos que poseen una anotación automática, para los cuales se volvería imposible realizar experimentos sobre cada uno de los genes presentes en éstos genomas de manera de mejorar el conocimiento disponible. Es por esto que, obtener una estructura molde para construir un modelo 3D de una determinada secuencia, es una herramienta poderosa para entender las funciones de las proteínas. Una vez modelada la estructura, las interacciones presentes en ella aportan información de la función proteica. En esta tesis desarrollamos un pipeline bioinformático que a partir de la secuencia de un genoma bacteriano puede identificar las regiones codificantes, anotar su función y computa diversas propiedades de las proteínas codificadas. En una segunda etapa desarrollamos un pipeline de predicción de estructura secundaria y terciaria de proteínas que se integró con el sistema anterior. Finalmente, mediante el desarrollo de una base de datos de interacciones de amino ácidos basada en el PDB, estudiamos en detalle las interacciones aromáticas. Los anillos aromáticos forman clusters de interacciones que tienen particularidades que difieren según hayan sido encontrados en el interior de las proteínas o regiones de interacción proteína-ligando o interfaces de interacción proteína-proteína.

Objetivos del trabajo de tesis: Aportar estudios sobre fármacos antichagásicos actualmente en uso, que permitan proponer farmacoterapéutica racional de la Enfermedad de Chagas, en contexto de pediatría. La población pediátrica ha sido huérfana de estudios farmacológicos para esta patología, aunque los fármacos hoy en uso han demostrado una gran efectividad potencial. A su vez, se busca mejorar los protocolos de tratamiento actualmente existentes, para permitir un uso más seguro y racional de los fármacos en niños y eventualmente en adultos.

Numerosos brotes de gastroenteritis virales alrededor del mundo han sido causados directa o indirectamente por aguas contaminadas. Sin embargo, la calidad microbiológica de las aguas se evalúa mediante indicadores bacterianos que no siempre correlacionan con la presencia de virus patógenos contaminantes. Existe un consenso general sobre la necesidad de utilizar indicadores microbiológicos alternativos, subrogantes de virus patógenos, que se sumen a los actuales. Se han propuesto distintos marcadores virales como indicadores de contaminación fecal y de la presencia de virus en distintas matrices hídricas. El objetivo general de este trabajo es estudiar la contaminación virológica en muestras de aguas superficiales y en efluentes cloacales e industriales, desarrollando metodologías específicas para este fin. En este trabajo se evaluó: - la utilidad de los bacteriófagos F-ARN y de los poliomavirus humanos (HPyV) como indicadores de contaminación fecal/viral, - su comportamiento frente a los tratamientos a los que son sometidos los efluentes y - la correlación con la presencia de un agente patógeno viral (norovirus, NoV), en comparación con los indicadores tradicionales (coliformes termotolerantes). Además, se implementó la detección molecular de HPyV, poliomavirus bovinos (BPyV) y adenovirus aviar (AdV aviar) para determinar el origen de la contaminación microbiana. Se recolectaron 52 muestras de efluentes crudos y tratados de plantas de tratamiento de aguas residuales (WWTP) provenientes de actividades domésticas humanas, mataderos de animales para el consumo (bovinos, equinos), granjas de cerdos y aves de corral y una industria láctea. Además,se recolectaron 12 muestras de aguas superficiales. La cuantificación de los marcadores virales se realizó mediante un ensayo de doble capa de agar para los bacteriófagos, por PCR en tiempo real cuantitativa para los HPyV y NoV y por la técnica del número más probable (NMP) o filtro membrana para los coliformes. Para determinar el origen humano o animal de la contaminación se realizaron PCRs multiplex anidadas de punto final dirigidas a HPyV, BPyV y AdV aviar. Los indicadores bacterianos fueron detectados y cuantificados en todas las muestras de aguas residuales domésticas, industriales y superficiales, con valores mayores a 103 NMP/100 ml en aguas residuales y valores entre 1,60 x 103 a 5,20 x 105 UFC/100 ml en aguas superficiales. Los bacteriófagos alcanzaron títulos de 4,33 x 102 a 4,40 x 104 UFP/ml en los efluentes crudos y 6,33 x 101 a 7,37 x 103 UFP/ml en los efluentes tratados y de 6 a 290 UFP/ml en las aguas superficiales, con escasa detección en los residuos industriales de origen equino. La evaluación de la eficacia de tratamiento en las plantas de aguas residuales domésticas e industriales mostró una tendencia de menor reducción de los bacteriófagos y de los HPyV con respecto a las bacterias indicadoras frente a un mismo tratamiento. En las aguas domésticas, los indicadores propuestos F-ARN y HPyV se correlacionaron significativamente con un patógeno viral humano, norovirus, mientras que el indicador bacteriano no lo hizo, por lo que fueron mejores predictores del comportamiento de los virus patógenos entéricos en dichas matrices. En las aguas superficiales no se encontró ninguna correlación entre las concentraciones de los indicadores virales y bacterianos ni tampoco entre los indicadores y norovirus. Proponemos distintos factores que afectan la dinámica de estos parámetros en aguas superficiales, a diferencia de lo que ocurre en las aguas residuales. Por otro lado, los BPyV fueron detectados con una prevalencia del 100 % en los efluentes del matadero bovino y 66 % en la industria láctea. Los HPyV se encontraron presentes en todas las muestras de aguas domésticas y en 2 muestras del matadero bovino y 1 de las aguas residuales de la industria láctea. El AdV aviar sólo fue detectado en granjas de aves de corral. Análisis de secuenciación demostraron que las detecciones fueron específicas. En cuanto a los bacteriófagos, además de su uso potencial como indicadores virales de contaminación y de eficacia de los tratamientos de efluentes, se analizó su posible rol en la diseminación de genes de resistencia antimicrobiana (GRA) en el ambiente. Se analizaron los alelos de β-lactamasas TEM y CTX-M diseminados en aguas residuales por medio de bacterias o bacteriófagos, mediante detección molecular directa de GRA, sin crecimiento microbiano previo. Los genes blaTEM se detectaron con una alta frecuencia en genomas bacterianos y de fagos, siendo blaTEM-116 el más prevalente, mientras que también se encontró un tipo recientemente descrito, blaTEM-229. Por otro lado, detectamos 4 de los 5 grupos de los genes blaCTX-M (blaCTX-M9, blaCTX-M2, blaCTX-M1, y blaCTX-M25). La detección de algunos de estos alelos fue inesperada según los GRA de circulación regional en patógenos clínicos. La diversidad de CTX-M encontrada en los bacteriófagos sugiere que los fagos podrían usarse como "reporteros" de los GRA que están circulando entre la población bacteriana. En resumen, en este trabajo de Tesis se implementaron diferentes técnicas para evaluar la contaminación viral en aguas residuales y superficiales, se desarrollaron herramientas virológicas para establecer si la contaminación se asocia a un origen humano, bovino o aviar y se abordó la caracterización de los bacteriófagos como vehículos de genes de resistencia antimicrobiana en aguas residuales. La aplicación de estas metodologías en diversas muestras hídricas permitió presentar resultados pioneros en la caracterización de la contaminación viral de aguas en nuestro país, mediante el estudio de virus muy diversos, que tienen como hospedadores al hombre, distintos animales y bacterias.