Catálogo de publicaciones

El Complejo M tuberculosis (CMT) está formado por distintas especies de micobacterias entre las que se encuentra el agente causal de la tuberculosis en humanos, Mycobacterium tuberculosis y micobacterias responsables de enfermedades zoonóticas como M. bovis, M. microti y M. pinnipedii. La genómica comparativa en micobacterias brinda una vasta información acerca de la relación entre los genomas de distintas micobacterias pertenecientes al CMT. En la primera parte de este trabajo se estudió la Región de Repeticiones Directas (DR). Esta región está compuesta por repeticiones directas conservadas de 36pb separadas por secuencias no repetitivas llamadas espaciadores (sps). El polimorfismo observado en esta región entre aislamientos de micobacterias pertenecientes al CMT dio origen a la técnica de tipificación, ampliamente aplicada en tuberculosis denominada Spoligotyping. La secuenciación y comparación de la región DR entre distintos aislamientos argentinos de M. bovis permitió encontrar 5 espaciadores nuevos. Estos espaciadores conjuntamente con una colección de otros descriptos previamente, fueron incluidos en una nueva membrana de spoligotyping obteniéndose un total de 104 espaciadores. La utilización del spoligotyping de lO4-sps. permitió la diferenciación de aislamientos del CMT en 174 spoligotipos, mientras que el uso de la membrana tradicional tipificó estos mismos aislamientos en 160 spoligotipos distintos. Particularmente para M. bovis se obtuvo un incremento de 17 a 26 spoligotipos respectivamente. El análisis comparativo in silico en micobacterias no pertenecientes al CMT como M. smegmatis, M. avium, M. marinum y M. leprae, permitió establecer que los marcos de lectura abiertos (MLAs) flanqueantes a la Región DR de M. tuberculosis, se encuentran adyacentes entre sí en estas otras micobacterias. En cambio en el genoma de M. tuberculosis esta región comprende 24kb. que incluyen 23 MLAs así como la región DR ausentes en las mencionadas micobacterias. Este resultado fue corroborado in vitro mediante amplificación por PCR. Debido a la ausencia del locus DR descripto y los MLAs adyacentes, en M. avium y M. smegmatis y debido a que estas micobacterias fueron descriptas como más antiguas que M. tuberculosis, se postula que esta región podría haber sido adquirida por las especies del CMT o por un ancestro común a ellas a lo largo del proceso evolutivo. La segunda parte de este trabajo implicó el estudio de la variabilidad genética entre distintos aislamientos de M. bovis, M. microti y M. pinnipedii, estas últimas responsables de tuberculosis en ratones de campo denominados “vole” y en mamíferos marinos respectivamente, mediante comparación de genomas completos. Se encontró una nueva deleción en M. microti denominada MiD4. Esta región remueve 5 genes que codifican para antígenos de la familia ESAT-6 y PE-PPE. En M. pinnipedii se encontraron dos nuevas deleciones, PiD1 que removió dos genes, uno de los cuales codifica para una oxidoreductasa (Rv3530c) involucrada en el metabolismo celular. La segunda deleción PiD2, fue denominada como RD2seal debido a estar superpuesta con la región de 10.7kb, RD2, ausente en algunas M. bovis BCG. Esta región abarca los genes Rv1977 y Rv1978. Los experimentos de Southern blot mostraron que MiD4 está también ausente en M pinnipedii, en cambio PiDl es una deleción específica para M. pinnipedii. Por otra parte mediante la comparación del genoma de M. bovis con el genoma de M. tuberculosis in silico, se pudieron identificar nuevos marcadores capaces de diferenciar entre estas dos especies y respecto de otras especies del CMT. Uno de estos nuevos marcadores denominado rpfA presentó polimorfismos en los aislamientos de M. bovis estudiados, lo que podría ser usado en la tipificación y diferenciación.

Objetivos generales de la tesis: Con el desarrollo de esta propuesta se espera contribuir al conocimiento que sirva de base para el diseño de una vacuna más efectiva contra pertussis, no sólo en términos generales, sino en lo que se refiere a su efectividad en Argentina, determinando la definición de la/s cepas / componentes a incluir en una nueva formulación. Objetivos específicos de la tesis: En este marco conceptual y tomando como hipótesis la divergencia de la población bacteriana circulante respecto a las cepas vacunales hoy en uso, se proponen los siguientes objetivos: 1-Caracterizar mediante la aplicación de técnicas de genómica funcional los aislamientos de B. pertussis locales. Identificar de nuevos inmunógenos. Los aislamientos clínicos de nuestra colección han sido previamente agrupados en base a sus divergencias a nivel de las secuencias que codifican para antígenos específicos, así como en su genoma completo a través de los ensayos de PFGE y los años en que fueron aislados. Proponemos abordar la búsqueda de diferencias específicas, a nivel de expresión génica, entre los aislamientos circulantes y las cepas que hoy se usan en la producción de vacunas. Para ello hemos emplearemos herramientas de genómica funcional, proteómica e inmunoblot; para identificar potenciales candidatos vacunales a incorporar en una formulación acelular. 2-Analizar la relevancia de la divergencia genética entre la Población Bacteriana Circulante (PBC) y las cepas vacunales respecto a la protección contra pertussis. Para abordar este punto emplearemos el modelo animal de desafío intranasal. Consideramos que la información obtenida marcará la necesidad o no de incluir determinadas variantes polimórficas para obtener una nueva vacuna más efectiva. El abordaje de este aspecto se espera también contribuya al conocimiento general de la adaptación y evolución bacteriana bajo la presión de selección ejercida por las diferentes estrategias de vacunación (celular/acelular).