Catálogo de publicaciones

El presente trabajo de tesis se propone utilizar las herramientas que provee la ingeniería genética para controlar las infecciones producidas por el virus PVY en plantas de papa, aportando nuevos métodos de diagnóstico para un mejor control de calidad de la semilla, y en combinación con las técnicas de transformación vegetal, modificar cultivares comerciales con el fin de lograr resistencia al virus mediante la estrategia de protección mediada por la cápside Con este fin se establecieron los siguientes objetivos: a) Realizar el clonado molecular del genoma del virus PVY. b) Utilizar clones de cDNA como sondas de hibridación molecular para el diagnóstico. c) Expresar la proteína de cubierta del virus en bacterias para para ser utilizada como antígeno en la producción de anticuerpos policlonales. d) Diseñar nuevas técnicas de diagnóstico basadas en la utilización de anticuerpos. e) Construir genes quiméricos capaces de expresar en plantas la proteína de cubierta del PVY. f) Efectuar la transformación de plantas de papa con las construcciones quiméricas mencionadas en el punto anterior. d) Establecer la existencia de resistencia antiviral en las plantas de papa transgénicas.

En nuestro medio, la carencia de métodos adecuados para la determinación de prolaminas en alimentos constituye uno de los graves incovenientes asociados a la enfermedad celíaca. El método oficial actualmente empleado, para la determinación de gliadinas en alimentos, es la inmunoprecipitación en gel. Esta es una técnica de baja sensibilidad, característica que sumada a la escasa solubilidad de las prolaminas, impide la correcta evaluación del contenido de gliadinas en la muestra. En nuestro país no existe reglamentación oficial que exija la determinación del contenido de prolaminas en los alimentos, ni el rotulado de los mismos. Al respecto, la Organización Mundial de la Salud sugiere que un alimento exento de gluten debe contener menos de 1 mg de dichas proteínas por cada 100 g de producto seco. Por lo tanto, si bien algunos productos comerciales nacionales, llevan en su etiqueta la denominación "Sin TACC", en realidad, este hecho es sólo una declaración de buena fe del fabricante y no una certificación del contenido real de prolaminas del producto. Otro problema de relevancia lo constituye el diagnóstico de la enfermedad. El mismo requiere del estudio de biopsias duodenales, procedimiento invasivo y traumático, en especial para los niños. Debe tenerse presente que la enfermedad celíaca es de alta incidencia poblacional, con un valor estimado de 1:1000 en los casos con sintomatología. Sin embargo, la incidencia real puede alcanzar valores cercanos a 1:300 al incluir los pacientes asintomáticos. La alta proporción de estos pacientes demanda la implementación de pruebas de "screening" masivas. Para tal fin, la determinación de anticuerpos anti-gliadinas podría ser de utilidad. Sin embargo, la dificultad de estandarización de los inmunoensayos conduce a resultados discordantes respecto a las características de estos test. En relación a lo expuesto, los objetivos generales de este trabajo consisten en la optimización de inmunoensayos de alto nivel de detección y especificidad, para la determinación de prolaminas en alimentos y el desarrollo de un ensayo serológico de utilidad para la evaluación de enfermos celíacos. Para el logro de los objetivos indicados, se propone: 1. - Estudiar las propiedades fisicoquímicas de las prolaminas de trigo, cebada y centeno, en relación a su extracción, separación y análisis cuantitativo. 2. - Desarrollar métodos cromatográficos de purificación de prolaminas. 3. - Desarrollar un inmunoensayo cuantitativo con anticuerpos policlonales anti-gliadinas para la determinación de proteínas nocivas en alimentos destinados al consumo por enfermos celíacos. 4. - Producir y caracterizar anticuerpos monoclonales anti-prolaminas. 5. - Optimizar inmunoensayos cuantitativos con anticuerpos monoclonales. 6. - Aplicar las prolaminas purificadas al análisis de la reactividad de los anticuerpos séricos de enfermos celíacos. 7.- Desarrollar un inmunoensayo como prueba serológica para la evaluación de pacientes celíacos.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Altos Estudios Espaciales "Mario Gulich". Comisión Nacional de Actividades Espaciales. Universidad Nacional de Córdoba. 2013-164 h. con Anexos + CD. tabls.; grafs. Contiene Referencia Bibliográfica.+ Copias de Publicaciones Derivada de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Boccardo, N. A. (2018). Desarrollo de nuevos vectores para la obtención de plantas transplastómicas resistentes a patógenos. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

En la actualidad los subproductos agroindustriales constituyen una importante fuente de diferentes compuestos fitoquímicos que pueden aprovecharse en distintas áreas desde un punto de vista biotecnológico, o como ingredientes alimentarios. El objetivo general del presente trabajo de tesis fue desarrollar una formulación saludable y sensorialmente aceptable de un producto panificado libre de gluten, adicionada con bagazo de manzana (BM), rico en fibra dietaria (FD) y con mínimo procesamiento. Se deshidrató y caracterizó el bagazo obtenido como subproducto de la industria de jugo de manzana (Jugos S.A., Rio Negro). A lo largo del trabajo, se utilizaron tres bagazos correspondientes a los años 2010, 2012, 2014. El bagazo de manzana fue secado a 50°C, molido y tamizado por criba de 250 μm. Se obtuvo un polvo aromático y de color marrón, cuya composición porcentual presentó los siguientes rangos de valores: humedad, 5,88-14,01 %; proteína, 4,28-7,03 %; y cenizas, 0,84-1,77 %. Los contenidos de FD y de glúcidos distintos de fibra quedaron determinados por las condiciones de procesamiento en la planta; la FD varió entre: 41,04 y 67,91 % y la fibra cruda entre 24,10 y 43,19%. La actividad de agua del BM deshidratado varió entre 0,4 y 0,5, lo que permitió asegurar la estabilidad del producto desde el punto de vista microbiológico. El tamaño de partícula registró una distribución bimodal, en donde los diámetros de Sauter fueron 0,84 μm para la población principal y 241,03 μm para el resto de la población de partículas. Se realizaron ensayos preliminares con una formulación base para seleccionar la fuente proteica más adecuada para otorgarle estructura y volumen a la matriz sin gluten. Se evaluaron y compararon los siguientes ingredientes ricos en proteína: leche en polvo, suero de leche concentrado bajo en lactosa, suero de leche microparticulado y clara de huevo (CH). Otros ingredientes utilizados, además del BM fueron: fécula de mandioca (FM), harina de arroz (HA), levadura, margarina, NaCl, aditivos mejoradores de panificación (emulsificante, celulosa modificada), leudante químico y agua. Se escogió la formulación con CH la cual presentó el mayor volumen específico. Se definió además el perfil de producto comparando una formulación con NaCl y sin sacarosa agregada respecto a una sin NaCl y con sacarosa. La adición de BM disminuyó el volumen específico significativamente en comparación con las formulaciones control (sin BM, con sacarosa o NaCl). Por los resultados obtenidos se optó por un producto con CH como fuente proteica, sin NaCl, con sacarosa adicionada y HPMC (celulosa modificada). De acuerdo a lo observado mediante microscopia láser confocal de barrido (CLSM) con fluoróforos específicos (Rodamina B para proteína, FITC para almidón, Calcofluor White para paredes vegetales), los batidos resultaron sistemas materiales complejos, en donde coexisten una dispersión de los gránulos de almidón, cuerpos proteicos y fibra, una solución de glúcidos y proteínas solubles, una emulsión y una espuma. El aire incorporado durante el batido forma una espuma estabilizada por parte de los componentes mencionados que dará lugar a la miga después del horneado. Se utilizó la metodología de superficie de respuesta (MSR) para evaluar el efecto de las proporciones de BM y agua sobre las características de los batidos y la calidad final de los productos obtenidos. Los módulos dinámicos elástico (G’), viscoso (G’’) y complejo (G*) del batido, así como el volumen especifico (Ve) del pan y el color y los atributos texturales de la miga fueron altamente dependientes de las cantidades de BM y de agua adicionados. Las migas con los mayores niveles de BM presentaron menores valores de cohesividad y resiliencia así como menores Ve. Hasta 12,5 g de BM por cada 100 g de la mezcla HA+FM+CH permitieron obtener Ve superiores a 2,0 cm3/g, en un rango de cantidades de agua entre 115-150 g cada 100 g de mezcla HA+FM+CH. Sin embargo, cuando se incrementó el contenido de BM hasta 20 g cada 100 g de la mezcla HA+FM+CH, fue necesario aumentar el contenido de agua necesario hasta valores superiores a 140 g para obtener volúmenes específicos de al menos 2,0 cm3/g. Dentro de este rango, los valores de cohesividad y resiliencia fueron superiores a 0,5 y 0,3 respectivamente. La incorporación de BM condujo a un mayor número de alveolos / cm2 y de menor tamaño. Evaluando la microestructura de la miga con CLSM y microscopía electrónica de barrido (SEM) se observó que el BM produjo alveolos más irregulares, con paredes más rugosas. Las características del batido influyeron directamente en las características de la miga, como se comprobó en el análisis de correlación de Pearson. Un mayor nivel de BM y menor cantidad de agua generaron una miga más compacta, es decir con mayor densidad alveolar; para estas formulaciones el valor de los módulos dinámicos del batido resultaron elevados. Se evaluó el efecto de diferentes niveles de BM sobre las propiedades de formación de la pasta (pasting) en sistemas modelo almidón-BM, utilizando un RVA. Se realizaron tres series de ensayos: a) sistemas con contenido de sólidos constante (3 g / 25 mL de agua), en donde se mezclaron harina de arroz (HA) y fécula de mandioca (FM) en proporciones iguales, y se reemplazó esta mezcla con diferentes cantidades de BM (0% - 50%). Los valores de los parámetros viscosidad de pico (VP), inestabilidad (B), viscosidad final (VF) y asentamiento (S) en muestras con 2,5% hasta 25% de reemplazo con BM no presentaron diferencias significativas. Sin embargo niveles de reemplazo mayores a 25% dieron lugar a una reducción marcada de VP y VF; b) sistemas con la misma cantidad de HA+FM que las muestras de la serie a) pero sin BM (HA+FM entre 1,5 y 2,7). Los resultados indicaron que la contribución más importante a la viscosidad del sistema fue la del almidón hasta niveles de reemplazo de 10%. A niveles mayores la viscosidad fue influida principalmente por el BM; c) sistemas con adición de dos niveles de BM (5 y 20 %) a cantidades constantes de HA+FM (3 g); la mayor adición de BM condujo a un incremento significativo de la VP con respecto al control sin BM, sugiriendo un efecto sinérgico. Los estudios microestructurales (microscopía de campo claro, SEM) sobre los geles obtenidos al final del ensayo de RVA revelaron que los sistemas HA+FM+BM estuvieron formados por una matriz predominante de FM (que tiene una temperatura de formación de pasta inferior a HA) donde están inmersos y agregados los gránulos de almidón de arroz y las partículas de BM. Las mediciones de la capacidad de imbibición de agua (WIC) indicaron que las partículas de BM son capaces de absorber agua en un grado mayor que los almidones. Las transiciones térmicas se analizaron en sistemas modelo de HA, FM y BM con una relación sólidos: agua de 1:1, similar a la que se tiene en las formulaciones de los batidos. Con la adición de CH al sistema, se observó un aumento de las temperaturas inicial y de pico (59,43 y 69,91ºC) respecto al sistema sin CH (56,83 y 66,23ºC). Sin embargo, el BM no alteró significativamente las temperaturas encontradas. Paralelamente, la temperatura final de las endotermas de gelatinización aumentó con el incremento del contenido de sólidos de las mezclas Los resultados obtenidos permiten concluir que el BM con mínimo procesamiento es un ingrediente de potencial aplicación en productos alimentarios. Su incorporación a matrices complejas como las formulaciones de panificados sin gluten, permitió obtener productos sensorialmente aceptables, con niveles de fibra dietaria total mayores a 3 g cada 100 g de producto final.

Tradicionalmente, el objetivo principal al envasar un alimento era proteger al producto del medio externo y así prolongar su período de vida útil. Los cambios en el modo en que los alimentos son producidos, distribuidos, almacenados y comercializados, así como las crecientes demandas de los consumidores imponen nuevas exigencias al comportamiento de los envases alimentarios. También la tendencia de asegurar la calidad y seguridad de los alimentos, sin el agregado de aditivos y conservantes (o con la menor cantidad posible de los mismos), contribuyen a que el envase cumpla un papel más significativo. En este sentido, se ha incrementado el interés en el desarrollo de sistemas de envasado activos y/o inteligentes usando polímeros biodegradables para su formación. Estas nuevas tecnologías podrían tener gran potencial para contribuir a mantener la calidad de los productos y a asegurarla a lo largo de la cadena de distribución, así como para reemplazar a los polímeros sintéticos derivados del petróleo en algunas aplicaciones. En este marco el objetivo de este trabajo de Tesis fue desarrollar películas activas e inteligentes de matriz proteica para su uso en envases de alimentos. Se estudió: la formación de películas proteicas con capacidad de respuesta a cambios de pH del medio y temperatura, evaluando el efecto que los compuestos adicionados ejercían sobre las propiedades fisicoquímicas, antioxidantes y antimicrobianas de las películas. Inicialmente se evaluó el agregado de los indicadores de pH sintéticos: naranja de metilo, rojo neutro y verde de bromocresol a películas de gelatina.Se evaluó la aplicación de estos materiales desarrollados como envases de productos cárnicos. Se analizó la correlación entre el pH de carnes de distintos tipos y su crecimiento microbiano durante el almacenamiento refrigerado. La evidencia de que la matriz de proteína no interfería con la decoloración de los indicadores ácido-base, condujo a la búsqueda de colorantes de grado alimentario para el desarrollo de materiales aptos para envasar alimentos. Con este fin se evaluó la utilización de curcumina y antocianinas extraídas de repollo colorado. Dada la baja solubilidad en agua de ambos componentes se analizó el efecto de reeemplazar agua por mezclas hidroalcóholicas como solventes en las dispersiones filmogénicas. Para obtener materiales que respondan a cambios de temperatura se estudió el agregado de tintas termocrómicas a películas proteicas. La impresión de las tintas sobre las películas se realizó en el establecimiento Megacolor S.R.L., con un tratamiento industrial que también implicaba radiación UV. Las películas de soja soportaron la impresión y lograron indicar de manera reversible cambios de temperatura, por lo que estos materiales podrían ser asociados a aplicaciones de confort. Por último, se estudió la obtención de nanopartículas de plata y su agregado a matrices proteicas de gelatina con el fin de obtener materiales antimicrobianos. Estas nanopartículas se obtuvieron siguiendo dos estrategias: sintetizándolas en la misma solución filmogénica, o previo a su agregado a la formulación usando citrato de sodio como reductor. El tamaño nanoscópico de las partículas fue confirmado por espectroscopía UV, por dispersión de luz dinámica y por microscopía electrónica de transferencia. La presencia de estas nanopartículas en la formulación le otorgó a las películas de gelatina una actividad antimicrobiana muy importante frente a Escherichia coli (microorganismos común en el deterioro de alimentos, utilizada como sistema modelo) y logró ejercer un efecto refuerzo sobre la matriz proteica.

La función de la glándula tiroides está regulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH), una hormona glicoproteica secretada por la hipófisis anterior. En respuesta principalmente a TRH, la TSH madura se libera a la circulación e induce la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas: triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), que son las hormonas metabólicamente activas. La secreción de TSH está regulada por TRH y por un ciclo de retroalimentación negativa en el que las hormonas T3 y T4 actúan a nivel pituitario e hipotalámico. Dado que el control por retroalimentación de la secreción de TSH es exquisitamente sensible a las hormonas tiroideas periféricas, la mayoría de los trastornos tiroideos pueden diagnosticarse midiendo los niveles de TSH y de las hormonas tiroideas. Por esta razón, para la toma de decisiones clínicas, la medición de TSH en suero humano ha sido establecida como la "primera línea" para el diagnóstico de la función tiroidea. La mayoría de los métodos actuales para la determinación de TSH utilizados en los laboratorios clínicos son inmunoensayos heterogéneos "sandwich" que implican (1) enzimas, (2) sustratos fluorométricos o (3) marcadores quimioluminiscentes. En comparación con los inmunoensayos competitivos tradicionales, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos heterogéneos para cuantificar TSH ofrecen (1) límites de detección más bajos, (2) tiempo de respuesta rápido y (3) un rango de medición lineal más amplio. En virtud de su obvia importancia para el diagnóstico clínico, se ha realizado un esfuerzo constante para desarrollar métodos analíticos con alta sensibilidad para TSH en fluidos corporales humanos. Aunque la sensibilidad y la reproducibilidad de los inmunoensayos de TSH han ido mejorando progresivamente en los últimos 30 años, existen discrepancias analíticas en las determinaciones cuantitativas de TSH entre los sistemas disponibles comercialmente. La mayor variabilidad entre métodos se encuentra a bajas concentraciones de la hormona (por debajo de 0,4 μUI/ml), debido a la menor capacidad de detección y a la sensibilidad analítica de los inmunoensayos en este rango de concentraciones. En 1992, Sano y col. crearon una técnica llamada inmuno-PCR (IPCR), en la que reemplazaron la enzima de detección del ELISA por una sonda de ADN conjugada a biotina. Esta sonda de ADN luego es amplificada mediante PCR para la generación de señal, siendo el número de amplicones producidos proporcionales a la cantidad antígeno detectado. Desde la aparición de esta técnica, diversas aplicaciones y estrategias de IPCR se han desarrollado para la detección de innumerables antígenos. A lo largo de los años, estos estudios han demostrado que un ensayo de IPCR puede mejorar el límite de detección de 10 a 10.000 veces más que el de un ensayo de ELISA homólogo.En este trabajo de tesis desarrollamos un ensayo de ELISA sandwich y uno de IPCR altamente sensible, específicos para la detección de la hormona estimulante de la tiroides humana (hTSH). Se generó un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra hTSH por tecnología de hibridomas y se seleccionaron racionalmente combinaciones de anticuerpos. Se establecieron las condiciones de ensayo óptimas para la determinación de la hormona por ELISA sandwich y se seleccionaron dos pares de MAbs (B-4 y B-9). Estos prototipos de ELISA se evaluaron frente a patrones calibrados con la 2ª preparación internacional de referencia de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y en comparación con un kit ELISA comercial. Aunque el límite de detección (LD) fue de 0,1 μUI/ml en todos los casos, el prototipo de ELISA B-9 mostró un rendimiento analítico similar al kit de ELISA comercial. Por lo tanto, seleccionamos B-9 para desarrollar el ensayo de IPCR sandwich específico, utilizando el formato "Universal", en tubos de PCR estándar sin pretratamiento. La amplificación de la señal se logró a través de la interacción entre el MAb de detección biotinilado y la sonda de ADN mono-biotinilada, previamente autoensamblada con neutravidina. En comparación con los ELISAs evaluados, el ensayo de IPCR mostró un menor LD y un considerable aumento de la sensibilidad (pendiente), proporcionando una mejor resolución cuantitativa en el rango de bajas concentraciones de la hormona. La sensibilidad, facilidad de uso y el bajo costo de la técnica IPCR desarrollada ubican a esta metodología como una plataforma potencial para la detección cuantitativa de hTSH en muestras de suero humano. Además, el método de IPCR descripto (universal) demostró ser un formato práctico y versátil, realizado en tubos de PCR estándar. Nuestros resultados respaldan el potencial de la técnica para su aplicación en el diagnóstico de los estados tiroideos y para la medición confiable de niveles bajos clínicamente relevantes. Consideramos que el método propuesto puede posicionarse como alternativa metodológica para el análisis de hormonas.

A pesar de los numerosos estudios sobre probióticos que encontramos en la actualidad, poco se conoce respecto a complejos multicepas. En este trabajo de tesis se propuso: 1- Desarrollar una mezcla microbiana constituida por microorganismos aislados de kefir. 2- Estudiar sus características tecnológicas y potencialmente probióticas. 3- Determinar la capacidad inhibitoria frente a Shigella y Clostridium difficile. 4- Estudiar la capacidad de la mezcla microbiana de proteger contra la infección por Clostridium difficile en un modelo in vivo. 5- Determinar el método de conservación más adecuado para la mezcla microbiana.

Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) constituyen un importante problema de salud a nivel mundial. Las mismas son provocadas por el consumo de agua o alimentos contaminados con microorganismos o parásitos, o bien por las sustancias tóxicas que éstos producen. Durante la última década se realizó un notorio esfuerzo a nivel mundial para el desarrollo de biopreservadores alimentarios, aun así, la emergencia de bacterias patógenas causantes de ETAs evidencia la necesidad urgente de investigar nuevas fuentes de agentes bioactivos para enfrentar y controlar este problema. Numerosos estudios involucran a cepas de Escherichia coli patógenas como responsables de ETAs. Específicamente, en nuestra región resulta especialmente importante controlar la diseminación de cepas de Escherichia coli shigatoxigénicas (STEC), ya que Argentina tiene la mayor tasa mundial de Síndrome Urémico Hemolítico debido a la diseminación de cepas STEC O157:H7 y no-O157, un patógeno emergente que infecta a los humanos a través de la ingestión de carne u otros alimentos contaminados. Varios factores de patogenicidad, además de las toxinas, como la intimina presente en STEC y cepas enteropatógenas (EPEC), son considerados necesarios en el proceso de infección, convirtiendo a estos patógenos en peligrosos con respecto a la inocuidad alimentaria. Por otro lado, los conservantes alimentarios, en las concentraciones autorizadas, en general no matan a los microorganismos, sino que solamente evitan su proliferación, limitando su utilidad a materias primas de muy buena calidad. Lo antes mencionado, sumado al incremento en el número de antibióticos a los cuales son resistentes las bacterias, generan la necesidad de nuevos enfoques tanto para garantizar la calidad como para extender la vida útil de los alimentos. Los bacteriofagos son los enemigos naturales de las bacterias y presentan una alta especificidad para sus células hospedadoras. La naturaleza es una fuente inagotable de fagos que evolucionan constantemente por lo que pueden adaptarse in situ para reinfectar bacterias resistentes. Además, son fáciles de aislar y son consumidos cotidianamente ya que están presentes en los alimentos y el agua por lo que representan una alternativa ecológica. Otra de las características que presentan los bacteriofagos es que se auto-amplifican así como se auto-limitan puesto que en presencia de su bacteria hospedadora se replicarán y posteriormente infectarán otras cepas en crecimiento mostrando un comportamiento de auto-amplificación, por otro lado, en ausencia de células hospedadoras los fagos no se replicarán mostrando una auto-limitación. A pesar de lo antes mencionado, solo recientemente se están realizando un mayor número de investigaciones respecto de su utilidad como agentes de biocontrol para ser empleados en inocuidad alimentaria. En función de lo anteriormente descripto, este trabajo tuvo como objetivo principal desarrollar una metodología novedosa y económica para el biocontrol de cepas patógenas de Escherichia coli mediante bacteriofagos para ser utilizados como aditivos en lácteos y cárnicos o en su proceso de producción. En primera instancia se realizó el aislamiento de bacteriofagos de E. coli desde materia fecal humana, posteriormente se analizó la morfología mediante microscopía electrónica, se evaluó tanto la ausencia de genes de patogenicidad utilizando la técnica de PCR como su estabilidad durante el almacenamiento. En el presente trabajo se aislaron seis bacteriofagos que presentaron un carácter lítico solo frente a cepas patógenas de E. coli. Entre ellos, se seleccionaron 3 fagos, a saber DT1, DT5 (para STEC no-O157 ARG4827, no hospedadora de DT1) y DT6, para evaluar la actividad lítica en cepas patógenas de E. coli frente a distintas condiciones de temperatura, pH y concentración de cloruro de sodio. Respecto de las microscopías electrónicas, los fagos forman parte de la familia Myoviridae, presentando tamaños de cabeza y cola similares. Este dato fue corroborado en un trabajo de tesina, mediante estudios de secuenciación (Migliore, 2011). Los ensayos moleculares de PCR permitieron descartar la presencia de los genes de patogenicidad frecuentemente asociados a cepas de E. coli diarreogénicas como stx1, stx2, eaeA, LT1 y ST1 en los seis bacteriofagos evaluados. En cuanto a la estabilidad durante el almacenamiento a 4°C, los seis fagos presentaron una leve disminución en el título fágico durante el primer mes así como durante el segundo mes, obteniéndose la menor viabilidad para el fago DT1 y siendo ésta del 55% respecto de la inicial, es decir, una reducción en la viabilidad a lo sumo de 0,26 log UFP al segundo mes de almacenamiento. Al evaluar la actividad lítica en distintas condiciones fisicoquímicas se determinó que, tanto frente a concentraciones crecientes de cloruro de sodio como valores bajos de pH y de temperatura, la actividad lítica fue menor para todos los sistemas evaluados, siendo éstos más afectados por el pH bajo, luego por las bajas temperaturas y en menor medida por la mayor concentración de cloruro de sodio ensayada. Con respecto a la interacción de los fagos con sus cepas sensibles, se investigó el rango de hospedador para cada fago así como el tiempo y número de eclosión para los fagos DT1 y DT6. También se determinó la eficiencia de plaqueo (EOP) para los fagos DT1, DT5 y DT6 y, adicionalmente, se estudió la naturaleza de los receptores fágicos presentes en cepas patógenas de E. coli. Los rangos de hospedador más amplios se obtuvieron para los fagos DT3, DT4 y DT6. Estos fueron capaces de lisar 16, 15 y 16 cepas del cepario evaluado, eespectivamente. Por otro lado, los fagos DT1, DT2 y DT5lisaron solo 6, 7 y 7 de las 104 cepas evaluadas, respectivamente, mostrando un rango estrecho de hospedador. Cabe destacar que las cepas no patógenas de E. coli así como las cepas no-E. coli no se vieron afectadas por los fagos evaluados. Los bacteriofagos DT1 y DT6 presentaron el mismo tiempo de eclosión, siendo éste de 33 minutos, por otro lado, los números de eclosión fueron de 76 para DT1 y 59 para DT6. Cuando se determinó la EOP, el fago DT1 mostró valores cercanos y superiores al 20%, mientras que el DT5 presentó los menores valores. Contrariamente, el fago DT6 mostró los mayores valores de EOP, obteniéndose valores de hasta 97,6%, sin embargo, para este fago también se obtuvo uno de los menores valores observados, siendo del 10,7% en el sistema con la cepa enteropatógena. Los estudios realizados para identificar los receptores fágicos para DT1, DT5 y DT6 evidenciaron la naturaleza hidrocarbonada de éstos en todas las cepas patógenas de E. coli evaluadas puesto que solo se observó una disminución significativa en la adsorción luego del tratamiento con peryodato. Posteriormente se realizaron ensayos de challenge in vitro a distintas temperaturas frente a la cepa DH5α y a las cepas patógenas PEC920, STEC no-O157 ARG4827 y STEC464 O157:H7. Se evaluaron fagos individuales así como formando parte de un cóctel, además se comparó la eficacia de los tratamientos y se determinó la evolución del recuento fágico a través de los ensayos. Respecto del biocontrol ejercido por los fagos, éstos fueron más eficaces a la mayor temperatura evaluada (37°C), obteniéndose valores de biocontrol de hasta 6,38 log UFC, sin embargo, a la menor temperatura (4°C) en la mayoría de los casos se obtuvieron valores de reducción significativos de hasta 3,79 log UFC. La acción lítica de los fagos frente a la cepa DH5α fue similar respecto de las patógenas, presentando reducciones logarítmicas del mismo orden de magnitud con la excepción del mayor tiempo de muestreo (24 h) donde DH5α fue más afectada. Al comparar los tratamientos a 37°C, el cóctel de fagos resultó ser el más efectivo para reducir el número de células viables, solo en dos casos un fago individual fue significativamente más efectivo que el cóctel, además nunca se obtuvo la menor reducción de células viables en un sistema tratado con la mezcla fágica. Por otro lado, los tratamientos con los fagos individuales presentaron una eficacia variable independientemente del sistema evaluado. La evolución de los títulos fágicos varió a lo sumo en 1 log UFP/ml, en la mayoría de los casos aumentando levemente y permaneciendo siempre en un número elevado. Luego se realizaron ensayos de biocontrol con fagos sobre la matriz alimenticia.Se evaluaron tanto fagos individuales como cócteles sobre productos cárnicos contaminados artificialmente con DH5α y cepas patógenas, a saber EPEC920, STEC no-O157 ARG4827 y STEC464 O157:H7. Además, se evaluó el porcentaje de recuperación bacteriana desde la matriz alimentaria. En general se observaron reducciones, si bien significativas, relativamente bajas cuando se utilizaron fagos individuales en los ensayos de biocontrol a ambas temperaturas evaluadas (5 y 24°C). Por otro lado, cuando se emplearon cócteles en los ensayos las reducciones significativas observadas fueron mayores. A modo de ejemplo, empleando una MOI del mismo orden de magnitud, la cepa STEC464 O157:H7 sufrió una reducción similar a las 3 h de incubación utilizando un fago individual o el cóctel, mientras que a las 6 h el cóctel produjo una reducción 1,6 log UFC mayor que el fago individual a 24°C evidenciando la utilidad del cóctel para prevenir un posterior recrecimiento bacteriano. Además, durante los experimentos la recuperación bacteriana desde la matriz alimentaria osciló entre el 61,4% y el 85,4%. Durante los ensayos en cárnicos, en algunos casos se observó un recrecimiento bacteriano al mayor tiempo de muestreo (24 h), por lo que se planteó el aislamiento de mutantes insensibles a bacteriofagos (BIMs) desde los experimentos en carnes así como por la metodología de cultivo secundario. Una vez aislados, los BIMs fueron confirmados por el test de sensibilidad en medio líquido y se determinó la frecuencia de aislamiento para cada BIM confirmado. Además, se seleccionaron 9 BIMs confirmados, 5 obtenidos a partir del cultivo secundario y 4 a partir de los ensayos en carnes, y se evaluó la estabilidad y reversión. De los 16 BIMs aislados por la metodología de cultivo secundario se confirmaron como BIMs verdaderos el 75,0%, mientras que de los 30 BIMs aislados desde carnes se evaluaron 14 y solo se confirmaron como verdaderos el 28,5%. Además de presentar frecuencias de aislamiento bajas, oscilando entre 3,7x10-7 y 1,8x10-6, los BIMs presentaron una estabilidad variable y solo uno fue capaz de revertir el fenotipo de resistencia. Otra matriz alimentaria utilizada para los ensayos de biocontrol fueron los lácteos. En los ensayos realizados durante un proceso de fermentación láctica, en el 67% de los casos el tratamiento fágico eliminó completamente la cepa bacteriana inoculada, además, cuando se utilizó el cóctel, este eliminó el patógeno en un menor tiempo respecto de los fagos individuales. Por otro lado, en ensayos realizados durante un proceso de cuajado, si bien se inactivó rápida y completamente el 50% de las cepas evaluadas, no se observó la eficacia obtenida durante la fermentación para la cepa patógena STEC O157:H7 usando el cóctel a una MOI similar, sin embargo, éste pudo eliminar la cepa DH5α. Respecto de la estabilidad fágica, éstos presentaron un alto nivel de estabilidad en este tipo de matrices considerando los bajos valores de pH alcanzados. Por otro lado, tanto los cultivos iniciadores, a saber Streptococcus thermophilus, como la evolución general de los parámetros del proceso de fermentación láctica como del proceso de cuajado, no se vieron afectados por la adición exógena de bacteriofagos. Finalmente, se evaluó la eficacia del tratamiento con cócteles fágicos sobre superficies sólidas, específicamente sobre cubreobjetos de vidrio (CV) y acero inoxidable (AI), emulando superficies inanimadas potencialmente contaminadas que se pueden encontrar tanto en un ambiente industrial como en el hogar. En los ensayos realizados en CV se obtuvo una eliminación completa de los patógenos EPEC920 y STEC464 O157:H7 tanto a 5 como a 37°C, observándose un recrecimiento de ~1,5 log UFC para esta última cepa a alto inóculo bacteriano. Contrariamente, la cepa STEC no-O157 ARG4827, si bien se vio reducida en su número inicialmente, no se logró eliminar a 5°C y presentó un recrecimiento posterior a 37°C. Cuando se evaluaron los resultados obtenidos en la matriz AI, se determinó que el cóctel fue capaz de eliminar completamente todas las cepas evaluadas a 5°C y a STEC no-O157 ARG4827 a 37°C, mientras que STEC464 O157:H7 y EPEC920 presentaron un recrecimiento posterior a alto, y a bajo y alto inóculo bacteriano, respectivamente. Cabe destacar que se ha logrado una gran especificidad de acción sobre cepas patógenas de E. coli y que estudios posteriores permitirán desarrollar cocteles fágicos con mayores eficiencias de reducción bacteriana. Los mejores resultados se obtuvieron en los ensayos de biocontrol sobre superficies sólidas, a saber cubreobjetos de vidrio y acero inoxidable, y durante los procesos de fermentación láctica y cuajado. También se observaron reducciones bacterianas significativas en la matriz cárnica. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis sugieren, en primera instancia, que los bacteriofagos aislados en nuestro laboratorio son útiles para el biocontrol de cepas patógenas de E. coli en alimentos.