Catálogo de publicaciones

La formación de partículas lentivirales resulta de la multimerización de la poliproteína Gag, la cual contiene toda la información necesaria para autoensamblarse y brotar al medio extracelular a través de la membrana plasmática. Durante la maduración de los viriones, la proteína cápside (CA), que corresponde al dominio central de Gag, se condensa generando el core viral que preserva la integridad del complejo ribonucleoproteico requerido para iniciar un nuevo ciclo de replicación viral. Los virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) y de felinos (FIV) son dos lentivirus evolutivamente distantes cuyas proteínas CA no han sido aún estudiadas. Con el objeto de establecer la relación funcional entre los dominios CA de SIV y de FIV, construimos SIV quiméricos en los cuales la región codificante para la CA fue parcial o totalmente reemplazada por su equivalente de la CA de FIV. La caracterización fenotípica de las quimeras nos permitió agruparlas en tres categorías: un grupo formado por virus quiméricos capaces de ensamblarse en viriones, pero cuya maduración causa la inestabilidad de la CA de FIV; un segundo grupo representado únicamente por el SIV quimérico llevando el dominio N-terminal (NTD) de la CA de FIV y que exhibe un fenotipo de ensamblado defectivo; y un tercer grupo formado por los virus quiméricos que se ensamblan en viriones exhibiendo una CA de FIV madura estable, que incorporan la glicoproteína de envoltura, y que contienen niveles salvajes del ARN genómico viral y de la transcriptasa reversa. Sin embargo, este último grupo de SIV quiméricos resultó ser no infeccioso debido a defectos en alguna etapa posterior a la entrada viral. Por otra parte, demostramos que el dominio C-terminal (CTD) de la CA de FIV presenta la capacidad intrínseca de dimerizar in vitro y de formar oligómeros de alto peso molecular. Esto, junto con nuestros resultados que muestran que el CTD de la CA de FIV es suficiente para el ensamblado de la poliproteína quimérica Gag de SIV, provee evidencia de que el CTD de la CA exhibe mayor plasticidad funcional que el NTD. En su conjunto, nuestros resultados aportan información relevante sobre la homología funcional entre los dominios CA de las poliproteínas Gag de los lentivirus de primates y de no primates y contribuyen a nuestro conocimiento sobre cómo han evolucionado los requerimientos para el ensamblado de viriones infecciosos en los retrovirus.

En Argentina, el tomate (Solanum lycopersicum) es la quinta hortaliza a nivel de producción, siendo el cinturón hortícola de la ciudad de La Plata uno de los principales productores de tomate fresco para consumo de la Provincia de Buenos Aires. Un aspecto clave para optimizar el aprovechamiento de la producción es mejorar los aspectos ligados a la conservación poscosecha (periodo de almacenamiento del producto previo al consumo en fresco), lo cual requiere de un conocimiento detallado de los procesos metabólicos que ocurren durante la maduración y senescencia. La firmeza, uno de los principales determinantes de la calidad poscosecha y la vida útil de los frutos, está determinada por la resistencia mecánica impuesta por la pared celular. Las expansinas (proteínas sin actividad hidrolítica conocida) están implicadas en el desmantelamiento, no hidrolítico, de las paredes celulares vegetales, particularmente en procesos en los que es necesaria la relajación de la pared, como el desarrollo y la maduración de los frutos. Como muchas proteínas asociadas a carbohidratos, las expansinas tienen un dominio catalítico putativo y un módulo de unión a carbohidratos (CBM). Se cree que el CBM actuaría anclando a la expansina a la superficie de la celulosa, mientras que el dominio catalítico putativo interactuaría con las hemicelulosas en la superficie de las microfibrillas provocando la ruptura de los enlaces no covalentes, principalmente puentes de hidrógeno, existentes entre la celulosa y las hemicelulosas de la matriz. Tomate incluye 38 genes de expansinas pertenecientes a diferentes grupos filogenéticos. Estudios previos han demostrado que existe una expansina específica de fruto, la α-expansina 1 de tomate (SlEXPA1). La determinación de la actividad expansina depende de la medición de la capacidad de extensión de paredes celulares aisladas mediante el uso de extensómetros "ad hoc" poco convencionales, hecho que ha restringido fuertemente su estudio. Esto nos impulsó a adaptar una metodología para medir la extensión de la pared celular y la actividad expansina usando un medidor de textura comercial, equipo común encontrado en laboratorios de ciencia de los alimentos o tecnología poscosecha. Fue posible medir el crecimiento ácido de hipocótilos de pepino y de tomate, así como determinar la actividad expansina sobre extractos de proteínas de hipocótilos de pepino, de frutos frutilla y de frutos de tomate en diferentes estadios de madurez, de manera fiable y reproducible. Por otro lado, haciendo uso de un sistema de expresión heterólogo (Escherichia coli), se sobreexpresaron tanto la proteína completa (SlEXPA1) como sus dominios característicos (CBM-SlEXPA1 y EXP-SlEXPA1), con la finalidad de analizar de manera integral el mecanismo de unión sobre diversos sustratos sintéticos de la pared celular vegetal. Se demostró, a través de ensayos de unión “in vitro”, que tanto la proteína completa como ambos dominios se unen a celulosa microcristalina y xilano de avena. Para el caso de la celulosa la unión es mayor para la proteína completa y el dominio CBM, mientras que para el caso del xilano la unión es mayor para la proteína completa y el dominio catalítico putativo. Asimismo, se demostró que dichas proteínas no poseen afinidad por un sustrato no presente en la pared celular como lo es el almidón. Por último, se sobreexpresó de manera constitutiva el CBM de la expansina 1 de Solanum lycopersicum (CBM-SlEXPA1) en la pared celular de plantas de tomate, siendo ésta la primera vez que un CBM se sobreexpresa en un fruto destinado a controlar la degradación de la pared celular y el ablandamiento del fruto. La sobreexpresión de CBM-SlEXPA1 genera un aumento de la resistencia mecánica de las hojas, un retardo en el proceso de ablandamiento del fruto, una reducción en la susceptibilidad al ataque por Botrytis cinerea y un aumento en su contenido de pared celular; mientras que no modifica el crecimiento de las plantas y el fenotipo general, y no altera los parámetros de calidad característicos del fruto. La presente tesis aborda desde diferentes aproximaciones el estudio de una proteína en particular. Se concluye que, la fácil adaptación metodológica para la determinación de la actividad expansina podría contribuir a facilitar y aumentar el análisis de las propiedades de las expansinas en diferentes sistemas; las α-expansinas, apoyando resultados previos, se unirían a través del dominio CBM a celulosa mientras que el dominio catalítico putativo intervendría en la relajación de la matriz de hemicelulosa con la consecuente relajación de la pared vegetal; la sobreexpresión de un CBM en la pared celular sería una estrategia factible de utilizar para lograr aumentar la vida poscosecha de frutos carnosos, como lo es el tomate, sin alterar el crecimiento de la planta.

: Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Patología Vegetal-IPAVE- Centro de Investigaciones Agropecuarias-CIAP–Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria-INTA-CONICET- Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 122 h. con Anexos + CD. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica. Abstract en español e inglés.

Tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Agrarias, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en 2009

Esta tesis se ha focalizado en resolver el problema taxonómico referido al llamado “complejo fraterculus” del género Anastrepha. Anastrepha fraterculus es la mosca sudamericana de la fruta, principal plaga después de la invasora C. capitata, mosca del Mediterráneo. Previo a esta tesis, cerca de 38 especies han sido adscriptas o son sinonimías de A. fraterculus. Nuestros estudios se han realizado tanto con moscas salvajes como con stocks de laboratorio, aislados por primera vez. El énfasis de la tesis se ha centrado en el estudio detallado dc las características cromosómicas por ser este el carácter que más confusión ha creado entre distintos autores. A tal fin se analizaron citológicamente más de 2500 individuos procedentes dc 24 hábitats (frutos/localidad) utilizando un conjunto de técnicas citológicas específicas. Los diferentes estudios convergentes (citológicos, bioquímicos y moleculares) sobre el mismo material genético y las técnicas de hibridización in situ con fluorescencia posibilitaron el riguroso análisis cariotípico molecular de los stocks y poblaciones. Los principales resultados son los siguientes: - se demostró que —contrariamente a lo que propusieron varios investigadores del área- los polimorfismos cromosómicos en Anastrepha fraterculus descriptos y analizados en ésta tesis no son un impedimento para el intercruzamiento (en la naturaleza y en laboratorio) y representan una sóla especie. - se amplió el conocimiento básico de la variabilidad cromosómica en la especie en distintas poblaciones del Cono Sur: Argentina, Brasil y Uruguay. - por primera vez sc localizó el cluster de ADN ribosomal y se describieron e identificaron los autosomas de la especie. - Se describieron por primera vez en poblaciones naturales dc Anastrepha mosaicos citológicos con diferentes niveles de ploidía, atribuyéndoles un rol en la regulación de la expresión génica diferencial durante el desarrollo del insecto. - Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se describieron cromosomas doble diminutos en poblaciones naturales de un invertebrado, atribuyéndoles un rol fisiológico adaptativo. - se determinó que las diferentes variantes cromosómicas no están asociadas a frutos hospederos particulares o a localidades geográficas. - se comprobó que la heterogeneidad de hábitats mantiene la coexistencia de diferentes cariotipos y reordenamientos como polimorfismos que se presentan con diferentes frecuencias en cada población. - se determinó que no existe concordancia entre los datos obtenidos a partir de trampeos y los obtenidos a través de muestreos de frutos parasitados, corroborándose que el sistema de apareamiento de Anastrepha fraterculus no está basado en los recursos larvales. Esto es de enorme relevancia para que la determinación de hospederos se realice inevitablemente sobre la base de muestreos de frutos infestados. El estatus de plaga debe depender del registro de hospederos.

El maíz, Zea mays ssp. mays, se cultiva en todo el mundo y ocupa el tercer lugar entre los destinados al consumo alimentario. La Argentina es el segundo exportador mundial, precedida por los Estados Unidos. Esto coloca a la producción de maíz como una de las actividades económicas más rentables para nuestro país. En el norte de la Argentina habitan comunidades aborígenes que cultivan razas nativas de maíz. La caracterización genética del germoplasma autóctono de las razas de la región noreste de la Argentina (NEA) ha sido prácticamente nula hasta la concreción de esta Tesis. Con el fin de aportar al conocimiento de la diversidad genética y la estructura poblacional de las razas nativas del NEA, contribuir a su conservación y evaluar su potencial como reservorio de nuevos alelos, se evaluaron 15 loci microsatélites nucleares en 572 individuos. Los resultados del presente estudio permiten concluir que: 1) las razas de Misiones se encuentran constituidas por acervos génicos diferentes, que concuerdan con el tipo de grano que poseen (harinosos y córneo-harinosos vs. reventadores), éstos deberían ser considerados como unidades de conservación diferentes; 2) las razas nativas del NEA constituyen una reserva de diversidad significativa, con potencial para ampliar la base genética de los programas de fitomejoramiento; 3) las razas de Misiones no parecen haber sufrido un proceso de erosión genética severo en tiempos recientes, ya que los ejemplares actuales conservan gran parte de la diversidad detectada en las colecciones del NEA de los años 1977 y 1978; 4) la comparación entre las razas del NEA y del NOA apoyan la existencia de dos centros de diversidad diferentes en Sudamérica; la comparación con otras razas del Continente Americano avala la hipótesis de ocurrencia de una via de introducción del germoplasma nativo del NEA a través del este de Sudamérica; 5) la ausencia de cromosomas B en las razas del NEA coincide con la constitución cromosómica esperada para el grupo de las razas de regiones bajas.

La obtención de litio ha tomado gran importancia en los últimos años debido a la gran demanda para la producción principalmente de baterías. Este elemento tiene además otras utilidades, como en la industria cerámica y médica. Se conoce que la forma más económica y eficiente de obtener litio es a partir de salmueras naturales con altas concentraciones del metal, distribuidas principalmente en la zona de la puna sudamericana, al oeste de los Estados Unidos y en lagos salinos de China. El Salar del Hombre Muerto, ubicado en el noroeste argentino, es uno de los vértices del ?Triángulo del litio? que incluye toda el área comprendida entre este Salar, el de Uyuni en Bolivia y el de Atacama en Chile. En esta zona se concentra alrededor del 85% del litio soluble a nivel mundial.En la presente tesis doctoral se planteó como objetivo general determinar la influencia del litio sobre diferentes géneros microbianos aislados de muestras ambientales con elevada concentración de mineral y caracterizar la composición de las comunidades microbianas que se encuentran en estos ambientes. A partir de este conocimiento, intentar discernir los mecanismos que les permiten a los organismos tolerar dichas condiciones adversas y sus potenciales capacidades y/o aplicaciones biotecnológicas. Se inició este trabajo determinando la importancia del litio, resaltando sus aplicaciones y demanda a nivel mundial. Posteriormente se describió la distribución del metal alrededor del mundo, teniendo en cuenta las reservas actualmente en explotación como las que aún permanecen sin explotar. Se seleccionó el Salar del Hombre Muerto como sitio de estudio de donde se tomaron muestras de suelo de dos puntos diferentes, de agua dulce y de salmuera. Estas se caracterizaron de acuerdo con su composición química y sus propiedades físicas. También se estudió la composición de la comunidad microbiana en muestras de suelo utilizando técnicas de metagenómica. El análisis de los datos obtenidos permitió establecer una relación entre las propiedades de los suelos con las comunidades microbianas que lo habitan. Por otra parte, se evaluó la presencia de microorganismos mediante microscopía óptica y electrónica en las muestras de agua dulce y salmuera y se aislaron bacterias y hongos mediante técnicas microbiológicas a partir de las muestras disponibles. Del total de 238 cepas bacterianas obtenidas, se continuó el trabajo con aquellas capaces de crecer en altas concentraciones salinas (186), de las que se evaluó su tolerancia al cloruro de litio mediante el crecimiento en medios de cultivo sólido (ensayo del canal) y líquido. Las 36 cepas bacterianas clasificadas como tolerantes en medio líquido (de un total de 56 clasificadas como tal en medio sólido) se caracterizaron en cuanto a su morfología microscópica y la de sus colonias y a su capacidad de formar biofilms y de producir carotenoides. De ellas, 26 cepas se secuenciaron e identificaron empleando técnicas de biología molecular y bioinformática. Se depositaron las secuencias obtenidas en el GeneBank.A partir de los aislamientos bacterianos tolerantes a litio, se seleccionó un grupo de 8 cepas de las que se evaluó la capacidad de crecer en presencia de cloruro de litio y de recuperar el litio soluble. Se verificó que las células poseen la capacidad de remover una fracción del litio soluble y que en algunas de las cepas el litio, en elevadas concentraciones, afectó a la morfología celular.Asimismo, se evaluó la tolerancia al cloruro de litio de 19 cepas de arqueas halófilas, de diferente origen, en medio sólido mediante el ensayo del canal y el crecimiento en medio líquido con diferentes concentraciones de sales de sodio y litio. Se identificaron tres cepas halófilas extremas y dos con capacidad para crecer en altas concentraciones de litio, siendo estas últimas comparables a los aislamientos bacterianos obtenidos.Finalmente, se seleccionó una de las cepas aisladas del Salar del Hombre Muerto, Micrococcus luteus SA211, para profundizar su estudio. Se secuenció y analizó su genoma y metiloma completo, lo que permitió analizar la potencialidad de la cepa y predecir que la mayoría de las proteínas que la cepa podría sintetizar serían ácidas. Se estudió la síntesis diferencial de proteínas de esta (y de otras tres cepas) en ausencia y presencia de sales de litio para identificar las proteínas involucradas en la respuesta al litio, a la vez que se compararon con las sintetizadas en presencia de sodio. Se identificaron 46 proteínas diferencialmente sintetizadas, involucradas en distintas funciones del metabolismo celular, relacionadas con la presencia de litio.En conclusión, se alcanzaron los objetivos propuestos en el tiempo previsto. Este trabajo, primero en su índole con muestras del Salar del Hombre Muerto, constituye una base sólida para profundizar los estudios de las capacidades de las cepas obtenidas y optimizar procesos de recuperación de litio soluble, entre otras potenciales aplicaciones biotecnológicas observadas en las cepas aisladas.

En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua está espacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido de agua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio temprano de la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, al igual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, se adapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación en el estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polen proporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, los nutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilas estigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no se conocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional de agua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas en el transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en los granos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. En este trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesos asociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad de secuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos en tándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten los mismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en la selectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones de expresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos de expresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante la elongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubos polínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2 podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentes y específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieron plantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN doble knockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidad afectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociada solamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducción de la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granos de polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen, reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente en condiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de sus respectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas de complementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal se observó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en la membrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una baja permeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa in vitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforilados específicamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresada en polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. En resumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaría involucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

Se caracterizó la musculatura natatoria de nototénidos subantárticos mediante técnicas histoquímicas, determinándose la presencia de cuatro tipos de fibras: SDF, rojas, intermedias y blancas. Se demostró la utilidad de la técnica de la mATPasa para diferenciar distintos tipos musculares. El proceso de hiperplasia muscular cesó al 40 - 70 % de la talla máxima de cada especie, encontrándose tres patrones distintos de incorporación de fibras directamente relacionados con las tallas finales de las mismas. Las fibras musculares de E. maclovinus y P. tessellata mostraron la misma tasa de crecimiento. Todos los nototénidos subantárticos estudiados presentan valores de flotabilidad propios de especies de hábitat bentónico. El rendimiento natatorio de E. maclovinus fue superior a 10°C que a 4°C. La velocidad, aceleración y potencia inercial de los arranques rápidos de E. maclovinus a 2 °C fueron superiores a los de una especie antártica (N. rosii), y el grado de curvatura del cuerpo y de estiramiento de las fibras blancas similares a los de especies de aguas templadas y tropicales. Los valores energéticos de distintos órganos y tejidos de las especies que se separaron antes del tronco ancestral de los nototénidos mostraron valores significativamente mayores que los del resto de las especies.