Catálogo de publicaciones

Esta tesis se ha focalizado en resolver el problema taxonómico referido al llamado “complejo fraterculus” del género Anastrepha. Anastrepha fraterculus es la mosca sudamericana de la fruta, principal plaga después de la invasora C. capitata, mosca del Mediterráneo. Previo a esta tesis, cerca de 38 especies han sido adscriptas o son sinonimías de A. fraterculus. Nuestros estudios se han realizado tanto con moscas salvajes como con stocks de laboratorio, aislados por primera vez. El énfasis de la tesis se ha centrado en el estudio detallado dc las características cromosómicas por ser este el carácter que más confusión ha creado entre distintos autores. A tal fin se analizaron citológicamente más de 2500 individuos procedentes dc 24 hábitats (frutos/localidad) utilizando un conjunto de técnicas citológicas específicas. Los diferentes estudios convergentes (citológicos, bioquímicos y moleculares) sobre el mismo material genético y las técnicas de hibridización in situ con fluorescencia posibilitaron el riguroso análisis cariotípico molecular de los stocks y poblaciones. Los principales resultados son los siguientes: - se demostró que —contrariamente a lo que propusieron varios investigadores del área- los polimorfismos cromosómicos en Anastrepha fraterculus descriptos y analizados en ésta tesis no son un impedimento para el intercruzamiento (en la naturaleza y en laboratorio) y representan una sóla especie. - se amplió el conocimiento básico de la variabilidad cromosómica en la especie en distintas poblaciones del Cono Sur: Argentina, Brasil y Uruguay. - por primera vez sc localizó el cluster de ADN ribosomal y se describieron e identificaron los autosomas de la especie. - Se describieron por primera vez en poblaciones naturales dc Anastrepha mosaicos citológicos con diferentes niveles de ploidía, atribuyéndoles un rol en la regulación de la expresión génica diferencial durante el desarrollo del insecto. - Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se describieron cromosomas doble diminutos en poblaciones naturales de un invertebrado, atribuyéndoles un rol fisiológico adaptativo. - se determinó que las diferentes variantes cromosómicas no están asociadas a frutos hospederos particulares o a localidades geográficas. - se comprobó que la heterogeneidad de hábitats mantiene la coexistencia de diferentes cariotipos y reordenamientos como polimorfismos que se presentan con diferentes frecuencias en cada población. - se determinó que no existe concordancia entre los datos obtenidos a partir de trampeos y los obtenidos a través de muestreos de frutos parasitados, corroborándose que el sistema de apareamiento de Anastrepha fraterculus no está basado en los recursos larvales. Esto es de enorme relevancia para que la determinación de hospederos se realice inevitablemente sobre la base de muestreos de frutos infestados. El estatus de plaga debe depender del registro de hospederos.

El maíz, Zea mays ssp. mays, se cultiva en todo el mundo y ocupa el tercer lugar entre los destinados al consumo alimentario. La Argentina es el segundo exportador mundial, precedida por los Estados Unidos. Esto coloca a la producción de maíz como una de las actividades económicas más rentables para nuestro país. En el norte de la Argentina habitan comunidades aborígenes que cultivan razas nativas de maíz. La caracterización genética del germoplasma autóctono de las razas de la región noreste de la Argentina (NEA) ha sido prácticamente nula hasta la concreción de esta Tesis. Con el fin de aportar al conocimiento de la diversidad genética y la estructura poblacional de las razas nativas del NEA, contribuir a su conservación y evaluar su potencial como reservorio de nuevos alelos, se evaluaron 15 loci microsatélites nucleares en 572 individuos. Los resultados del presente estudio permiten concluir que: 1) las razas de Misiones se encuentran constituidas por acervos génicos diferentes, que concuerdan con el tipo de grano que poseen (harinosos y córneo-harinosos vs. reventadores), éstos deberían ser considerados como unidades de conservación diferentes; 2) las razas nativas del NEA constituyen una reserva de diversidad significativa, con potencial para ampliar la base genética de los programas de fitomejoramiento; 3) las razas de Misiones no parecen haber sufrido un proceso de erosión genética severo en tiempos recientes, ya que los ejemplares actuales conservan gran parte de la diversidad detectada en las colecciones del NEA de los años 1977 y 1978; 4) la comparación entre las razas del NEA y del NOA apoyan la existencia de dos centros de diversidad diferentes en Sudamérica; la comparación con otras razas del Continente Americano avala la hipótesis de ocurrencia de una via de introducción del germoplasma nativo del NEA a través del este de Sudamérica; 5) la ausencia de cromosomas B en las razas del NEA coincide con la constitución cromosómica esperada para el grupo de las razas de regiones bajas.

La obtención de litio ha tomado gran importancia en los últimos años debido a la gran demanda para la producción principalmente de baterías. Este elemento tiene además otras utilidades, como en la industria cerámica y médica. Se conoce que la forma más económica y eficiente de obtener litio es a partir de salmueras naturales con altas concentraciones del metal, distribuidas principalmente en la zona de la puna sudamericana, al oeste de los Estados Unidos y en lagos salinos de China. El Salar del Hombre Muerto, ubicado en el noroeste argentino, es uno de los vértices del ?Triángulo del litio? que incluye toda el área comprendida entre este Salar, el de Uyuni en Bolivia y el de Atacama en Chile. En esta zona se concentra alrededor del 85% del litio soluble a nivel mundial.En la presente tesis doctoral se planteó como objetivo general determinar la influencia del litio sobre diferentes géneros microbianos aislados de muestras ambientales con elevada concentración de mineral y caracterizar la composición de las comunidades microbianas que se encuentran en estos ambientes. A partir de este conocimiento, intentar discernir los mecanismos que les permiten a los organismos tolerar dichas condiciones adversas y sus potenciales capacidades y/o aplicaciones biotecnológicas. Se inició este trabajo determinando la importancia del litio, resaltando sus aplicaciones y demanda a nivel mundial. Posteriormente se describió la distribución del metal alrededor del mundo, teniendo en cuenta las reservas actualmente en explotación como las que aún permanecen sin explotar. Se seleccionó el Salar del Hombre Muerto como sitio de estudio de donde se tomaron muestras de suelo de dos puntos diferentes, de agua dulce y de salmuera. Estas se caracterizaron de acuerdo con su composición química y sus propiedades físicas. También se estudió la composición de la comunidad microbiana en muestras de suelo utilizando técnicas de metagenómica. El análisis de los datos obtenidos permitió establecer una relación entre las propiedades de los suelos con las comunidades microbianas que lo habitan. Por otra parte, se evaluó la presencia de microorganismos mediante microscopía óptica y electrónica en las muestras de agua dulce y salmuera y se aislaron bacterias y hongos mediante técnicas microbiológicas a partir de las muestras disponibles. Del total de 238 cepas bacterianas obtenidas, se continuó el trabajo con aquellas capaces de crecer en altas concentraciones salinas (186), de las que se evaluó su tolerancia al cloruro de litio mediante el crecimiento en medios de cultivo sólido (ensayo del canal) y líquido. Las 36 cepas bacterianas clasificadas como tolerantes en medio líquido (de un total de 56 clasificadas como tal en medio sólido) se caracterizaron en cuanto a su morfología microscópica y la de sus colonias y a su capacidad de formar biofilms y de producir carotenoides. De ellas, 26 cepas se secuenciaron e identificaron empleando técnicas de biología molecular y bioinformática. Se depositaron las secuencias obtenidas en el GeneBank.A partir de los aislamientos bacterianos tolerantes a litio, se seleccionó un grupo de 8 cepas de las que se evaluó la capacidad de crecer en presencia de cloruro de litio y de recuperar el litio soluble. Se verificó que las células poseen la capacidad de remover una fracción del litio soluble y que en algunas de las cepas el litio, en elevadas concentraciones, afectó a la morfología celular.Asimismo, se evaluó la tolerancia al cloruro de litio de 19 cepas de arqueas halófilas, de diferente origen, en medio sólido mediante el ensayo del canal y el crecimiento en medio líquido con diferentes concentraciones de sales de sodio y litio. Se identificaron tres cepas halófilas extremas y dos con capacidad para crecer en altas concentraciones de litio, siendo estas últimas comparables a los aislamientos bacterianos obtenidos.Finalmente, se seleccionó una de las cepas aisladas del Salar del Hombre Muerto, Micrococcus luteus SA211, para profundizar su estudio. Se secuenció y analizó su genoma y metiloma completo, lo que permitió analizar la potencialidad de la cepa y predecir que la mayoría de las proteínas que la cepa podría sintetizar serían ácidas. Se estudió la síntesis diferencial de proteínas de esta (y de otras tres cepas) en ausencia y presencia de sales de litio para identificar las proteínas involucradas en la respuesta al litio, a la vez que se compararon con las sintetizadas en presencia de sodio. Se identificaron 46 proteínas diferencialmente sintetizadas, involucradas en distintas funciones del metabolismo celular, relacionadas con la presencia de litio.En conclusión, se alcanzaron los objetivos propuestos en el tiempo previsto. Este trabajo, primero en su índole con muestras del Salar del Hombre Muerto, constituye una base sólida para profundizar los estudios de las capacidades de las cepas obtenidas y optimizar procesos de recuperación de litio soluble, entre otras potenciales aplicaciones biotecnológicas observadas en las cepas aisladas.

En las Angiospermas, la reproducción incluye procesos en los cuales el transporte de agua está espacial y temporalmente regulado. Durante la microgametogénesis del polen, el contenido de agua del grano de polen comienza a aumentar de manera significativa desde el estadio temprano de la microespora y continúa haciéndolo hasta la deshidratación parcial. El volumen de polen, al igual que el contenido de agua, disminuye durante la deshidratación de las anteras y el polen, se adapta a las condiciones ambientales durante la dispersión y aumenta durante la rehidratación en el estigma. En plantas con estigmas secos, la regulación de la rehidratación del polen proporciona una barrera temprana y eficaz para las polinizaciones incompatibles. El agua, los nutrientes y otras moléculas pequeñas son transportados rápidamente desde las papilas estigmáticas al grano de polen para promover su germinación por mecanismos que aún no se conocen completamente. Luego durante la elongación del tubo polínico, la entrada adicional de agua a través de la membrana plasmática permite el ajuste citosólico de iones (Ca2+, K+, H+ y Cl–) y de la presión de turgencia. Se ha propuesto que las acuaporinas estarían involucradas en el transporte de agua y/o solutos durante la germinación del polen y el crecimiento del tubo polínico. En Arabidopsis thaliana sólo 4 genes (de un total de 35 loci) se expresan específicamente en los granos de polen maduros y/o tubos polínicos: AtTIP5;1, AtTIP1;3, AtNIP4;1 y AtNIP4;2. En este trabajo de tesis se demuestra la participación de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 en los procesos asociados a la reproducción. Los genes AtNIP4;1 y AtNIP4;2 presentan alta identidad de secuencia nucleotídica, estructura génica similar (5 exones, 4 intrones) y están dispuestos en tándem. A nivel de proteínas, tienen un 84% de identidad aminoacídica, y comparten los mismos dos motivos NPA y el filtro de constricción ar/R (W, V, A, R), involucrados en la selectividad del transporte. Sin embargo, AtNIP4;1 y AtNIP4;2 muestran diferentes patrones de expresión. Ensayos de PCR en tiempo real demostraron que AtNIP4;1 tiene niveles relativos de expresión bajos en polen maduro y que AtNIP4;2 presenta un pico de expresión durante la elongación del tubo polínico. Además, flores transgénicas promotorNIP4;1::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS en los granos de polen maduros y persistente en los tubos polínicos, mientras que las flores promotorNIP4;2::GUS mostraron una fuerte actividad de GUS solamente en el tubo polínico. Por lo tanto, nuestra hipótesis es que AtNIP4;1 y AtNIP4;2 podrían tener redundancia funcional durante la reproducción, pero desempeñar roles diferentes y específicos en el desarrollo del polen, la polinización y/o fertilización. Con el objetivo de llevar a cabo experimentos fisiológicos in vitro e in planta, se obtuvieron plantas mutantes simples de inserción de ADN-T y se generaron líneas amiARN doble knockdown. Las plantas simple mutante y doble knockdown mostraron parámetros de fertilidad afectados: reducción del número de semillas por silicua y segregación distorsionada asociada solamente al gametofito masculino. Además, las plantas doble knockdown mostraron reducción de la viabilidad y del diámetro de los granos de polen maduros, aumento del número de granos de polen inmaduros (granos de polen uni y bi-celulares), defectos en la rehidratación de polen, reducción de la tasa de germinación y de la longitud del tubo polínico (especialmente en condiciones limitantes de ácido bórico), y aumento del porcentaje de las flores no polinizadas. También se generaron líneas de complementación que expresan las proteínas de fusión eGFPAtNIP4; 1 y eGFP-AtNIP4;2 bajo sus promotores endógenos en el background de sus respectivas líneas simple mutantes. Los análisis de segregación demostraron que estas líneas de complementación rescatan el fenotipo mutante. Además, mediante microscopía confocal se observó que la proteínas de fusión eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 están localizadas en la membrana plasmática y en vesículas intracelulares de los granos (AtNIP4;1) y tubos polínicos (AtNIP4;1 y AtNIP4;2). Ensayos de expresión heteróloga de eGFP-AtNIP4;1 y eGFP-AtNIP4;2 en ovocitos de Xenopus laevis confirmaron que ambas acuaporinas presentan una baja permeabilidad al agua y un significativo transporte de glicerol. Ensayos de actividad quinasa in vitro demostraron que los dominios C-terminales de AtNIP4;1 y AtNIP4;2 son fosforilados específicamente en Ser267 por AtCPK34, una proteína quinasa dependiente de calcio expresada en polen, sugiriendo que la fosforilación puede regular su actividad de transporte in planta. En resumen las evidencias obtenidas en esta tesis doctoral permiten sugerir que AtNIP4;1 estaría involucrada principalmente en las etapas del desarrollo del polen, polinización y germinación, y AtNIP4;2 tendría un rol preponderante en la elongación del tubo polínico. Palabras claves: acuaporinas de polen, transporte de agua, reproducción

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

Se caracterizó la musculatura natatoria de nototénidos subantárticos mediante técnicas histoquímicas, determinándose la presencia de cuatro tipos de fibras: SDF, rojas, intermedias y blancas. Se demostró la utilidad de la técnica de la mATPasa para diferenciar distintos tipos musculares. El proceso de hiperplasia muscular cesó al 40 - 70 % de la talla máxima de cada especie, encontrándose tres patrones distintos de incorporación de fibras directamente relacionados con las tallas finales de las mismas. Las fibras musculares de E. maclovinus y P. tessellata mostraron la misma tasa de crecimiento. Todos los nototénidos subantárticos estudiados presentan valores de flotabilidad propios de especies de hábitat bentónico. El rendimiento natatorio de E. maclovinus fue superior a 10°C que a 4°C. La velocidad, aceleración y potencia inercial de los arranques rápidos de E. maclovinus a 2 °C fueron superiores a los de una especie antártica (N. rosii), y el grado de curvatura del cuerpo y de estiramiento de las fibras blancas similares a los de especies de aguas templadas y tropicales. Los valores energéticos de distintos órganos y tejidos de las especies que se separaron antes del tronco ancestral de los nototénidos mostraron valores significativamente mayores que los del resto de las especies.

A través del tiempo las bacterias, como organismos unicelulares, han localizado eficientemente en sus pequeños genomas la información necesaria para afrontar el desafío de los cambios ambientales. En términos genéticos (informativos) las bacterias han concentrado la mayoría de las funciones basales (mantenimiento, housekeeping) en sus replicones más grandes (los cromosomas) dedicando compartimientos genéticos especiales y móviles (plásmidos, islas de ADN, transposones, integrones) para diversas respuestas adaptativas (a factores abióticos y bióticos). La partición del material genético en módulos, como elementos funcionales adicionales al cromosoma (“moviloma”, mobilome), facilitó la reducción del tamaño de los genomas permitiendo compartir genes (funciones) transitoriamente importantes (adaptativas) entre miembros separados de la propia comunidad. Una partición genética con redundancia previene, al mismo tiempo, la pérdida masiva de información genética cuando miembros individuales de la comunidad bacteriana mueren. Al mismo tiempo, variantes génicas nuevas son susceptibles de hacerse comunitarias a través del moviloma, excediendo la relevancia de las mismas para clones individuales debido a la posibilidad de transponer barreras de especie y de género. De este modo, el conjunto de plásmidos y otros elementos móviles en un ambiente dado representa un recurso genético central en el contexto de la evolución de las bacterias y de sus estrategias de manejo y uso colectivo de la información. En nuestro laboratorio se estudia desde hace más de 30 años, y desde diferentes ángulos, la asociación entre Sinorhizobum meliloti y alfalfa como sistema modelo de una interacción simbiótica bacteria-planta en el suelo. Ante la posibilidad de contar con una colección de aislamientos de S. meliloti portadores de plásmidos bien caracterizados en su diversidad y capacidad conjugativa [1], en este trabajo de tesis hemos diseñado y puesto en práctica una estrategia para el aislamiento, caracterización, y análisis secuencial y funcional (a escala de megabases) de plásmidos crípticos de S. meliloti. En ese contexto, hemos luego investigado su rol en la evolución y conformación del genoma actual de los rizobios, y su relación con los plásmidos de otras bacterias asociadas a plantas. Como parte del trabajo hemos podido poner en evidencia vínculos de ortología de genes plasmídicos con genes de diferentes fracciones de los distintos replicones de S. meliloti, e inferir con varias herramientas (análisis de fracciones core, singletones, contenidos GC%, uso de codones) posibles relaciones de ancestralidad respecto de la adquisición de los mismos por parte S. meliloti. Hemos obtenido además evidencia que muestran al pSymA como el replicón con el contenido génico más vinculado al moviloma plasmídico críptico, y como el intercambiador más activo de genes metabólicos con el pool de genes móviles. Por otra parte, teniendo en consideración que la micro-biota asociada a un nicho ecológico resulta de procesos permanentes de coevolución, en una segunda fase del trabajo aislamos y caracterizamos el moviloma plasmídico correspondiente a otras bacterias asociadas a semillas de alfalfa (simpátricas de S. meliloti, a partir de representantes de más de 10 géneros diferentes) e investigamos las características del mismo (genes, funciones) y su relación con el moviloma de los rizobios. Los resultados de los análisis realizados aportaron evidencia en apoyo del intercambio génico entre el moviloma de S. meliloti y el de la población de sus bacterias simpátricas, así como entre los plásmidos de estas últimas entre sí. La magnitud de información plasmídica aislada, secuenciada y analizada en esta tesis (megabases) colectada a partir de una especie modelo de rizobio y de un conjunto de sus bacterias simpátricas representa el primer intento de abordar a escala comunitaria el análisis estructural de movilomas de un mismo nicho, incluyendo su contenido funcional, características comunes, y participación en la evolución de replicones más estables de las bacterias por donde transitan.

Objetivos generales: caracterización molecular de los genomas de las variantes del virus Junín asociadas a diferentes formas clínicas de la fiebre hemorrágica argentina (FHA). La atención se circunscribirá al análisis de los genes correspondientes a las proteínas estructurales más abundantes: la proteína de la nucleocápside (N) y el precursor de las glicoproteínas virales (GPC) de las cepas prototipo estudiadas por McKee et al. (1987). Diseño de una metodología para detectar y caracterizar arenavirus del área endémica de la FHA. Se realizará la caracterización molecular de los arenavirus desconocidos que pudieran ser encontrados. Objetivos específicos: se cultivarán cepas con distinto grado de virulencia y se aislarán sus RNAs para luego obtener copias de cDNA. Éstos serán amplificados por PCR y se determinará la secuencia nucleotídica de los RNAs S completos. La caracterización de las cepas prototipo estará orientada a la búsqueda de alteraciones en el genoma de los RNAs S y al análisis de sus productos génicos (principalmente el precursor de las glicoproteínas virales, GPC), con el objeto de identificar cambios que pudieran estar asociados a los diferentes comportamientos biológicos. De la comparación de los genomas y productos génicos de variantes del virus Junín con distintos grados y patrones de virulencia se podrán sugerir las causas moleculares de los diferentes comportamientos biológicos observados. Además, se buscarán regiones conservadas en la secuencia nucleotídica de los RNAs S de diferentes arenavirus. Este análisis hará posible el diseño de un conjunto de primers generalizados que permitirían amplificar por RT-PCR regiones homólogas del genoma de los arenavirus. Los fragmentos amplificados serán caracterizados por RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) y/o por secuenciamiento nucleotídico. Se empleará la técnica de RT-PCR-RFLP para detectar y caracterizar, en forma rápida, aislamientos de arenavirus desconocidos o emergentes en programas de screening en poblaciones de roedores. La obtención de fragmentos solapados permitirá realizar un clonado rápido que abarque el RNA S completo de los arenavirus encontrados. Se realizará el análisis filogenético molecular a partir de la comparación de las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas predichas de los diferentes arenavirus caracterizados. Dicho análisis permitirá relacionar los diferentes arenavirus reportados y realizar una clasificación que refleje las relaciones que surgen de la reconstrucción hipotética de la filogenia.

Beauveria bassiana es un hongo filamentoso enemigo natural de insectos plaga de sistemas agrícolas y artrópodos vectores de enfermedades. Para invadir a sus hospedadores, no necesita ser ingerido, sino que inicia su ciclo infectivo penetrando la cutícula. La epicutícula es la primera capa de la cutícula y está compuesta por lípidos no polares, entre los que predominan hidrocarburos de cadena larga. Se conoce que Beauveria bassiana es capaz de crecer en medios artificiales con hidrocarburos aumentando su virulencia contra insectos blanco. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el crecimiento de Beauveria bassiana en hidrocarburos análogos de insecto y estudiar los cambios celulares y moleculares involucrados en el proceso de captación y degradación de estos compuestos. Se halló que el crecimiento de Beauveria bassiana en hidrocarburos desencadena un escenario de estrés oxidativo, modifica la hidrofobicidad de la superficie celular y sus características topográficas, e induce genes potencialmente involucrados en la degradación de hidrocarburos. Se caracterizó por primera vez la producción de pellets miceliales, propágulos novedosos en esta especie, patógenos de insecto, tolerantes a la desecación y cambios de temperatura, y capaces de producir conidios viables con reservas endógenas. Las células que conforman los pellets miceliales evidenciaron una activa proliferación de peroxisomas, alta actividad peroxidasa/catalasa y estructuras en su superficie similares a pelos potencialmente involucradas en la captación e internalización de hidrocarburos. También se encontró por primera vez que Beauveria bassiana produce microesclerocios en cultivos líquidos ricos en fuentes de carbono, con la consecuente inducción de marcadores de estrés oxidativo y genes involucrados en la biogénesis de peroxisomas durante su formación. Estos nuevos propágulos presentan un gran potencial para su formulación y utilización en programas de control biológico.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Laboratorio de Biología Molecular Aplicada - LaBiMAp-Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales FCEQyN-CONICET- Universidad Nacional de Misiones / Universidad Nacional de Córdoba. 2016. 156 h. con Anexos + CD. tabls.; ils.; grafs; Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis.