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Con el fin de obtener conocimientos que sirvan de aporte para futuros desarrollos de alimentos funcionales que contengan a las proteínas de amaranto como uno de sus ingredientes, en este trabajo nos hemos propuesto estudiar los aspectos básicos de la actividad antitrombótica de las proteínas de amaranto. Se estudiaron diversos protocolos de hidrólisis sobre los aislados proteicos de amaranto como una herramienta que nos permitiese generar distintos polipéptidos y péptidos activos. En todos los casos se observó que el tratamiento enzimático sobre las proteínas de amaranto generó péptidos con potencial actividad antitrombótica, siendo mucho más efectivo cuando la hidrólisis fue realizada por las enzimas gastrointestinales utilizadas en la simulación. Los resultados prometedores obtenidos con el aislado sometido a la digestión gastrointestinal nos impulsaron a seleccionarlo para ahondar en la búsqueda de péptidos con actividad antitrombótica presentes en las proteínas de amaranto, realizándose determinaciones in vitro, in vivo y ex vivo sobre la muestra. En los ensayos realizados con animales se pudieron estudiar parámetros asociados a las distintas etapas de la hemostasia, sugiriendo los resultados que el aislado proteico de amaranto es un potencial agente antitrombótico. Los péptidos que se encuentran encriptados en las proteínas de amaranto, una vez liberados durante la digestión gastrointestinal serían capaces de ejercer un efecto antiplaquetario y/o anticoagulante. Con el objeto de intentar comprobar la hipótesis anteriormente mencionada, se buscó purificar aquellos péptidos responsables de la actividad antitrombótica y estudiar la potencial biodisponibilidad de los mismos. Se logró, de este modo, obtener una fracción con muy alta actividad antitrombótica in vitro y las pruebas de absorción realizadas utilizando esta fracción activa, junto con su secuenciación nos permitieron encontrar péptidos potencialmente bioactivos, algunos de los cuales lograron atravesar el epitelio intestinal representado por la monocapa celular desarrollada en el inserto. Los resultados encontrados a lo largo de este trabajo de tesis fueron consistentes y nos inducen a pensar que en las proteínas de amaranto se encuentran encriptados péptidos bioactivos capaces de ejercer una actividad antitrombótica. Queda aún pendiente esclarecer el o los mecanismos de acción involucrados.

La hipótesis de trabajo sobre la cual se han formulado los objetivos específicos es la siguiente: péptidos provenientes de proteínas de la semilla de Amaranthus hypochondriacus presentan propiedades anti-inflamatorias capaces de modular la respuesta inmune innata, mediante la inhibición de la vía NF-κB y la respuesta inflamatoria. Objetivos específicos: - Obtener, caracterizar y aislar péptidos a partir de hidrolizados de proteínas, provenientes de semillas de Amaranthus hypochondriacus. - Modular la expresión de la quimioquina CCL20, inducida por flagelina en células epiteliales de colon humano, mediante la administración de hidrolizados proteicos y péptidos sintéticos, provenientes de Amaranthus hypochondriacus. - Modular in vivo la respuesta inmunológica Th2-dependiente específica de proteínas de leche bovina en un modelo en ratón de alergia alimentaria IgE-mediado, mediante la administración oral de péptidos sintéticos provenientes de Amaranthus hypochondriacus.

El Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB) representa un importante desafío a nivel productivo debido a su carácter endémico prácticamente a nivel mundial. La infección por el VDVB es altamente prevalente en la Argentina provocando pérdidas económicas para la industria lechera y ganadera, asociadas mayormente a problemas reproductivos. La enfermedad provocada por el VDVB se presenta con una variada signología que puede ir desde un curso subclínico a cuadros agudos hemorrágicos cuyo desenlace suele ser fatal. A esto se suma el efecto inmunosupresor del VDVB que predispone a infecciones bacterianas y parasitarias que pueden comprometer la vida del animal. El VDVB pertenece a la familia Flaviviridae, género Pestivirus y está representado por 3 genotipos: VDVB-1, VDVB-2 y VDVB-3 o “Virus HoBi-like”. A su vez, este agente puede ser clasificado según su biotipo en citopático (CP) y no citopático (NCP). Una característica fundamental del VDVB es su capacidad de generar infecciones persistentes. El nacimiento de animales persistentemente infectados (PI) tiene lugar cuando las hembras preñadas se infectan con una cepa NCP del VDVB entre los días 30 y 150 de gestación. Estos individuos no son capaces de montar una respuesta inmune y eliminan grandes cantidades de virus en todas las excreciones y secreciones. Actualmente se proponen dos medidas principales para el control de la enfermedad: la detección y eliminación de animales PI, y la posterior vacunación de todo el rodeo no PI. La primera medida es recibida con fuerte resistencia por parte de los productores. Por otro lado, la inmunidad que confieren las vacunas que se encuentran en el mercado requiere más de dos semanas para desarrollarse e incluso de más de una dosis, siendo dudosa su eficacia en presencia de inmunidad materna. A estos inconvenientes se suma que la mayoría de las formulaciones comerciales no brindan cobertura contra todas las cepas del virus que circulan en el campo. Para complementar el conjunto de herramientas para el control del VDVB se precisan antivirales que puedan prevenir la dispersión viral, evitando la inmunosupresión. Los antivirales podrían utilizarse en casos de brotes o como preventivo antes de ciertas maniobras como el transporte, encierro, inseminaciones, introducción de nuevos animales, etc. En este trabajo proponemos el uso de Interferones (IFNs) ya que son antivirales naturales, de sencilla producción y amplio espectro. En contraste con la respuesta inmune adaptativa, los mecanismos innatos de defensa inmune mediados por IFN son inmediatos, y resultan operativos incluso en las primeras etapas de desarrollo intrauterino. La administración de IFN como agentes bioterapéuticos es una medida efectiva para el tratamiento de varias infecciones virales. Tradicionalmente en terapias desarrolladas para humanos se han utilizado IFN de tipo I (IFN-α) que están siendo actualmente reemplazados, dada su toxicidad hematológica, por los IFN de tipo III (IFN-λ), cuyo efecto antiviral es idéntico al IFN-α pero localizado en epitelios, principalmente en mucosas, sin efecto sobre las células sanguíneas. La familia de IFN-λ se encuentra conservada en bovinos y el tratamiento con IFN-λ3 ha mostrado ser eficaz en controlar la infección oronasal por el virus de la fiebre aftosa (VFA). No se ha estudiado la aplicación terapéutica ni la funcionalidad del IFN-λ3 a otros virus que afectan la producción ganadera. Este trabajo plantea las siguientes hipótesis: “El IFN-λ3 bovino posee actividad antiviral contra el VDVB”; y “El IFN-λ3 bovino recombinante es un candidato para ser utilizado como bioterapéutico en infecciones con el VDVB”. Para contrastar estas hipótesis, hemos clonado y expresado el INF-λ3 y el IFN-α bovinos en células de mamífero en cultivo y evaluamos su actividad antiviral frente a distintas cepas del VDVB tanto in vitro como in vivo para comprobar su potencial uso como bioterapéutico en bovinos. Los IFN recombinantes (IFNr) producidos en sobrenadantes de células HEK293T transfectadas fueron cuantificados en función a las unidades activas determinadas sobre virus de referencia y utilizando un ensayo reportero de actividad basado en células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) transfectadas en forma estable con un promotor MxA río arriba del ORF para la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Para establecer la sensibilidad de cepas de campo y de referencia del VDVB a los IFNr, desarrollamos una técnica de alto rendimiento aplicable a cepas CP y NPC. Se trata de un ELISA en células que permite la medición directa de la infección detectando una proteína no estructural del virus en microplacas de cultivo celular, sin necesidad de cosechar las células. Utilizando este ensayo estimamos la concentración inhibitoria 50% para cada IFNr utilizando seis cepas de VDVB de diferente biotipo y genotipo, verificando que las cepas CP son más susceptibles a ambos IFNr que las NCP y, particularmente, las cepas NCP de tipo 2 resultaron más sensibles a IFN-λ. La actividad de los IFNr fue evaluada luego in vivo, en un modelo murino de virulencia desarrollado en nuestro laboratorio, en el que ratones de la cepa BALB/c infectados con cepas del tipo 2 del VDVB desarrollan viremia a los 4 ó 7 días post infección (dpi), según la virulencia de la cepa. La cepa de alta virulencia suprimió además la respuesta proinflamatoria en estos animales. El tratamiento de los ratones con IFNr murinos comerciales mostró que el IFN-λ sería más eficiente en prevenir la infección mientras que el IFN-α evitaría la viremia. Experimentos de tratamiento combinado con dos dosis de antiviral pre-y post infección, combinando el uso de ambos IFNs, reveló que el tratamiento con IFN-λ antes de la infección seguido luego por IFN-α fue efectivo en controlar la viremia en los ratones, y que un tratamiento pre y post-infección con IFN-λ resultaba igualmente protector. La limitación de la replicación del VDVB se verificó además por la ausencia de TNF-α sistémico. Estos resultados entonces indicaban que el IFN-λ resultaba efectivo contra el VDVB in vivo, y que no sería preciso combinarlo con IFN-α. Para evaluar el uso de nuestros IFNr en bovinos establecimos primero la inocuidad de los mismos sobre células sanguíneas bovinas (ex vivo) donde ambos IFN mostraron ser seguros a las dosis de uso propuestas, a pesar de que el IFN-α causó apoptosis de células inmunes bovinas a dosis altas. La inocuidad posológica se realizó directamente en los animales mediante el control de parámetros hematológicos durante 14 días postinoculación, revelando la ausencia de toxicidad con dosis de IFN-λr más altas. A partir de estos resultados se realizó una prueba de concepto en terneros para evaluar la actividad antiviral del IFN-λr frente a la infección con una cepa de baja virulencia aislada en la provincia de Buenos Aires, del genotipo 2 y biotipo NCP, ampliamente caracterizada en nuestro laboratorio. Se seleccionaron para el estudio 6 terneras libres del VDVB, que fueron infectadas con la cepa antedicha. Cuatro de ellas fueron inoculadas por vía subcutánea con dos dosis de IFN-λr dos días previos a la infección y dos días posteriores a la misma, mientras que las otras dos terneras recibieron tratamiento placebo (medio de dilución). Los animales infectados-no tratados desarrollaron enfermedad clínica con síntomas respiratorios entre los 2 a 4 días post-infección, detectándose también viremia y excreción viral a través de secreciones nasales. Todos los animales del grupo tratado con IFN-λr no desarrollaron enfermedad, no presentaron signos clínicos. En tres de ellos no de detectó viremia ni excreción viral nasal. Un individuo de este último grupo presentó viremia y excreción viral pero con valores menores a los del grupo no tratado. Hemos desarrollado un antiviral seguro y eficaz, IFN-λ bovino recombinante, demostrando la factibilidad de su potencial utilización para la prevención y el tratamiento de las infecciones por el VDVB. Comprobamos el efecto antiviral del IFN-λr sobre cepas de campo y de referencia in vitro, como así también su inocuidad y eficacia en bovinos contra una cepa de campo Argentina del genotipo 2, biotipo NCP. Hemos establecido el modelo ratón de viremia por el VDVB, de gran utilidad para los estudios con este virus in vivo. Desarrollamos una técnica novedosa, que consiste en un ELISA en células que utiliza un anticuerpo detector contra una proteína conservada no estructural que puede ser potencialmente aplicable para medir con precisión la infectividad de cualquier cepa viral, independientemente de su capacidad de causar la muerte de células en cultivo. Este trabajo constituye la primera evidencia experimental del potencial bioterapéutico del IFN-λ bovino contra el VDVB in vivo, abriendo una nueva perspectiva enfocada en el uso de antivirales biológicos económicos, biodegradables y seguros para reducir la incidencia de las infecciones virales en animales en ámbitos productivos. La aplicación de esta herramienta podría impactar indirectamente en la disminución del uso de antibióticos al decrecer la tasa de infecciones bacterianas que devienen de las infecciones virales inmunosupresoras.

Los virus de la familia Arenaviridae incluyen patógenos humanos causantes de severas fiebres hemorrágicas, como los virus Lassa (LASV)y Junín (JUNV). La proteína Z de los arenavirus, posee un motivo RING finger altamente conservado entre los distintos arenavirus, necesario para la interacción con proteínas celulares y virales, y por lo tanto es un punto de ataque ideal para la quimioterapia antiviral contra las fiebres hemorrágicas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la actividad inhibitoria de compuestos electrofílicos reactivos con motivos Zn fingers. provistos por el National Cancer Institute (USA), comprobar que Z es el blanco de acción de dichos compuestos y demostrar que su rol es esencial en el ciclo de multiplicación viral. Los compuestos, que incluyeron disulfuros alifáticos y aromáticos, derivados azoicos e hidrazidas fueron inicialmente evaluados por su capacidad inhibitoria sobre la infección de células Vero contra los arenavirus JUNV y Tacaribe (TCRV). De un total de 15 compuestos ensayados, 2 presentaron similar eficacia en sus propiedades antivirales y virucidas, 6 presentaron una actividad virucida superior a su efecto antiviral, 3 fueron estrictamente antivirales, 1 ejerció únicamente acción inactivante y 2 fueron inactivos. Los compuestos inactivantes mostraron ser efectivos también contra el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV), arenavirus prototipo de la familia. El análisis de los parámetros (tiempo y temperatura) que afectan la inactivación de JUNV y TCRV, demostró que la cinética de inactivación es rápida y que la reacción es dependiente de la temperatura, ya que no hubo inactivación del virus a 4°C. La interacción entre el virus y el compuesto inactivante lleva a un bloqueo del ciclo de multiplicación viral a nivel de la transcripción y replicación, ya que el mismo se adsorbe y penetra en las células con igual eficacia que el virus control, pero no se detecta RNA correspondiente a los genes N, GPC y Z, en los viriones inactivados. Este hecho se verificó por la ausencia total de síntesis de proteínas virales cuando se infectan células con virus inactivado. Sin embargo, los viriones inactivados mantienen la funcionalidad de las proteínas externas, ya que se observaron títulos comparables de anticuerpos neutralizantes en animales inoculados con viriones inactivados con respecto a los inoculados con JUNV y TCRV infecciosos, indicando así la preservación de la capacidad antigénica de las glicoproteínas luego del tratamiento inactivante. La acción diferencial de estos agentes sobre HSV-1 y los arenavirus confirma que la proteína Z de los arenavirus juega no sólo un rol regulatorio durante el ciclo viral, sino que tiene también importancia estructural, ya que los compuestos ejercen su acción tanto en la célula infectada, como directamente sobre el virión.Los resultados del estudio del efecto inhibitorio sobre la proteína Z purificada de LCMV y LASV, indicarían que los compuestos están dirigidos particularmente hacia la proteína Z de los arenavirus, interaccionando con ella y provocando su multimerización, con la consiguiente pérdida de funcionalidad y capacidad infectiva del virión. Por otro lado, se sabe que la infección con LCMV conduce a la recolalización de cuerpos nucleares de la proteína celular con homeodominios ricos en prolina (PRH) al citoplasma de la célula infectada. En células infectadas con LCMV se observó que el tratamiento con NSC20625 inhibe la replicación del RNA viral, sin afectar la transcripción del gen celular prh. Además, el tratamiento con NSC20625, no sólo inhibió la expresión de la proteína viral Z en las células infectadas con LCMV, sino que además revirtió el patrón de distribución de la proteína PRH al patrón de PRH observado en células normales. Por último, el compuesto azoico ANNB mostró un amplio rango de acción contra los arenavirus, ya que fue también inhibidor de la multiplicación de otras cepas de JUNV, asi como de TCRV, Pichinde y LCMV. El estudio del modo de acción antiviral manifestó que el ANNB afecta las etapas tardías del ciclo de multiplicación viral; esto se comprobó al observar que ni las etapas tempranas de adsorción e internalización viral, ni la síntesis y expresión de proteínas virales estaban afectadas. La producción de virus asociado a células está igualmente afectada que el virus extracelular, por lo que el ANNB estaría bloqueando el correcto ensamblado dentro de la célula. Estos resultados demuestran por primera vez que una proteína esencial para los arenavirus es el blanco de acción de compuestos que representan agentes antivirales promisorios contra estos patógenos, mostrando similar eficacia in vitro que la ribavirina, la única droga conocida que ha sido ensayada en los pacientes infectados con arenavirus.

En el presente trabajo de tesis doctoral se evaluó las toxicidades agudas por contacto y por ingestión de la alúmina nanoestructurada (NSA), así como los efectos sub-letales de este nuevo principio activo, como efectos sobre la progenie, efecto excitorrepelente y fagodisuasivo de la NSA, en bioensayos sobre adultos del gorgojo del arroz, Sitophilus oryzae (Coleoptera: Curculionidae) bajo condiciones de laboratorio. Sitophilus oryzae fue seleccionado como modelo experimental para los bioensayos, debido a que se trata de una de las especies plaga más importante y de distribución mundial, que infesta un amplio espectro de cereales y productos derivados, causando daños de hasta el 50% del total de la producción de granos almacenados. Los resultados de los bioensayos de exposición por contacto de Sitophilus oryzae a trigo tratado con NSA, muestran que luego de 7 días de exposición continua, el efecto insecticida de la NSA fue mayor que el obtenido con los dos polvos inertes evaluados con fines comparativos (Protect-It® y DiatomiD). La eficacia insecticida de la NSA queda en evidencia a partir de los valores de concentración letal media obtenidos. Estos fueron CL50= 97 (90-104) ppm para NSA, CL50= 152 (140-165) ppm para Protect-It® y CL50= 324 (289-371) ppm para DiatomiD®.La toxicidad por ingestión de la NSA para Sitophilus oryzae fue evaluada en laboratorio mediante bioensayos de alimentación utilizando discos de harina (alimento artificial), para lo cual fue necesario diseñar y validar previamente una técnica para ensayos con polvos inertes. Para estos bioensayos se prepararon suspensiones de 500, 350, 250, 125, 75 y 36 ppm de NSA en harina de trigo y agua. El mismo procedimiento se repitió con tierra de diatomeas (DE). Los discos de harina para los controles fueron preparados con agua y harina. Después de 35 días de exposición al alimento tratado, los valores de concentración letal media (CL50) calculados fueron: CL50= 200 (186-216) ppm para NSA, CL50= 232 (214-251) ppm para Protect-It® y CL50= 535 (480-615) ppm DiatomiD®. Estos resultados revelaron que la mortalidad por ingestión es un factor secundario pero relevante, que en principio ocurre durante la exposición de los insectos al sustrato tratado.La eficacia de la NSA en condiciones de laboratorio en pequeños silos fue evaluada en el marco de la exposición de Sitophilus oryzae a trigo tratado vs trigo control. La supervivencia parental, el daño producido en granos (peso del grano-producción de frass) y la producción de progenie (efectos transgeneracionales) fueron medidos a concentraciones de 250 ppm y 500 ppm y contrastados con DE (DiatomiD® y Protect-It®.) Los ensayos de eficacia fueron conducidos en recipientes de 400 ml de chapa de hierro galvanizada (silos pequeños), un modelo experimental utilizado por primera vez con nanoinsecticidas como la NSA. La supervivencia parental obtenida fue alta en los controles (no tratados), seguidos en orden decreciente por DiatomiD®, Protect-It® y NSA. Los tratamientos con NSA, Protect-It® y DiatomiD® redujeron la pérdida de peso del grano y la producción de frass en el trigo infestado de modo estadísticamente significativo. Hubo un efecto significativo de los tratamientos con polvos insecticidas sobre el consumo de trigo por Sitophilus oryzae al día 21 (F= 194,5; g.l.= 6,28, P<0.0001) así como también en el frass producido (F= 74.93; g.l.= 6, 28; P<0.0001). La producción más baja de frass se obtuvo en el trigo tratado con NSA. Se observó una relación directa entre la supresión de la progenie (F1) con el producto y el tratamiento. La F1 se redujo significativamente en el trigo tratado con NSA (F= 456,4; g.l.= 6, 28; P<0.0001).Las propiedades antixenóticas (excitorrepelencia y fagodisuasión) fueron estudiadas. La excitorrepelencia se evaluó en bioensayos de laboratorio con un nuevo método adaptado para polvos inertes y los datos obtenidos fueron analizados usando la ecuación para el porcentaje de excitorrepelencia (PER %). Los resultados indican que la NSA así como el DiatomiD® y Protect-It® utilizados en el estudio no provocan excitorrepelencia. Además, se observó una respuesta de "acoplamiento" o aumento de la interacción de los insectos con la superficie tratada con NSA. La ausencia del fenómeno de excitorrepelencia se debe, en principio, al origen inorgánico de la NSA (Al2 O3) y a que se trata de una sustancia no reactiva, no volátil e insoluble. La ausencia del efecto excitorrepelente contribuye a prolongar el tiempo de contacto del insecto con la NSA, optimizando su eficacia en los bioensayos de exposición por contacto.El efecto fagodisuasivo de la NSA fue evaluado a través de bioensayos de preferencia con posibilidad de elección, basado en el cálculo del índice fagodisuasivo (IF%) El IF calculado mostró que tanto la NSA como DE poseen una fuerte acción fagodisuasiva sobre los insectos [NSA (IF) = 125 ppm = 44,01; 250 ppm = 83,06; 500 ppm = 96,21], [Protect-It® (IF) = 125 ppm = 45,89; 250 ppm = 85,11; 500 ppm = 92,57], [DiatomiD® (IF) = 125 ppm = 36,93; 250 ppm = 55,28; 500 ppm = 86,80]. Los resultados señalan el alto potencial de la NSA para la protección de granos almacenados. Además, el efecto subletal de la NSA puede tener un considerable impacto sobre la alimentación mediante restricciones mecánicas en los órganos de alimentación y eficiencia alimentaria, afectando el acceso y la asimilación de los nutrientes.Los resultados de los bioensayos de laboratorio por exposición, por ingestión, excitorrepelencia y fagodisuasión, así como los de eficacia en silos (supervivencia parental, daño en granos, producción de progenie) revelan el gran potencial de la NSA para el control de plagas de granos almacenados, incluso a concentraciones subletales. Los resultados obtenidos, justifican futuras investigaciones sobre el desarrollo de nuevas variantes del nanoinsecticida NSA mediante la introducción de modificaciones en el proceso de síntesis para lograr mayor eficacia insecticida, así como en la búsqueda de potenciales aplicaciones de la NSA en diferentes ámbitos.

Tesis para obtener el título Ms. en Producción Vegetal. Presentada en la Universidad Nacional de Mar del Plata; Facultad de Ciencias Agrarias: Balcarce, Buenos Aires, AR, 2016