Catálogo de publicaciones

Las proteínas que unen ácidos grasos (FABPs) constituyen una amplia familia de proteínas pequeñas intracelulares (14-15kDa). Las mismas se expresan en distintos tejidos de manera específica, pudiendo expresarse más de una isoforma en un mismo tejido. Este es el caso de FABP1 (o LFABP, isoforma hepática) y FABP2 (o IFABP, isoforma intestinal). Ambas son expresadas en células epiteliales diferenciadas del intestino en elevadas concentraciones relativas. FABP1 se encuentra también presente en riñón e hígado (sitio donde fue descubierta). Estas FABPs han sido caracterizadas como importantes para el transporte y metabolismo de ácidos grasos (AG) provenientes de la dieta y la circulación. Unen ligandos hidrofóbicos, como los AG de cadena larga, con elevada afinidad y los transportan hacia diversos destinos subcelulares como la mitocondria, el retículo, el núcleo, para cumplir funciones en la β-oxidación, síntesis de quilomicrones, regulación de la transcripción génica, entre otros. El intestino es el lugar de contacto con la mayor cantidad de microorganismos y es también el principal sitio de ingreso de nutrientes al organismo, favorecido por la gran superficie de contacto con el lumen intestinal brindado por las vellosidades. Las FABPs presentan su máximo nivel de expresión en el yeyuno, sitio donde se absorben los ácidos grasos. En bibliografía ya ha sido descripta la distribución normal de FABPs a lo largo del eje longitudinal del intestino, así como también la expresión en el eje cripta-vellosidad. Existen patologías del intestino delgado, llamadas enteropatías, con diverso grado de malabsorción de nutrientes, como es el caso de Enfermedad Celíaca (EC). Una patología con características autoinmunes que se desencadena ante la exposición a proteínas del gluten en individuos genéticamente susceptibles y que involucra una atrofia vellositaria, infiltración linfocitaria e hiperplasia de las criptas. En el presente trabajo buscamos profundizar en el conocimiento de las funciones específicas que desempeñan las FABPs del enterocito desde dos aristas: 1) El análisis de la expresión de FABPs en un contexto de enteropatía del intestino delgado ampliamente caracterizada, como lo es EC. 2) El estudio de las interacciones proteína-proteína de las dos isoformas de FABPs con otras proteínas presentes en el enterocito. Dichos trabajos fueron llevados a cabo a través de ensayos in silico, in vitro, en cultivo e in vivo, con muestras de pacientes y modelos animales. Como resultado encontramos una localización alterada de las FABPs en EC. Allí observamos expresión de FABPs en las criptas, hallazgo que nos llevó a considerar que estas proteínas en un contexto patológico pueden presentarse aún en células indiferenciadas y proliferativas. Esto fue confirmado en un modelo murino con alteraciones funcionales similares a EC. FABP2 se expresa en células en proliferación activa, mientras que FABP1 no. En modelos murinos FABP1 y FABP2 knock out, se vió que la ausencia de una de las FABPs no altera la localización ni la expresión de la isoforma remanente. Tampoco se observó alteración en la tasa de proliferación celular. Los ensayos de interacción proteína-proteína llevados a cabo en una línea celular modelo, nos permitieron poner de manifiesto la interacción de FABP1 con Heat Shock Protein 60, Calreticulina, Creatina quinasa B, α- sinucleína, así como también tener evidencias funcionales de la interacción con los factores de transcripción de la familia de los PPARs (receptores activados por proliferador de peroxisoma). Para el caso de FABP2 observamos la interacción con PPARγ. Estos resultados fueron complementados con análisis de acoplamiento (docking) molecular dirigido por análisis electrostáticos de los pares de proteínas interactuantes. En conjunto, los resultados presentados nos permiten tener una mayor comprensión de las funciones que cumplen las FABPs a nivel intestinal y complejizan el espectro de interrelaciones moleculares que llevarían a las FABPs a formar parte de mecanismos diversos además de los estrictamente vinculados al metabolismo lipídico.

La capa S es una estructura de envoltura glico-proteica constituida por subunidades que se auto-ensamblan para formar una matriz bidimensional que cubre completamente la superficie de diferentes especies de bacterias y Arqueas. Debido a su capacidad de formar productos auto-ensamblados en solución, son herramientas atractivas para ser utilizadas como carriers de antígenos o como adyuvantes. Teniendo en cuenta las características funcionales y estructurales extraordinarias que poseen las proteínas de capa S, el objetivo general de este trabajo de tesis fue realizar una caracterización estructural y funcional de las proteínas de capa S de diferentes cepas de Lactobacillus kefiri con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas biotecnológicas. En cuanto a la caracterización de la estructura primaria, utilizando técnicas proteómicas y genómicas fuimos capaces de determinar las secuencias de aminoácidos de las proteínas de capa S en dieciséis cepas de L. kefiri, y las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican para estas proteínas. Teniendo en cuenta la naturaleza glicoproteica de las proteínas de capa S de L. kefiri, seleccionamos 4 proteínas de capa S provenientes de diferentes cepas de L. kefiri y analizamos la estructura de glicanos unidos a estas proteínas. En las cepas L. kefiri CIDCA 8321 y CIDCA 8348, se encontraron O-glicanos en el mismo motivo de glicosilación descripto para L. buchneri, sustituido por hasta 22 unidades de glucosa. La cepa L. kefiri CIDCA 83111 presenta el mismo glicopéptido, pero sustituido en 4 residuos de serina con un promedio de ocho unidades de glucosa, decoradas con ácido galacturónico. Además, la SLP-83111 cuenta con otro péptido O-glicosilado, con una estructura Glc5-8GalA2, y dos péptidos N-sustituidos con estructuras cortas: GlcNAc4Man3dHex y GlcNAc2dHex. La cepa L. kefiri JCM 5818 cuenta con un O-glicano en la misma posición mencionada para las otras tres cepas, sustituido en promedio con ocho unidades de glucosa, y un N-glicano de estructura compleja con ácido siálico en su estructura. Por último, analizamos las propiedades inmunoestimulatorias de las glicoproteínas de capa S de L. kefiri (SLPs) y el rol funcional que tienen los glicanos sobre estas propiedades. Utilizando líneas celulares de macrófagos demostramos que las proteínas de capa S de las cepas L. kefiri CIDCA 8321, L. kefiri CIDCA 8348, L. kefiri CIDCA 83111 y L. kefiri JCM 5818, si bien no son capaces de inducir una activación de los macrófagos, potencian la respuesta a un agonista TLR, en un proceso dependiente de la presencia de Ca+2 y de la actividad biológica de los glicanos presentes en las glicoproteínas de capa S. Utilizando BMDCs derivadas de ratones deficientes de CLRs específicos, pudimos identificar que la SLP-8321 y SLP-8348 son reconocidas y señalizan a través de Mincle, mientras que la SLP-5818 lo hace a través de SignR3. Esta interacción entre las SLPs y BMDCs induce una activación celular que resulta en un aumento en la capacidad estimulatoria de células T en ensayos de proliferación antígeno-específico. Finalmente, demostramos que la SLP-8348 posee capacidad adyuvante utilizando OVA como antígeno modelo, y que este efecto depende de la actividad biológica de los glicanos presentes en esta glicoproteína de capa S.

Los protistas, microorganismos eucariotas unicelulares, suelen constituir relaciones simbióticas con hexápodos. Por su condición, los insectos sociales tienden a forman asociaciones parasitarias muy variadas y particularmente las vinculadas con protistas suelen generar etiologías crónicas y debilitantes en sus hospedadores, causando graves efectos a largo plazo. Siendo Argentina uno de los tres países con mayor producción de miel del mundo, existe un llamativo desconocimiento en torno a los protistas patógenos de A. mellifera. Análogamente, nada se sabe sobre los organismos de igual etiología que afectan a las especies de Bombus. Los efectos que las especies introducidas puedan tener sobre los polinizadores nativos son también desconocidos. Se plantea, por lo tanto, una serie de amenazas a las poblaciones autóctonas incluyendo principalmente la competencia, la hibridación y la vehiculización de patógenos, siendo esta última, quizás, la más significativa. El principal objetivo de esta tesis es la obtención y análisis de información cualicuantitativa referida a las enfermedades infecciosas de etiología protista que se encuentren afectando a los principales himenópteros polinizadores de la superfamilia Apoidea (Apis mellifera y Bombus spp.) en Argentina, con énfasis en la Región Pampeana. Los objetivos particulares se basan en la detección, aislamiento e identificación de los protistas involucrados, la determinación de parámetros de presencia/ausencia y prevalencia de cada uno de ellos, y la evaluación de posibles saltos de hospedador entre especies del mismo o diferente género.