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Se ha estudiado la obtención a partir de la levadura de panaderia (Saccharomyces cerevisiae) de la enzima responsable de la fijación de anhídrido carbónico por dicho microorganismo y cuyas propiedades permiten clasificarla, de acuerdo a la nomenclatura adoptada por Utter, como una carboxiquinasa fosfoenolpirúvica que cataliza la carboxilación reversible del fosfoenolpiruvato de acuerdo a la ecuación: *Ver ecuación en tesis* Se ha desarrollado un método de obtención y purificación de la enzima a partir de polvo acetónico de levadura que comprende las siguientes etapas: A) Extracción de la enzima con buffer borato 0.05 M B) Adsorción negativa con gel de fosfato preparado "in Situ". C) Precipitación con sulfato de amonio entre 42 y 55% de saturación final. Diálisis alcalina. para eliminar el sulfato de amonioy la cocarboxilasa. D) Eliminación de nucleatos por precipitación con sulfato de protamina. E) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Ca^++ recogiendo la fracción que cae entre 8.5 y 17% de concentración alcohólica (v/v). P) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. G) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Zn^++. H) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. I) Cromatografía en columna de dietil amino etil celulosa (DEAE)(O alternativamente en columna de hidroxilapatita) J) Electroforesis de zona en columna de celulosa. La preparación final se comporta en los experimentos de electroforesis libre y ultracentrifugación analítica como un sistema aparentemente homogeneo. La enzima cataliza el intercambio de C^14 O2 con el carboxilo β del oxalacetato a un pH óptimo cercano a 6.1 siendo la reacción dependiente de la presencia de ATP e iones Mn^++. En esas condiciones se pudo aislar oxalacetato radioactivo como 2-4 dinitrofenilhidrazona, la cual se identificó por cromatografía en papel y radioautografía. La acción activadora que el ADP y el fosfoenolpiruvato ejercían sobre la reacción de intercambio sugirió que ambos compuestos podrian estar involucrados en la reacción de fijación, pero los primeros ensayos de carboxilación directa del fosfoenolpiruvato realizados con extractos poco purificados y en diversas condiciones experimentales fueron negativos. Ello recién fué posible llevando a cabo la reacción de carboxilación en presencia de la transaminasa aspártico-glutámica y glutamato o de la málico dehidrogenass y DPNH. En el primer caso utilizando C^14 O2 se pudo aislar y caracterizar por cromatografía en papel y radioautografia, aspartato radioactivo y en el segundo caso se pudo seguir espectrofotometricamente el curso de la reacción de oxidación del DPNH. La reacción de carboxilación del fosfoenolpiruvato requiere ADPe iones Mn^++ y tiene lugar a un pH óptimo de 5.4. El piruvato mas ATP no pueden reemplazar al fosfoenolpiruvato y ADP. La formación de ATP durante dicha reacción y la estequiometria de la mismase estudiaron utilizando un fosfoenolpiruvato marcado con P^32 en el grupo fosfato y llevando a cabo la reacción en presencia de C^14 O2. La determinación de las radioactividades correspondientes al ATP y oxalacetato formadas en esas condiciones permitió comprobar una estricta relación estequiométrica entre ambas. La reacción es especifica para los polifosfatos de la adenosina, siendo la enzima inactiva con derivados de la guanosina, inosina, citidina y uridina ya sea en la fijación directa o en la de intercambio, en cambio los deoxiderivados de la adenosina resultaron parcialmente activos. Si bien los extractos impuros presentan una parcial actividad en ausencia de cationes divalentes, los extractos altamente purificados son sumamente dependientes de los mismos. El ion Mn^++ es el más activo de todos los cationes divalentes ensayados, siguiendole en importancia, el Zn^++, el Co^++, el Mg^++ y el Cd^++. Se estudió la influencia de la concentración de bicarbonato en la reacción de carboxilación pudiéndose determinar la Km(C02) = 9.9 x 10^-3 M y la Km(CO3H^-) = 5 x 10^-3 M. Los reactivos de tioles ejercen acción inhibidora sobre la enzima. El p-cloromercuribenzoato fue el más efectivo pues en concentración 10^-4 M tuvo una acción inhibidora de casi el 100%.En esas condiciones la enzima puede ser reactivada parcialmente por el glutation reducido, dependiendo el grado de reactivación de la duración del período previo de incubación de la enzima con el inhibidor. El melarsen fué menos efectivo (20% de inhibición con una concentración 0.66 x 10^-3 M). El iodosobenzoato y la N-etilmaleimida en concentraciones 7 x 10^-4 y 5 x 10^-4 M respectivamente fueron inactivos. De los inhibidores de la asimilación de anhídrido carbónico por la célula entera, que se ensayaron; 2-4 dinitrofenol, fluoruro y azida sódica, tan solo el último fue capaz de inhibir en forma significativa a la enzima. La enzima ejerce una marcada acción decarboxilante especificamente sobre el oxalacetato, siendo la reacción dependiente de 1a presencia de concentraciones cataliticas de ATP, reemplazable por ADP ó AMP y sus deoxi-derivados. Los otros nucleósido trifosfatos ensayados carecen de acción activadora sobre la misma. Cuando la reacción se realiza en presencia de ATP, los productos de la reacción son piruvato y fosfoenolpiruvato. Este último compuesto se identificó utilizando ATP marcado con P^32 en los grupos fosfatos ɣ y β y aislando un fosfoenolpiruvato radicactivo. En los trabajos de rutina el fosfoenolpiruvato se determinó por el ortofosfato liberable por nitrato mercúrico. Con ADP ó AMP el fosfoenolpiruvato no se forma durante la reacción de decarboxilación. Se debe descartar 1a posibilidad de que el ATP actúe en concentraciones catalitica en 1a reacción. debido a su regeneración continua a traves del sistema de la quinasa pirúvica, porque si bien se determinó la presencia en los extractos utilizados de esta última enzima, la misma requiere estrictamente la presencia de Mg^++ ó Mn^++, en contraste con lo que ocurre con la actividad oxalacético decarboxilante de la enzima de levadura. que es inhibida por cationes divalentes (Mn^++; Zn^++; Cd+^+; Co^++ y Mg^++). También los agentes complejantes de metales tienen acción inhibidora sobre la mencionada actividad decarboxilante. Así el verseno y la o-fenantrolina en concentraciones 6.7 x 10^-6 y 5 x 10-5 M ejercieron una inhibición cercana al 100%.La 8-hidroxiquinolina y el dietilditiocarbamato de amonio presentan una acción inhibidora comparativamente menor. La acción inhibidora del verseno puede ser suprimida por el agregado de un concentración adecuada de iones Mn^++, pero en ese caso se observa la acción inhibitoria propia del Mn^++. A1 igual que la reacción de fijación, la reacción de decarboxilación es inhibida por los reactivos de tioles, siendo el más efectivo el p-cloromercuribenzoato, siguiéndole en importancia el melarsen, N-etilmaleimida, iodosobenzoato y el iodoacetato. Se discute la posibilidad de que ambas actividades (fijación de anhídrido carbónico y decarboxilación del oxalacetato) correspondan a una misma enzima o bién estén relacionadas con entidades proteicas independientes. Además se describen una serie de experimentos realizados con P^32-fosfoenolpiruvato y C^14 02 que pueden interpretarse como un indicio de la formación de un complejo intermediario enzima-sustrato sobre el que se llevaria a cabo la reacción de carboxilación. Finalmente se discuten los posibles mecanismos enzimáticos involucrados en la reacción, en relación a los resultados obtenidos con la enzima de levadura de panaderia y otras enzimas similares.

En el presente trabajo se identificaron con diferentes técnicas los carburos estables en aleaciones de metales de transición de gran interés tecnológico: un conjunto de tres aceros de alta aleación tipo M2 de diferente composición en los que el tungsteno y/o molibdeno han sido total o parcialmente reemplazados por niobio, y una aleación Zr-2.5 % peso Nb. El acero M2 es un acero rápido para herramientas de uso universal y el Zr-2.5 % peso Nb es el material base de los tubos de presión de las centrales nucleares tipo CANDU. La estabilidad de los carburos se estudió en el marco de la teoría de Goldschmidt de aleaciones intersticiales. En los aceros la identificación de carburos estables se hizo mediante la determinación de la composición metálica de los mismos con un analizador dispersivo en energía adosado al microscopio electrónico de barrido. Se identificaron los carburos MC y M6C, típicos del acero M2. Se estudió además la distribución en tamaño y la distribución espacial de los carburos luego de distintos tratamientos térmicos, y se hizo la correlación de la microestructura con la dureza y la presencia o no del fenómeno de endurecimiento secundario. En Zr-Nb se hizo un estudio de las fases alfa y beta presentes luego de distintos tratamientos térmicos con ténicas metalográficas de microscopía óptica y electrónica de barrido y con la guía del diagrama de equilibrio de Abriata y Bolcich. Las interfases alfa-beta de Zr-2.5 % Nb fueron caracetrizadas como caminos rápidos de difusión, con técnicas de difusión de radiotrazadores aplicando el modelo Fisher-Bondy-Martin. Se promovió la precipitación de carburos mediante tratamientos térmicos de difusión de carbono a alta temperatura y precipitación a temperatura menor. Los carburos fueron posteriormente identificados como (Zr, Nb)C1-I con técnicas de microscopía electrónica de barrido, microsonda electrónica y difracción de rayos X.

En este trabajo de tesis presentamos un modelo experimental de carcinogénesis mamaria por MNU y MPA en el ratón BALB/c. En nuestro laboratorio ya se había desarrollado un modelo de inducción de adenocarcinomas mamarios por MPA, en el cual los tumores, que aparecen con una latencia mayor al año, son en su mayoria ductales, hormono-dependientes y expresan en su mayoría altos niveles de RE y RP. En este trabajo hemos desarrollado la caracterización de los tumores inducidos por MNU + MPA en cuanto a su morfología y hormono-dependencia. Además caracterizamos el rol de MPA como promotor tumoral y los efectosde la ovariectomía y de la sialoadenectomía en la inducción de tumores. Hemos desarrollado las condiciones de dosis necesarias como para poder estudiar al carcinógeno MNU como un agente exclusivamente iniciador en el proceso de carcinogénesis mamaria y pudimos definir la acción de promotor tumoral del progestágeno MPA. A partir de los experimentos aquí presentados, definimos también una acción especifica del MPA que es previa a la iniciación, favoreciendo ya sea por modificación o por incremento en el número celular, la transformación neoplásica. A este efecto lo denominamos "permisividad". Las experiencias realizadas en los animales ovariectomizados, demostraron la importancia de las hormonas ováricas. La ovx generó un patrón de atrofia mamaria evidenciable por la técnica de montaje total de las mamas y en este caso, la acción de MNU fue casi nula, lo que sugiere que éste ejerce su acción sobre una celula o grupo de células presente en una glándula sometida a estímulos hormonales. El MPA pudo suplir la ausencia de los ovarios debido quizá a su acción progestacional, elevando los valores de incidencia tumoral a niveles del control positivo. Se obtuvieron resultados interesantes en el análisis del rol de las glándulas salivares en animales pretratados con MPA y MNU en la inducción tumoral. Registramos una significativa disminución en los valores de incidencia tumoral en aquellos animales tratados con MPA y sialo, frente a los controles intactos. Considerando que el MPA provoca un aumento de EGF sérico proveniente de las glándulas salivares y basándonos en datos previos de este efecto en el modelo de carcinogénesis mamaria por MPA, confirmamos también que el EGF también juega un importante rol en el modelo de cocarcinogénesis MNU+MPA, probablemente afectando la fase de promoción. Los tumores de mama surgidos en estos experimentos fueron clasificados como adenocarcinomas con distintos grados de metaplasia pavimentosa. Las diferencias histológicas tan marcadas entre los tumores inducidos por MNU y MPA y la mayoría de los tumores inducidos exclusivamente por MPA nos indujeron a definir estos fenómenos como tipos diferentes de carcinogénesis. La metaplasia pavimentosa fue un atributo exclusivo del MNU, siendo más evidente en los grupos expuestos a un mayor número de dosis de MNU. También fue evidente el la mayor incidencia de fenómenos metaplásicos en animales inoculados con MNU a los dos meses de MPA que a la semana. Todo lo analizado más datos previos nos inducen a pensar que existe una fuerte correlación entre la histología y el agente iniciador (en nuestro modelo MNU). Estudios de montajes de glándulas mamarias revelaron que la metaplasia pavirnentosa precede al desarrollo de la lesión invasora. Los estudios de parámetros biológicos confirman los resultados anteriores demostrando una diferencia muy notable entre ambos modelos experimentales. Como ya se mencionó anteriormente, si bien la mayoría de los inducidos por MPA son hormono-dependientes, todos los inducidos en estos experimentos salvo alguna excepción fueron tumores autónomos. Nuevamente estos resultados nos llevaron a teorizar sobre posibles mecanismos de acción de las hormonas y el carcinógeno en los distintos grupos experimentales discutiendo la probabilidad de que ambos compuestos actúen sobre poblaciones celulares diferentes o si actuarían sobre la misma población de células madre induciendo diferentes cambios genéticos que las llevan a diferenciar en forma diferencial. Por otra parte comprobamos que en este modelo de inducción tumoral, el MPA actúa como un verdadero promotor tumoral, eliminando la posibilidad que esta hormona favorezca la aparición de las neoplasias mamarias, por un mecanismo inmunosupresor hipotético, ya que el estado inmunológico de los animales tratados con ambas sustancias estaba en valores normales e inclusive superiores a los normales. Curiosamente hemos demostrado que el MPA produce una muy fuerte inmunoestimulación, confirmando a su vez que este efecto es netamente hormonal y no un mero efecto adyuvante inespecífico ya que fue revertido por un antiprogestágeno. Por último hemos demostrado también por primera vez que el MPA y el MNU actúan como co-carcinógenos en el útero. Si bien el MPA y el MNU ambos inducen HGQ, los deciduomas sólo fueron inducidos en animales tratados con MPA en presencia o ausencia de MNU, pero en distintos protocolos en los cuales los animales han sido tratados por un tiempo con MPA se han observado algunos carcinomas de endometrio e hiperplasias epiteliales severas, no detectadas cuando los animales tuvieron un inóculo de MNU muy cercano al de MPA. También hemos demostrado que MNU induce un alto porcentaje de leucemias cuya incidencia fue mucho menor en los grupos pretratados con MPA. En resumen, este modelo experimental si bien es interesante para dilucidar las funciones del MPA en el proceso de carcinogénesis no resulta un buen modelo de cáncer de mama humano ya que las características biológicas y morfológicas de los tumores son bastante diferentes a la mayoría de lo tumores humanos.

ESTUDIOS DE LA REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL En nuestro laboratorio se demostró que el tratamiento con MPA induce adenocarcinomas de mama en hembras vírgenes BALB/c. A partir de estos tumores se originaron distintas líneas tumorales in vivo, la mayoria de las cuales dependían del MPA para su crecimiento en los animales transplantados. Respecto a la capacidad regulatoria del MPA sobre el crecimiento tumoral, los resultados obtenidos muestran que: a. En las líneas dependientes de MPA (MPA-D), esta hormona fue capaz de estimular el crecimiento tumoral, aún mucho tiempo después de que los tumores habían sido transplantados. b. La remoción de la hormona provocó la regresión de tumores ya palpables que, sin embargo, retomaron su crecimiento algunas semanas más tarde. En los pasajes subsiguientes la mayoría de estos tumores retuvieron sus receptores hormonales y su comportamiento MPA-D. c. La ovariectomía retardó, aún en presencia del MPA, el crecimiento de los tumores MPA-D, pero no afectó el crecimiento de los tumores autónomos. d. En las líneas MPA-D la P tuvo una actividad estímulatoria similar a la del MPA. e. En los animales sialoadenectomizados el MPA no perdió la capacidad de estimular el crecimiento tumoral. f. El MPA disminuyó los niveles de RP y aumentó los niveles de RE en las lineas MPA-D. A continuación se estudió la capacidad inhibitoria de los estrógenos sobre tumores MPA-D y autónomos RE+: a. Todas las dosis utilizadas de BE y de E2 inhibieron el crecimiento y produjeron la regresión de los adenocarcinomas inducidos por MPA, de los tumores primarios y de sus metástasis, aún en presencia de MPA o P. b. Las dosis más altas de BE no inhibieron el crecimiento de adenocarcinomas de mama espontáneos RE-. c. Entre un 20 y un 50 % de los tumores MPA-D se hicieron resistentes al tratamiento estrogénico. En los pasajes subsiguientes estos tumores permanecieron resistentes a estrógenos y la mayoría conservó el patrón MPA-D. ESTUDIOS DE INDUCCIÓN TUMORAL En este trabajo también se llevaron a cabo experimentos en los cuales se investigó si la ovariectomía o la sialoadenectomía afectaban la capacidad tumorigénica del MPA y si la P también era capaz de inducir tumores de mama. Los resultados mostraron que: a. El tratamiento con MPA aumenta la incidencia de tumores de mama en una cepa portadora de MMTV como C3H. b. Tanto la ovariectomía como la sialoadenectomía redujeron significativamente la capacidad tumorigénica del MPA. c. El tratamiento con P indujo tumores de mama en hembras vírgenes BALB/c. Los tumores inducidos por P fueron diferentes a los inducidos por MPA, mientras que éstos fueron mayoritariamente de histología ductal y HD, los inducidos por progesterona fueron de morfología lobulillar y HI. d. Tanto en los tumores inducidos por MPA como por P se encontró que la morfología ductal se asociaba a un crecimiento HD, mientras que la morfología lobulillar estaba asociada a un patrón de crecimiento autónomo. A partir de estos resultados se puede concluir que los progestágenos sintéticos y naturales inducen, en la cepa BALB/c, adenocarcinomas de mama ductales y lobulillares que difieren entre sí en su sensibilidad hormonal. Mientras que la mayoría de los tumores ducta- les son muy sensibles a la presencia de hormonas y factores estimulatorios e inhibitorios, los tumores lobulillares presentan un crecimiento autónomo. Dado que en las mujeres aparecen tumores mamarios con ambas morfologías, este modelo brinda la posibilidad de estudiar los eventos que determinan y regulan el crecimiento de los dos tipos de neoplasias.