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En los organismos eucariotas, la regulación de las complejas interacciones requeridas para la diferenciación y proliferación, está mediada en parte por los sistemas de fosforilación de proteínas. En Trypanosoma cruzi, se han podido caracterizar varias vías de transducción de señales a partir de la identificación y caracterización de sus distintos componentes como proteínas quinasas (PKA, PKC, Cam quinasa, CDK), adeninililciclasa (AC) y proteína G, entre otros. Dentro de la familia de las serina/treonina quinasas, recientemente ha sido identificada una nueva subfamilia de quinasas Llamadas RAC o PKB, cuya principal característica radica en la similitud de identidad que existe a nivel de su secuencia aminoacídica con PKA y PKC por igual. Estas proteínas han sido identificadas en células de mamíferos, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideum y Entamoeba histolytica pero no han sido aún detectadas en ningún tripanosomátido. Por lo tanto, nos hemos propuesto clonar el o los genes que codifican para esta nueva proteína quinasa en T. cruzi, para su posterior caracterización molecular y bioquímica y si es posible dilucidar su probable rol in vivo. Como resultado, hemos clonado el gen que codifica para una proteína quinasa RAC homóloga (PKTc), cuyo tamaño es de 1287 pb y codifica para una proteína de 428 aminoácidos. Esta proteína mostró tener entre un 60 y un 70% de homología con otras RAC quinasas. La PKTc recombinante es capaz de fosforilar a la histona IIAS, y de autofosforilarse, fosforilando específicamente residuos de treonina en ambos casos. Utiliza ATP como dador de fosfatos, requiere exclusivamente Mn²+ para su actividad, su valor de pH óptimo es entre 6-8 y su temperatura óptima es de 37°C. El Km aparente para el ATP resultó ser de 1.6 μM. La presencia de diferentes activadores (Ca²+/Cam) o inhibidores (PKI, H7, GF, staurosporina) no mostró tener un efecto significativo sobre su actividad. Experimentos de inmunolocalización utilizando anticuerpos contra la proteína recombinante, demostraron que la enzima se encuentra anclada en la membrana posiblemente, a través de ácido palmítico. Por otro lado, a través de experimentos de Western blot pudimos establecer que la PKTc está presente en los estadios de amastigote, epimastigote y tripomastigote metacíclico sin mostrar un patrón de expresión diferencial, que demuestra que esta proteína sería de carácter constitutivo. Experimentos de inmunoprecipitación nos permitirán en el futuro, identificar otras proteínas que interactúan con PKTc in vivo y dilucidar así la vía de transducción de señales en la que PKTc estaría involucrada.

La papa cultivada se encuentra relacionada con un gran número de especies del género Solanum con las que frecuentemente se cruza. Por tal motivo, las aproximadamente 200 especies silvestres que producen tuberculo, constituyen un importante reservorio de genes para distintos propósitos de mejoramiento. Las mismas se encuentran distribuidas en un amplio rango de hábitats y nichos ecológicos, constituyendo el Noroeste argentino, una gran fuente de germoplasma. Es conocido que poseen gran variabilidad tanto dentro como entre especies. La información sobre el grado de relación genética que existe entre las distintas entradas, reviste gran interés para las aplicaciones al mejoramiento genético, organización de los bancos de germoplasma. identificación de cultivares, reducción del número de entradas necesarias para que alberguen en una pequeña muestra, la mayor variabilidad genetica posible, para el mejoramiento molecular, etc. La variabilidad genetica puede medirse utilizando distintas herramientas las que incluyen datos morfológicos, citológicos, bioquímicos y moleculares. El objetivo de este trabajo es evaluar la variabilidad genética de 67 entradas silvestres y cultivadas del género Solanum, coleccionadas en el Banco de Germoplasma de EEA INTA- Balcarce, aplicando metodologías citológicas y moleculares y contrastar los resultados obtenidos con la clasificación taxonómica y su hipótesis evolutiva. Se analiza la utilidad de estas herramientas y la información generada mediante los polimorfismos de restricción correspondientes a los ADNs ribosomales. Se evaluó mediante microdensitometría, el contenido de ADN de individuos pertenecientes a 14 especies silvestres del género Solanum con el fin de detectar diferencias en el valor C. A pesar de que la mayoria de las especies no mostró diferencias significativas entre ellas (dentro de los distintos grupos de ploidías), pequeñas diferencias fueron detectadas entre algunas de ellas. S. tarijense y S. kurzianum (2.3 pg) difirieron significativamente (0,1%) de S. Spegazzini, S. vernei, S. venturii y S. commersonii (1,9 pg); y S.. megistacrobolum (2,2 pg) difirió de S. spegazzinii (1,9 pg) dentro de los citotipos diploides. Entre los tetraploides el rango fue desde 3,6 pg (S. tuberosum ssp tuberosum cv. Baraka) hasta 4,7 pg (S. tuberosum ssp andigena y S. gourlayi) hallándose diferencias significativas al 0,1%. En cuanto a la variabilidad de los genes que codifican para el ARN ribosomal, se detectaron diferentes tamaños de las subunidades completas, tanto dentro como entre especies, y aún, dentro de una misma especie; sugiriendo una alta tasa de mutaciones localizada fundamentalmente el extremo 5' del espaciador externo. La pérdida del sitio EcoRI del extremo 3'de dicho espaciador en todas las entradas de S. venturii fue característica de dicha especie. El desarrollo de las nuevas metodologías ha expandido el rango de los ensayos para detectar polimorfismos de ADN con propósitos de "fingerprinting", distancias genéticas, etc. Se han desarrollado distintos marcadores moleculares (RFLP, AFLP, SSR etc) con el fin de estudiar las relaciones genéticas y se evaluó su utilidad en varios cultivos, incluidos la papa cultivada, S. tuberosum ssp tuberosumm. En este trabajo, se ensayaron 4 combinaciones de "primers" de AFLP, 15 sondas genómicas de RFLP y 7 pares de "primers" para SSR; para un grupo de 67 genotipos diploides y poliploides que pertenecen al mismo grupo de especies silvestres y cultivadas. Se compararon las asociaciones generadas mediante todas las técnicas y se las comparó con la clasificación taxonómica tradicional. Se calcularon los indices de contenido polimórfico promedios correspondiente a cada sistema (con valores aproximados de 0,25 para RFLP, 0,32 para AFLP y 0.58 para SSR), número de polimorfismos por ensayo y también se determinaron los alelos comunes entre las entradas diploides y poliploides, incluyendo al cultivar de papa. En términos generales, las relaciones entre las especies variaron según la metodología utilizada. Se observó una gran variabilidad dentro de especies, lo que dificultó el establecimiento de las relaciones entre especies. Como se esperaba, las entradas pertenecientes a una misma especie, en general se agruparon con mayor similitud que entre especies, independientemente de la técnica utilizada. También se detectaron asociaciones de individuos concordantes con la procedencia geográfica. Promediando todos los indices de similitud obtenidos con los tres métodos. la especie que tuvo menor variabilidad fue S. venturii (0,681) y la de mayor variabilidad S. gourlayii(0,411). Los mejores valores de correlaciones entre los distintos sistemas correspondieron a AFLP y SSR, en los dos grupos de ploidías, aunque los coeficientes de correlación entre las matrices de similitud obtenidas mediante las distintas herramientas no difirieron demasiado. Los valores de correlaciones en los citotipos diploides fueron desde 0,510 (RFLP vs SSR), 0,552 (RFLP vs AFLP), 0,640 (AFLP vs SSR). Considerando todos los citotipos independientemente de la ploidía, los valores oscilaron desde 0,441 (RFLP vs SSR), 0,505 (RFLP vs AFLP) a 0,629 (AFLP vs SSR). Debido a los altos valores obtenidos en los coeficientes de correlación cofenéticos (matrices de similitud vs. matrices cofenéticas, AFLP r=0.92; SSR r=0.85; RFLP r=0.78), las asociaciones entre los individuos pueden visualizarse directamente a partir del dendrograma. Los AFLP mostraron el mejor ajuste con la clasificación taxonómica, asociando dos especies que pertenecen a la misma serie Yungasensa (S. tarijense y S. chacoense), como así también agrupando más próximo al grupo de referencia externo tomate, a las entradas pertenecientes a S. commersonii, considerada como la especie más primitiva según la hipótesis propuesta por Hawkes, 1990. Esto quizás sea debido al gran número de bandas compartidas entre el germoplasma y a la alta cobertura genómica. En el caso de RFLP, se observaron algunos individuos dispersos, sugiriendo que sería necesario evaluar un mayor número de sondas. Los SSR en general se utilizan para obtener información dentro de especies. pero no entre especies. Pudo observarse que la mayoria de los loci evaluados produjeron amplificaciones, indicando la conservación de las regiones flanqueantes. Sin embargo, el número de repeticiones, no fue muy conservado entre las distintas especies, transformándolos en inapropiados para establecer relaciones entre especies, pero si muy útiles dentro de especies. El análisis reverso de los datos, permitió la detección de bandas caracteristicas de especies y también de individuos. Casi todas las especies pudieron discriminarse con estas bandas, y muchos de los individuos mostraron bandas únicas. Se evaluaron asimismo el número de bandas novedosas respecto del cultivar Huinkul MAG, en especies como en individuos particulares, pudiendo identificarse aquellas más distantes genéticamente, que serían potencialmente interesantes para aumentar las bases genéticas de los cultivares comerciales. También se determinó es grado de homocigosis de los distintos genotipos diploides, merced al uso de los marcadores de tipo codominantes (RFLP y SSR) mostrando un mínimo de homocigosis de 26% en S. goniocalyx megistacrolobum Oka 3787.

El interes en el estudio de los herpesvirus bovino (BHV-1) se origina en su considerable importancia economica, difusióny capacidad para establecer infecciones latentes. BHV-1 corresponde al grupo 1 de los 6 caracterizados en la familia Bovidae. La infección natural de bovinos con BHV-1 ha sido asociada con afecciones respiratorias (rinotraqueitis infecciosa), genitales (IPV y balanopostitis), del sistema nervioso central (meningoencefalitis), oculares, dermicas, y entericas. A partir de 1981 varias epidemias de meningoencefalitis producidas por un herpesvims (BHV-1) se registraron en la zona central de nuestro país. El laboratorio ha acumulado datos que indican la presencia de variantes genómicas y antigénicas. El estudio incluye el desarrollo de un método diagnóstico rapido y de alta especificidad y la caracterización antigénica y proteica de BHV-1 circulantes utilizando ACMsya existentes y geles de poliacrilamida. El estudio de caracterización antigénica y proteica de cepas de campo de BHV-1 circulantes en Argentin,. Chile y Brasil se realizó con el propósito de obtener datos de la epidemiología molecular de BHV-1 en nuestro medio. Se examinaron aislamientos efectuados entre 1982 y 1990 de casos de meningoencefalitis e infecciones genitales y respiratorias. La reactividad de los anticuerpos monoclonales (ACMs) con estos virus se determinó por inmunoperoxidasa indirecta (IPI) utilizando células infectadas in vitro como sustrato antigénico, y la caracterización proteica a traves de SBS-PAGE. Los datos obtenidos indicaron que la mayoría de los aislamientos obtenidos de casos neurológicos (8/9) mostraron caracteristicas de BHV-1.3. mientras que todos los genitales poseían patrón BHV- 1.1/2 y 3 mientras que en Chile el tipo 3 no parece tmer importancia epidemiológica. Por otro lado, empleando un panel de ACMs producidos con una cepa tipo 1 de herpes bovino-1 (BHV-1.1) se determinó que, cepas aisladas de casos locales de meningoencefalitis en terneros poseían caracteristicas antigénicas diferentes a las de cepas prototipo aisladas de cuadros respiratorios. Luego de desarrollada y optimizada la IPI demostro ser una tecnica rápida, (3 hs.) útil en laboratorios sin acceso a cultivos celulares para el diagnóstico y caracterización rapida a partir de muestras de campo de BHV-1.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Patología Vegetal-IPAVE- Centro de Investigaciones Agropecuarias-CIAP-Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria-INTA-Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 225 h. con Anexos + CD. ils. col.; grafs.; tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Conocer la diversidad genética de Azotobacter en suelos de Argentina es de gran interés científico-tecnológico debido a su uso actual y futuro en la agricultura. Por otra parte, los mecanismos de promoción del crecimiento vegetal de Azotobacter aún no han sido completamente elucidados. En este trabajo se llevó a cabo el aislamiento y la caracterización genotípica y fenotípica de cepas de Azotobacter. La especie más frecuentemente aislada fue A. chroococcum, mientras que reportamos por primera vez la presencia de A. salinestris y A. armeniacus en suelos argentinos. La producción de sideróforos, la solubilización de fosfatos y la producción de auxinas se evaluaron en 21 de los aislamientos obtenidos. Todas las cepas evaluadas produjeron sideróforos y auxinas, con diferencias entre ellas en la cantidad producida de auxinas, mientras que ninguna cepa solubilizó fosfatos. Se seleccionaron 6 cepas con valores contrastantes de producción de auxinas y se determinó su capacidad de producir ácido indol-3-acético (AIA), ácido giberélico (GA3)y zeatina (Z)por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, la capacidad de fijar N2 por la reducción de acetileno-etileno y la capacidad de promover la germinación y el crecimiento temprano de plántulas de trigo. Las 6 cepas seleccionadas produjeron distintos niveles de AIA, GA3 y Z y difirieron en la capacidad de fijar N2. La mayor producción de AIA correlacionó con un mayor desarrollo de raíces seminales y pelos radicales de las plantas inoculadas, y esas respuestas fueron reproducidas por la aplicación exógena de AIA. Además, se observaron efectos positivos de la inoculación sobre el crecimiento aéreo, los cuales no pudieron ser atribuidos a la producción de auxinas. Los resultados obtenidos demuestran que las fitohormonas producidas por Azotobacter jugarían un rol muy importante en la promoción temprana del crecimiento de las plántulas de trigo

El presente trabajo de tesis se ha focalizado en el estudio del comportamiento de Bordetella bronchiseptica frente a una condición de estrés ambiental como lo es la acidez. La elección de esta temática responde a que este patógeno respiratorio, capaz de inducir un conjunto de enfermedades denominadas bordetellosis, enfrenta y sobrelleva esta condición de estrés durante su ciclo de vida. La capacidad de resistir a a condiciones de acidez podría permitir a B. bronchiseptica inducir estadíos crónicos de la enfermedad, los cuales garantizan no sólo la sobrevida del patógeno dentro del huésped sino posibilitan la continuación de la circulación del mismo dentro de una población. Este estadío de cronicidad constituye por ello un problema para la salud. La profundización de este conocimiento relacionado a la sobrevida de B. bronchiseptica en condiciones de estrés, contriburía a un mejor manejo sanitario de este patógeno, capaz de inducir enfermedades en un amplio rango de huéspedes que incluye al hombre. En este contexto, en mi trabajo de tesis doctoral he abordado los siguientes objetivos específicos: • Evaluación del crecimiento de B. bronchiseptica en diferentes condiciones de acidez. Determinación de los valores de pH límite para el crecimiento • Evaluación de la capacidad B. bronchiseptica de desarrollar una respuesta de tolerancia a la acidez (ATR). • Impacto de los fenotipos virulento y avirulento de B. bronchiseptica en el proceso de resistencia/adaptación a la condición de estrés estudiada. • Identificación de componentes proteicos asociados al proceso de resistencia/adaptación mediante espectrometría de masas del tipo UV-MALDI TOF y TOF/TOF. Análisis proteómico de expresión diferencial 2D-PAGE. • Análisis y discusión del posible rol de los marcadores de respuesta a la acidificación del medio encontrados sobre el ciclo biológico del patógeno.

Objetivo general. Abordar la caracterización molecular y funcional de un sistema binario de plásmidos crípticos involucrados en la transferencia horizontal de genes por conjugación en la bacteria fijadora de nitrógeno y simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti. Objetivos específicos. En el marco del objetivo precedente abordaremos el estudio de las funciones que hacen a la transferencia conjugativa y a la replicación del plásmido críptico modelo pSmeLPU88b de S. meliloti descripto previamente por Pistorio et al., (2003) según el siguiente esquema: - Identificación y caracterización de elementos estructurales y genes involucrados en la movilización del plásmido modelo pSmeLPU88b. - Caracterización del complejo Dtr (DNA transfer and replication). - Clonado, y caracterización de la región génica del plásmido pSmeLPU88b asociada al módulo Dtr. Búsqueda y caracterización del gen de la relaxasa y de su producto de traducción como una de las proteínas centrales de la transferencia de ADN via conjugativa. - Identificación y caracterización funcional del origen de transferencia (oriT). - Evaluación con herramientas moleculares del grado de ubicuidad de funciones de movilización (Dtr) en S. meliloti. - Identificación y caracterización de los módulos de replicación del plásmido pSmeLPU88b. - Clonado de los módulos de replicación, secuenciamiento, estudios de incompatibilidad. - Evaluación de la transmisibilidad del plásmido pSmeLPU88b en el medio suelo, en condiciones de laboratorio y de campo.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014

La sialidasa asociada a membranas Neu3 está involucrada en el catabolismo de glicoconjugados, especialmente de gangliósidos, e interviene en numerosos procesos biológicos tales como diferenciación, proliferación, migración y adhesión celular, regulando principalmente vías de transducción de señales. Dado que el mecanismo de asociación de Neu3 con membranas biológicas no se conoce, uno de los objetivos de este trabajo fue proveer más información sobre ese aspecto. Se encontró que Neu3 localiza principalmente en membrana plasmática, y también en endomembranas de compartimientos endosomales. Utilizando diferentes metodologías se demostró que el extremo C-terminal de la proteína está expuesto hacia el lado citosólico, y que otra porción de Neu3 está expuesta hacia el espacio extracelular, sugiriendo que la sialidasa posee las características de una proteína transmembrana. Sin embargo, análisis in silico y modelado molecular predijeron que la sialidasa no contiene segmentos α-hélices transmembrana en su secuencia, y que comparte la estructura de β-propeller, típica de las sialidasas virales y bacterianas. En la búsqueda de modificaciones post-traduccionales de Neu3, se encontró que la misma está S-acilada, y dado que la S-acilación está restringida al lado citosólico de las membranas, este descubrimiento apoya la idea de que la sialidasa contiene un dominio expuesto al citosol. Aunque aún queda por determinar exactamente cómo esta enzima atraviesa la bicapa lipídica, la primera parte de este estudio provee una nueva visión sobre la topología de Neu3 y se discuten algunas posibles configuraciones.Por otro lado, se estudiaron aspectos funcionales de la enzima no descriptos con anterioridad, como ser su participación en eventos endocíticos. Se observó que células que sobreexpresan Neu3 endocitan menos transferrina (Tf), un típico ejemplo de molécula que ingresa a la célula por endocitosis mediada por clatrina (CME). Dicha disminución en la endocitosis de Tf se observó también en células con reducido nivel de expresión de glicoesfingolípidos, sugiriendo que el efecto observado es independiente de la acción de Neu3 sobre gangliósidos. La disminución en la internalización de Tf, como así también de otras moléculas que ingresan por CME, pudo ser explicada debido a una distribución subcelular alterada del adaptador de clatrina AP-2, el cual se observó formando agregados en células que sobreexpresan Neu3. Por el contrario, clatrina, el fosfoinosítido PIP2 y caveolina mostraron una distribución normal. En conjunto estos resultados sugieren un rol específico de Neu3 en CME.

Gomphrena perennis es una maleza con metabolismo C4 y presencia de un sistema radicular con yemas capaces de rebrotar, lo que dificulta la siembra de cultivos estivales. Amplias zonas productivas de Argentina registran infestación con G. perennis tolerantes a glifosato. Los objetivos de la tesis fueron caracterizar morfo-anatómicamente las hojas de G. provenientes de lotes de Banderas, Santiago del Estero (Lat.28°28'00"S; Long.62°06'00"W) y de Marcos Juárez, Córdoba (Lat.32°41'00"S; Long.62°09'00"W), dos de las áreas donde la maleza constituye una importante problemática para el productor agrícola. Además, determinar si las estructuras presentes en la epidermis podrían comportarse como barreras mecánicas para la absorción y posterior traslado del herbicida, cuantificadas por la acumulación de ácido shikimico (AS) y otros parámetros metabólicos. Semillas de ambas procedencias se sembraron y se cultivaron en invernadero (INFIVE) y en intemperie. Cuando las plantas alcanzaron 4 hojas expandidas se aplicaron diferentes dosis de glifosato (0; 180; 360; 720, 1440, 2880 y 5760 g.e.ácido/ha) Se evaluó contenido de AS en raíces (R), hojas basales (HB) y hojas apicales (HA). A los 7 días post-aplicación (DPA) se midió la fotosíntesis neta (PN), transpiración (E) y conductancia estomática (CS) en plantas control (T) y tratadas con la dosis recomendada (DR:1440 g.e.a/ha). Se registró la supervivencia (S) a los 15 y 30DPA. El diseño fue aleatorizado con tres repeticiones y los datos fueron analizados por medio de la prueba de Anova (p<0,05 y p<0,01). Las dos poblaciones fueron tolerantes a glifosato, si bien la de Banderas manifestó una mayor sensibilidad a la DR del herbicida respecto a la de Córdoba. G. perennis posee baja área foliar, con ceras epicuticulares, y abundantes tricomas, los cuales se comportarían como barreras físicas reduciendo la eficacia del glifosato, lo que explicaría la tolerancia al herbicida. Banderas mostró mayor densidad de tricomas por unidad de superficie que la de Córdoba, si bien éstas últimas tuvieron mayor cantidad de drusas. La mayor susceptibilidad a la DR en Banderas se manifestó por presentar clorosis y necrosis en hojas apicales a partir de 2DPA, mientras que Córdoba manifestó esos síntomas con menor severidad y luego de mayor cantidad 7 de DPA. En ambas poblaciones se observó ruptura de dominancia apical cuando se aplicó la DR del herbicida y superiores. Esta respuesta indujo la actividad de yemas basales del xilopodio, causando rebrote y desarrollo de nuevas ramificaciones aéreas. Estas modificaciones por efecto del herbicida serían causadas por la alteración en el modelo del traslado de asimilados, cambiando los destinos hacia los órganos subterráneos. Siete DPA de la DR del herbicida se observó reducción en la PN, E y CS en ambas poblaciones. Dicha disminución fue más acentuada en Banderas evidenciando mayor sensibilidad a la aplicación del herbicida. Éstos resultados indican que el glifosato afecta los parámetros metabólicos en plantas susceptibles, si bien la DR no resulta efectiva debido al rebrote de las yemas axilares del xilopodio observado a los 15DPA. El conocimiento de la morfología y ecofisiología de esta especie, como así también la dinámica de la germinación y crecimiento de las plántulas proporcionarían las pautas necesarias para tomar las decisiones técnicas para un manejo adecuado de control.