Catálogo de publicaciones

Fil:Barañao, José Lino S.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Salceda, Susana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El splicing alternativo del precursor del RNA mensajero es una fuente extraordinaria de diversidad proteica y la regulación de este proceso es crucial para diversas funciones celulares tanto en situaciones fisiológicas como patológicas. Sin embargo, poco se sabe acerca de las señales y vías que regulan el splicing alternativo. Un modelo relevante de este proceso es provisto por la fibronectina, que contiene tres regiones de splicing alternativo conocidas como EDI, EDII y IIICS. Encontramos que diferentes factores de crecimiento estimulan la inclusión de EDI y de IIICS pero no la de EDII en el RNA maduro de la fibronectina en diferentes líneas celulares, favoreciendo isoformas de fibronectina asociadas con la proliferación, migración y remodelado de tejidos. Caracterizamos a la vía de supervivencia Ras-fosfatidilinositol 3-quinasa-AKT/Proteína quinasa B como la principal responsable de esta regulación. Mostramos que los factores de crecimiento gatillan la fosforilación de proteínas ricas en serina/arginina tales como SF2/ASF y 9G8, las cuales son importantes reguladores del splicing y probamos que AKT/Proteína quinasa B funciona como una proteína quinasa de proteínas ricas en serina/arginina. Asimismo, mostramos que los factores de crecimiento no sólo modifican el patrón de splicing alternativo de la fibronectina sino que también alteran la traducción de RNAs reporteros conteniendo una secuencia de EDI responsable de la unión de proteínas ricas en serina/arginina, sugiriendo dos niveles co-regulados de amplificación específica de isoforma. Tanto la regulación del splicing como la de la traducción en respuesta a factores de crecimiento son inhibidas por RNAs pequeños de interferencia contra SF2/ASF y 9G8. Finalmente, mostramos que SF2/ASF es capaz de regular la diversidad proteómica alterando el balance entre diferentes mecanismos de iniciación de la traducción, expandiendo aún más su ya descripto potencial para aumentar el repertorio proteico.

A pesar de la vasta información acumulada sobre la represión catabólica, poco se conoce sobre su mecanismo molecular, y las evidencias presentadas son a menudo contradictorias. El AMPc y su proteína receptora actúan como mediadores de este efecto, siendo su lugar genético de acción el promotor lactosa. Pero ciertas líneas de investigación, en distintas condiciones experimentales, llevaron a mostrar que el fenómeno de represión y el rol del AMPc en el mismo no podían explicarse totalmente por un modelo de regulación positiva. Por ejemplo, la represión catabólica persiste en mutantes de E. coli que llevan deleciones de las regiones que controlan la transcripción en el sistema lactosa (33), lo que excluye la posibilidad de una única regulación a nivel de la síntesis del mensajero. Además cuando se observa la síntesis residual de β -galactosidasa, luego de bloquear la transcripción por distintas inhibidores, la adición de glucosa produce una disminución de la síntesis (30) y el agregado de AMPc estimula la traducción del mensajero lactosa (34). En este trabajo las etapas de transcripción y traducción fueron separadas y se observó la acción producida por distintos catalolitos en esta última. Los resultados obtenidos muéstran elocuentemente que cuando ambos procesos están desacoplados, la eficiencia diferente en la traducción del mensajero lactosa depende de la fuente de carbono utilizada en dicha etapa. El método utilizado para bloquear la biosíntesis de proteínas no influye sobre este resultado, si bien como se señaló anteriormente, la concentración de clorafenicol (5 ug/ml) resultó crítico para observar la posterior producción de β-galactosidasa.

A pesar de la vasta información acumulada sobre la represión catabólica, poco se conoce sobre su mecanismo molecular, y las evidencias presentadas son a menudo contradictorias. El AMPc y su proteína receptora actúan como mediadores de este efecto, siendo su lugar genético de acción el promotor lactosa. Pero ciertas líneas de investigación, en distintas condiciones experimentales, llevaron a mostrar que el fenómeno de represión y el rol del AMPc en el mismo no podían explicarse totalmente por un modelo de regulación positiva. Por ejemplo, la represión catabólica persiste en mutantes de E. coli que llevan deleciones de las regiones que controlan la transcripción en el sistema lactosa (33), lo que excluye la posibilidad de una única regulación a nivel de la síntesis del mensajero. Además cuando se observa la síntesis residual de β -galactosidasa, luego de bloquear la transcripción por distintas inhibidores, la adición de glucosa produce una disminución de la síntesis (30) y el agregado de AMPc estimula la traducción del mensajero lactosa (34). En este trabajo las etapas de transcripción y traducción fueron separadas y se observó la acción producida por distintos catalolitos en esta última. Los resultados obtenidos muéstran elocuentemente que cuando ambos procesos están desacoplados, la eficiencia diferente en la traducción del mensajero lactosa depende de la fuente de carbono utilizada en dicha etapa. El método utilizado para bloquear la biosíntesis de proteínas no influye sobre este resultado, si bien como se señaló anteriormente, la concentración de clorafenicol (5 ug/ml) resultó crítico para observar la posterior producción de β-galactosidasa.

Trypanosoma cruzí es un parásito protozoario causante de Ia enfermedad de Chagas, cuya regulación de la expresión génica se da casi exclusivamente a nivel post-transcripcional. Los objetivos de la presente tesis fueron estudiar las regiones intergénicas y la influencia del elemento repetido SIRE en las mismas. Se determinó la presencia del elemento SIRE en regiones no codificantes del genoma del parásito . Se estableció que SIRE se asocia a una amplia variedad de genes implicados en distintos procesos metabólicos. Másaún, se determinó la relevancia que esta asociación tiene en la regulación de la expresión génica del parásito, dado que SIRE pude disminuir la estabilidad y la traductibilidad del ARNm al estar en regiones 3’ UTR, o bien aumentar la traductibilidad del ARNm al incluirse los últimos nucleótidos de SIRE en regiones 5' UTR. A su vez se estudió en profundidad las secuencias requeridas en el transsplicing y se definió la existencia de elementos reguladores del mencionado proceso y al mismo tiempo de la traductibilidad del ARNm correspondiente. Por último los resultados determinan la falta de consensos estrictos para las señales reconocidas en los primeros pasos del trans-splicing.

Di Bella, D. (2018). Regulación transcripcional de la diferenciación de las neuronas del canal central. (Tesis de posgrado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiología interna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balance interno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad de perturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando de esta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructuras celulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a una inestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener la homeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalización complejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en el ambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez del ambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichos mecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que están involucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés y diferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares es controlada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consiste en un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por los genes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un único gen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa se encuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario, tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes de carbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación a situaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. La especificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por varios factores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa y del sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción de la quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. La regulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo se buscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de las subunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificar globalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en la regulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de los niveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de los genes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menor de la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben una actividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorio negativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propios genes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, y mediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía de respuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1, interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción río abajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y su reclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de la respuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó un marcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismo fermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas que participan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar al factor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 como represor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activo mediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores de transcripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado de glucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente de carbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducción de señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente de carbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, se realizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevos reguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuente de carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías que regulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology para determinar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a las categorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo de fosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron también genes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por los promotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió como reguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cada subunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos de inositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de las subunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos de fosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a su vez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad de una regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estos procesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además en relación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulación inhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de la expresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega un rol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino de señalización cAMP-PKA.

La zona del Alto Valle de Rio Negro y Neuquén nuclea el 90% de la producción de peras y manzanas de Argentina. Las labores culturales conllevan la utilización a gran escala de diversos plaguicidas, siendo los organofosforados metilazinfos y clorpirifós los más utilizados en la última década. Sus residuos, además, han sido detectados tanto en suelo como en agua de la región, afectando a los organismos autóctonos como el sapo común Rhinella arenarum, el cual se reproduce y desarrolla en el agua durante la época de aplicación. Por presentar un desarrollo embrionario y larval acuático, un estilo de vida adulto semiacuático, una piel húmeda y sensible y huevos desprotegidos, los anfibios son considerados buenos indicadores biológicos de la salud del medio acuático. Los antecedentes de nuestro grupo de trabajo han demostrado el impacto de los plaguicidas organofosforados sobre el desarrollo de R. arenarum, sus enzimas blanco y detoxificantes, estrés oxidativo y la vía de las poliaminas. Las poliaminas son policationes alifáticos de gran importancia en procesos de desarrollo y crecimiento, y pueden interactuar con diferentes macromoléculas. Sus niveles están finamente regulados por procesos de biosíntesis, de degradación oxidativa y de transporte. En su biosíntesis participan las enzimas ornitina decarboxilasa, Sadenosilmetionina decarboxilasa, espermidina sintasa y espermina sintasa. En su degradación e interconversión oxidativa participan las enzimas espermina oxidasa, espermidina/espermina N1 -acetiltransferasa, acetilpoliamino-oxidasa y diamino oxidasa, las cuales fueron objeto de estudio en esta tesis tanto a nivel de actividad como de expresión. Las reacciones de degradación oxidativa, además, generan especies reactivas del oxígeno y aldehídos reactivos que pueden impactar sobre el sistema de defensa antioxidante. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis consistió en la búsqueda y desarrollo de herramientas moleculares para analizar la expresión de genes involucrados en los procesos mencionados y su regulación mediante factores de transcripción. Para ello, se realizaron exposiciones crónicas y agudas a los plaguicidas organofosforados metilazinfos y clorpirifós. Las exposiciones crónicas se realizaron con embriones desde fertilización hasta completar el desarrollo embrionario. En ellos se evaluaron las actividades de las enzimas degradativas de poliaminas en tres estadios embrionarios, mediante espectrofluorometría. Los tres estadios se corresponden al desarrollo temprano (estadio de brote caudal), intermedio (estadio de boca abierta) y tardío (estadio de opérculo completo) de R. arenarum. Las exposiciones agudas se llevaron a cabo con larvas de 10 días, para analizar la expresión de genes de interés mediante RT-qPCR. No fueron viables los estudios de expresión génica en embriones, debido a la alta variabilidad propia de un organismo en pleno desarrollo. Se pudo observar un incremento de las actividades de diamino oxidasa y acetilpoliamino oxidasa en embriones del estadio temprano, lo que sugiere su utilidad como biomarcadores frente a la exposición de metilazinfos y clorpirifós, respectivamente. Además, se podría decir que estas actividades enzimáticas cumplirían una función protectora frente a los plaguicidas organofosforados. El efecto de ambos plaguicidas sobre la actividad de espermina oxidasa fue evidente en embriones intermedios, y el efecto fue completamente opuesto entre ellos. Se observó un aumento significativo en las concentraciones de putrescina y espermina en embriones intermedios expuestos a metilazinfos, mientras que la exposición a clorpirifós no alteró los niveles de las poliaminas. A través de un análisis de componentes principales, fue posible inferir que los embriones expuestos a metilazinfos presentaban una respuesta proliferativa en estadios tempranos, mientras que los embriones expuestos a clorpirifós presentaban una situación de estrés oxidativo. Mientras que, en estadios tardíos de desarrollo, los embriones expuestos a metilazinfos y clorpirifós mostraron una situación de estrés oxidativo y una alteración del estado proliferativo. Dentro de los estudios moleculares, la tecnología de RNA-Seq es una herramienta altamente sensible y precisa. Esta herramienta permite secuenciar el ARN para medir la expresión génica a través del transcriptoma, en un proceso relativamente accesible desde el punto de vista económico. Resulta ser una tecnología adecuada para organismos no modelo, cuya información genómica no se encuentre disponible como en el caso de R. arenarum. Por lo tanto, el análisis del transcriptoma permitió el avance en los estudios moleculares, analizando la expresión diferencial y diseñando cebadores específicos de la especie para cuantificar la expresión génica por qPCR. Del análisis de la expresión diferencial a partir del transcriptoma de larvas de 10 días, se analizaron posibles genes de referencia y se estableció que los de menor variación son Tubulina A1, B1, B2 y B4B; actina B; gliceraldehído-3-Pdeshidrogenasa; L8; y el factor de elongacion-1 EF1A0 y EF1AG. A nivel de enzimas blanco, se determinó que la expresión de acetilcolinesterasa aumenta en larvas expuestas a plaguicidas organofosforados, al igual que el factor de transcripción c-FOS, el cual regularía su inducción. En cuanto a ornitina decarboxilasa 1A, su expresión disminuyó a las 6 h pero aumentó a las 24 h de exposición a ambos plaguicidas. La expresión de S-adenosilmetionina decarboxilasa aumentó en las larvas expuestas a ambos plaguicidas, lo que podría atribuirse a la necesidad de activar el mecanismo de apoptosis para eliminar daño celular. También estaría relacionada al aumento de la expresión del factor de transcripción eIF5A, que es activado por espermidina y participa en el fenómeno de apoptosis. En cuanto al metabolismo oxidativo de las poliaminas, la expresión de acetilpoliamino oxidasa se incrementó en larvas expuestas a plaguicidas organofosforados, mientras que la expresión de espermidina/espermina N1 - acetiltransferasa disminuyó. Espermina oxidasa mostró un ligero aumento de la expresión en larvas expuestas a clorpirifós. Finalmente, el tratamiento con plaguicidas organofosforados afectó negativamente la expresión de diamino oxidasa. Dentro de los genes analizados para las enzimas de estrés oxidativo y respuesta antioxidante, sólo se observó una inducción significativa de glutatión peroxidasa 3. El análisis de las respuestas a nivel de transcriptos de las enzimas involucradas en el metabolismo de poliaminas sugiere que la disminución de espermidina/espermina N1 -acetil transferasa podría estar relacionada al aumento en la expresión de espermina oxidasa, generando como consecuencia que la cantidad de espermina disponible para ser acetilada esté disminuida. Esto coincidiría con los niveles elevados de S-adenosilmetionina decarboxilasa. Finalmente, los niveles de expresión disminuidos de diamino oxidasa en las muestras expuestas a plaguicidas organofosforados sugieren que la cantidad de putrescina disponible para ser degradada también se encuentra disminuida, indicando que se podría estar generando espermidina como protección frente a la exposición a plaguicidas. Asimismo, a partir del transcriptoma se pudieron obtener secuencias específicas y diseñar cebadores para los genes de: catalasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa, glutatión S-transferasa-pi, glutatión reductasa, ornitina decarboxilasa, acetilpoliamino oxidasa, diamino oxidasa, espermina oxidasa, cFOS, c-JUN, NRF2, superóxido dismutasa, espermidina sintasa y JNK. Se pudieron amplificar 10 de los pares de cebadores diseñados, y se corroboraron 6 de las secuencias amplificadas (beta-actina, acetilpoliamino oxidasa, diamino oxidasa, c-FOS, c-JUN y ornitina decarboxilasa). Sin embargo, los intentos por estandarizar los cebadores de c-FOS, ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa, espermidina sintasa y diamino oxidasa no fueron positivos, ya que estos genes demostraron niveles de transcripción muy bajos en las muestras de larvas de R. arenarum. Sí fue posible analizar la expresión de beta-actina, S-adenosilmetionina decarboxilasa y superóxido dismutasa en exposiciones agudas a 0,5 mg L -1 clorpirifós, los cuales tienden a aumentar su expresión a las 12 h de exposición para luego disminuir a las 24 h. En las muestras expuestas a 1 mg L -1 de clorpirifós, se puede ver una tendencia al aumento continuo en la expresión de beta-actina y S-adenosilmetionina decarboxilasa, mientras que superóxido dismutasa permanece sin cambios. En resumen, determinamos mediante minería de datos que las exposiciones a metilazinfos y clorpirifós generan alteraciones en el metabolismo de poliaminas, en ciertos factores de transcripción y en enzimas blanco, como acetilcolinesterasa. A nivel transcriptómico se puede ver que la exposición a plaguicidas organofosforados induce la expresión de ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa y el factor de transcripción eEIF5A, mientras que espermidina/espermina N1 -acetiltransferasa y diamino oxidasa disminuyen su expresión. La inducción de ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa y S-adenosilmetionina decarboxilasa podría deberse a la necesidad de sintetizar espermidina, la cual induce la expresión del factor de transcripción eEIF5A. Por otra parte, la vía de degradación de las poliaminas genera especies reactivas del oxígeno, al igual que la exposición a plaguicidas organofosforados. Estas especies reactivas de oxígeno inducen, a su vez, la expresión del factor de transcripción c-FOS, el cual también produciría un aumento de la expresión de acetilcolinesterasa.

La zona del Alto Valle de Rio Negro y Neuquén nuclea el 90% de la producción de peras y manzanas de Argentina. Las labores culturales conllevan la utilización a gran escala de diversos plaguicidas, siendo los organofosforados metilazinfos y clorpirifós los más utilizados en la última década. Sus residuos, además, han sido detectados tanto en suelo como en agua de la región, afectando a los organismos autóctonos como el sapo común Rhinella arenarum, el cual se reproduce y desarrolla en el agua durante la época de aplicación. Por presentar un desarrollo embrionario y larval acuático, un estilo de vida adulto semiacuático, una piel húmeda y sensible y huevos desprotegidos, los anfibios son considerados buenos indicadores biológicos de la salud del medio acuático. Los antecedentes de nuestro grupo de trabajo han demostrado el impacto de los plaguicidas organofosforados sobre el desarrollo de R. arenarum, sus enzimas blanco y detoxificantes, estrés oxidativo y la vía de las poliaminas. Las poliaminas son policationes alifáticos de gran importancia en procesos de desarrollo y crecimiento, y pueden interactuar con diferentes macromoléculas. Sus niveles están finamente regulados por procesos de biosíntesis, de degradación oxidativa y de transporte. En su biosíntesis participan las enzimas ornitina decarboxilasa, Sadenosilmetionina decarboxilasa, espermidina sintasa y espermina sintasa. En su degradación e interconversión oxidativa participan las enzimas espermina oxidasa, espermidina/espermina N1 -acetiltransferasa, acetilpoliamino-oxidasa y diamino oxidasa, las cuales fueron objeto de estudio en esta tesis tanto a nivel de actividad como de expresión. Las reacciones de degradación oxidativa, además, generan especies reactivas del oxígeno y aldehídos reactivos que pueden impactar sobre el sistema de defensa antioxidante. Por lo tanto, el objetivo principal de esta tesis consistió en la búsqueda y desarrollo de herramientas moleculares para analizar la expresión de genes involucrados en los procesos mencionados y su regulación mediante factores de transcripción. Para ello, se realizaron exposiciones crónicas y agudas a los plaguicidas organofosforados metilazinfos y clorpirifós. Las exposiciones crónicas se realizaron con embriones desde fertilización hasta completar el desarrollo embrionario. En ellos se evaluaron las actividades de las enzimas degradativas de poliaminas en tres estadios embrionarios, mediante espectrofluorometría. Los tres estadios se corresponden al desarrollo temprano (estadio de brote caudal), intermedio (estadio de boca abierta) y tardío (estadio de opérculo completo) de R. arenarum. Las exposiciones agudas se llevaron a cabo con larvas de 10 días, para analizar la expresión de genes de interés mediante RT-qPCR. No fueron viables los estudios de expresión génica en embriones, debido a la alta variabilidad propia de un organismo en pleno desarrollo. Se pudo observar un incremento de las actividades de diamino oxidasa y acetilpoliamino oxidasa en embriones del estadio temprano, lo que sugiere su utilidad como biomarcadores frente a la exposición de metilazinfos y clorpirifós, respectivamente. Además, se podría decir que estas actividades enzimáticas cumplirían una función protectora frente a los plaguicidas organofosforados. El efecto de ambos plaguicidas sobre la actividad de espermina oxidasa fue evidente en embriones intermedios, y el efecto fue completamente opuesto entre ellos. Se observó un aumento significativo en las concentraciones de putrescina y espermina en embriones intermedios expuestos a metilazinfos, mientras que la exposición a clorpirifós no alteró los niveles de las poliaminas. A través de un análisis de componentes principales, fue posible inferir que los embriones expuestos a metilazinfos presentaban una respuesta proliferativa en estadios tempranos, mientras que los embriones expuestos a clorpirifós presentaban una situación de estrés oxidativo. Mientras que, en estadios tardíos de desarrollo, los embriones expuestos a metilazinfos y clorpirifós mostraron una situación de estrés oxidativo y una alteración del estado proliferativo. Dentro de los estudios moleculares, la tecnología de RNA-Seq es una herramienta altamente sensible y precisa. Esta herramienta permite secuenciar el ARN para medir la expresión génica a través del transcriptoma, en un proceso relativamente accesible desde el punto de vista económico. Resulta ser una tecnología adecuada para organismos no modelo, cuya información genómica no se encuentre disponible como en el caso de R. arenarum. Por lo tanto, el análisis del transcriptoma permitió el avance en los estudios moleculares, analizando la expresión diferencial y diseñando cebadores específicos de la especie para cuantificar la expresión génica por qPCR. Del análisis de la expresión diferencial a partir del transcriptoma de larvas de 10 días, se analizaron posibles genes de referencia y se estableció que los de menor variación son Tubulina A1, B1, B2 y B4B; actina B; gliceraldehído-3-Pdeshidrogenasa; L8; y el factor de elongacion-1 EF1A0 y EF1AG. A nivel de enzimas blanco, se determinó que la expresión de acetilcolinesterasa aumenta en larvas expuestas a plaguicidas organofosforados, al igual que el factor de transcripción c-FOS, el cual regularía su inducción. En cuanto a ornitina decarboxilasa 1A, su expresión disminuyó a las 6 h pero aumentó a las 24 h de exposición a ambos plaguicidas. La expresión de S-adenosilmetionina decarboxilasa aumentó en las larvas expuestas a ambos plaguicidas, lo que podría atribuirse a la necesidad de activar el mecanismo de apoptosis para eliminar daño celular. También estaría relacionada al aumento de la expresión del factor de transcripción eIF5A, que es activado por espermidina y participa en el fenómeno de apoptosis. En cuanto al metabolismo oxidativo de las poliaminas, la expresión de acetilpoliamino oxidasa se incrementó en larvas expuestas a plaguicidas organofosforados, mientras que la expresión de espermidina/espermina N1 - acetiltransferasa disminuyó. Espermina oxidasa mostró un ligero aumento de la expresión en larvas expuestas a clorpirifós. Finalmente, el tratamiento con plaguicidas organofosforados afectó negativamente la expresión de diamino oxidasa. Dentro de los genes analizados para las enzimas de estrés oxidativo y respuesta antioxidante, sólo se observó una inducción significativa de glutatión peroxidasa 3. El análisis de las respuestas a nivel de transcriptos de las enzimas involucradas en el metabolismo de poliaminas sugiere que la disminución de espermidina/espermina N1 -acetil transferasa podría estar relacionada al aumento en la expresión de espermina oxidasa, generando como consecuencia que la cantidad de espermina disponible para ser acetilada esté disminuida. Esto coincidiría con los niveles elevados de S-adenosilmetionina decarboxilasa. Finalmente, los niveles de expresión disminuidos de diamino oxidasa en las muestras expuestas a plaguicidas organofosforados sugieren que la cantidad de putrescina disponible para ser degradada también se encuentra disminuida, indicando que se podría estar generando espermidina como protección frente a la exposición a plaguicidas. Asimismo, a partir del transcriptoma se pudieron obtener secuencias específicas y diseñar cebadores para los genes de: catalasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa, glutatión S-transferasa-pi, glutatión reductasa, ornitina decarboxilasa, acetilpoliamino oxidasa, diamino oxidasa, espermina oxidasa, cFOS, c-JUN, NRF2, superóxido dismutasa, espermidina sintasa y JNK. Se pudieron amplificar 10 de los pares de cebadores diseñados, y se corroboraron 6 de las secuencias amplificadas (beta-actina, acetilpoliamino oxidasa, diamino oxidasa, c-FOS, c-JUN y ornitina decarboxilasa). Sin embargo, los intentos por estandarizar los cebadores de c-FOS, ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa, espermidina sintasa y diamino oxidasa no fueron positivos, ya que estos genes demostraron niveles de transcripción muy bajos en las muestras de larvas de R. arenarum. Sí fue posible analizar la expresión de beta-actina, S-adenosilmetionina decarboxilasa y superóxido dismutasa en exposiciones agudas a 0,5 mg L -1 clorpirifós, los cuales tienden a aumentar su expresión a las 12 h de exposición para luego disminuir a las 24 h. En las muestras expuestas a 1 mg L -1 de clorpirifós, se puede ver una tendencia al aumento continuo en la expresión de beta-actina y S-adenosilmetionina decarboxilasa, mientras que superóxido dismutasa permanece sin cambios. En resumen, determinamos mediante minería de datos que las exposiciones a metilazinfos y clorpirifós generan alteraciones en el metabolismo de poliaminas, en ciertos factores de transcripción y en enzimas blanco, como acetilcolinesterasa. A nivel transcriptómico se puede ver que la exposición a plaguicidas organofosforados induce la expresión de ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa, S-adenosilmetionina decarboxilasa y el factor de transcripción eEIF5A, mientras que espermidina/espermina N1 -acetiltransferasa y diamino oxidasa disminuyen su expresión. La inducción de ornitina decarboxilasa, espermina oxidasa y S-adenosilmetionina decarboxilasa podría deberse a la necesidad de sintetizar espermidina, la cual induce la expresión del factor de transcripción eEIF5A. Por otra parte, la vía de degradación de las poliaminas genera especies reactivas del oxígeno, al igual que la exposición a plaguicidas organofosforados. Estas especies reactivas de oxígeno inducen, a su vez, la expresión del factor de transcripción c-FOS, el cual también produciría un aumento de la expresión de acetilcolinesterasa.