Catálogo de publicaciones

Fil:Scavini, Luis Mario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Garberi, Juan Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El desarrollo de nuevas aplicaciones de las pectinasas depende de la búsqueda de enzimas que catalizen reacciones novedosas o que presenten propiedades diferentes a las ya estudiadas. Considerando la capacidad de A. kawachii de producir enzimas activas en condiciones de alta acidez y al escaso conocimiento de su sistema pectolítico, se inició un proyecto de investigación dirigido a estudiar las pectinasas de este microorganismo. El presente trabajo de Tesis se enmarcó en los objetivos de dicho proyecto y se relacionó con el screening de actividades enzimáticas, la purificación y caracterización de una PGasa activa sobre sustratos solubles e insolubles a valores bajos de pH (2.0-3.0) y su aplicación a la extracción enzimática de pectina y la maceración de tejidos. El trabajo se extendió a la purificación y caracterización de poligalacturonasas no-ácidas y al estudio del fenómeno de adsorción selectiva de estas PGasas a filtros de fibra de vidrio. Dicho fenómeno fué observado durante los estudios preliminares de screening y constituyó un aporte original no previamente contemplado en los objetivos iniciales del proyecto. A continuación se detalla el plan desarrollado en el presente trabajo. - Screening de enzimas pectolíticas (Capítulo 2) Cultivos de A. kawachii en medios líquidos con diferentes fuentes de carbono para el screening de enzimas. Desarrollo de un test en placa y zimograma para detectar actividad frente a RG. Caracterización preliminar de la actividad solubilizadora de pectina. - Purificación y propiedades de una poligalacturonasa ácida (Capítulo 3) Purificación de una PGasa ácida (PGI) parcialmente constitutiva producida en un medio con glucosa. Determinación de sus propiedades fisico-químicas y cinéticas, modo de acción (exo/endo), estabilidad térmica y especificidad de sustrato. - Empleo de poligalacturonasas en procesos de extracción de pectina y maceración de tejidos vegetales (Capítulo 4) Ensayos de maceración de frutas y hortalizas y extracción de pectina de pomaza de limón con la PGI de A. kawachii. Comparación de la pectina extraída enzimáticamente a pH ácido con pectinas extraídas por métodos químicos y con PGasa de A. niger. Adsorción de PGasas no-ácidas de A. kawachii a filtros de fibra de vidrio. - Purificación y propiedades de las PGasas (Capítulo 5) Estudio del fenómeno de adsorción de pectinasas a filtros de fibra de vidrio. Purificación y caracterización de las PGasas involucradas en el proceso de adsorción.

Fil:Palma, Eduardo Lucio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

l) Se purificó a homogeneidad la PEPCK del T.cruzi utilizando el siguiente procedimiento: a) ruptura de las células por tratamiento con ultrasonido. b) precipitación fraccionada con (NH4)2SO4. c) cromatografía en columna de Sephadex G-200. d) DEAE-celulosa. e) Hidroxilapatita. f) ATP-agarosa. El criterio de pureza utilizado fue la presencia de una única banda en las electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones disociantes. La purificación lograda fue de 488 veces con un rendimiento del 7.2 %. 2) El análisis de la composición de aminoácidos indicó una alta proporción de medias cisteínas y una relativamente baja de prolina en comparación con los valores obtenidos con enzimas de otros origenes. El volumen parcial específico, calculado a partir de la composición de aminoácidos fue de 0.730 cm3/g. 3) Se calcularon los parámetros hidrodinámicos y moleculares de la enzima por filtración en geles, ultracentrifugación en gradientes de sacarosa, electroforesis en condiciones disociantes y cromatoenfocado obteniéndose los siguientes valores: coeficiente de sedimentación, S20,w= 6.7 10^(-13) seg; coeficiente de difusión libre, D20,w=4.9 10^(-7) cm2seg^(-1); radio de Stokes, a= 44.56 Å y punto isoeléctrico de 7.3. El peso molecular de la enzima nativa, calculado utilizando la ecuación de Svedberg, fue de 123.000 Da, lo que coincide con el resultado obtenido con el Método de Andrews. El peso molecular de la subunidad fue de 61 kDa por lo que la enzima sería un dímero. El cociente friccional de la enzima fue de 1.36 lo que indicaría una estructura levemente asimétrica. 4) Se determinó el pH óptimo para las tres reacciones catalizadas por la enzima: carboxilación [6.55], formación de PEP [7.76] e intercambio [6.48], encontrándose que la enzima es más activa en la dirección de formación de PEP. 5) La especificidad hacia los nucleótidos varió según la reacción considerada. En las reacciones de intercambio y de formación de PEP si bien la enzima mostró actividad en todos los casos esta fue mayor con los nucleótidos púricos. En el caso de la reacción de carboxilación la enzima presentó una especificidad absoluta por ADP. No se observó inhibición significativa cuando se ensayaron los distintos nucleótidos en las reacciones de carboxilación y de formación de PEP cuando el sustrato era el nucleótido de adenina. Sin embargo, cuando el GTP era el sustrato para la reacción de formación de PEP, todos los nucleótidos presentaron un efecto inhibitorio importante. En el caso de la reacción de intercambio tanto con ATP como con GTP como sustratos la inhibición fue mayor con los nucleótidos pirimidínicos y con el nucleótido de inosina que con los de adenina y guanina. Por otra parte ni el IDP ni el ITP ejercieron efecto inhibitorio significativo sobre la reacción de carboxilación (sustrato: ADP)o la reacción de formación de PEP (sustrato: ATP) respectivamente. 6) A1 igual que la enzima aislada de otras fuentes la PEPCK presentó un requerimiento absoluto por metal divalente. En este sentido el Mn^(2)+ fue el más efectivo siguiéndole en importancia el Cd^(2)+, aunque en ese caso la concentración de metal requerida para lograr la mayor activación fue significativamente menor. La enzima presentó una cinética michaeliana al ensayarla en presencia de Mn^(2)+, Cd^(2)+ y Mg^(2)+. Tanto el Cd^(2)+ como el Mg^(2)+ ejercieron un efecto sinérgico con el Mn^(2)+ siendo los gráficos de dobles recíprocos bifásicos en ambos casos. 7) Se determinaron los parámetros cinéticos para las tres reacciones: a) Carboxilación: Km PEP= 35 uM; Km ADP-Mn= 16 uM y Km NaHCO3= 2.6 mM, Vmax= 3.2 umoles/min/mg. b) Formación de PEP: Km0A= 49 uM, KmATP-Mn= 27 uM, Vmax=31.7 umoles/min/mg. c) Intercambio: S0.5 0A : 41 uM (ATP), 41 uM (GTP) con nH= 1.6 y Km ATP-Mn= 37 uM, Vmax= 0.97 umoles/min/mg. 8) Se estudió también el efecto histerético de activación de la enzima en la mezcla de reacción durante la determinación de la actividad de carboxilación encontrándose una relación entre dicho efecto y la concentración proteica de la muestra enzimática estudiada. El efecto de histéresis desaparecia cuando la enzima se sometía a diálisis pero se recuperaba por el agregado de sales a la mezcla de reacción, siendo en ese sentido el (NH4)2SO4 el más efectivo. 9) El quinolinato, catabolito del triptofano e intermediario en la síntesis de NAD+ fue un inhibidor tanto de la actividad de intercambio como de la de carboxilación de la PEPCK aislada del T. cruzi. 10) Se estudió también el efecto de inhibidores de enzimas con grupos tioles encontrándose que la enzima es muy sensible al efecto de los mercuriales orgánicos (CMS, FMA y PCMB)y también se inhibe significativamente en presencia de O-Iodosobenzoato, NEM, Iodoacetamida y DTNB. La reversión de la inhibición con DTT indicó que esta última se debía a un efecto de los reactivos sobre los grupos tioles. ll) No se encontraron distintas formas moleculares de la enzima utilizando la cromatografía líquida rápida para proteínas. Tampoco pudieron encontrarse productos de menor tamaño provenientes del tratamiento de la enzima altamente purificada con la proteinasa cuantitativamente más importante del T.cruzi. 12) Se estudió también una actividad oxaloacético decarboxilásica asociada a la PEPCK y que posiblemente sea intrínseca de la enzima. Dicha actividad no fue modificada significativamente por los nucleósidos difosfato. Con respecto al efecto de los metales se observó una activación en presencia de Cd^(2)+ y de Mn^(2)+ pero sólo cuando la concentración de los metales era menor de 50 uM. 13) Se puso de manifiesto la presencia en epimastigotes de T. cruzi de una actividad oxaloacético decarboxilásica independiente de la PEPCK y altamente activable por Cd^(2)+. Dicha actividad se encontró en mayor proporción en extractos provenientes del tratamiento de las células por congelamiento y descongelamiento permaneciendo la mayor proporción de la actividad carboxiquinásica en el sedimento de dicho tratamiento. La cromatografía en ATP-agarosa de dicho extracto permitió una separación parcial de ambas actividades (carboxiquinásica y oxaloacético decarboxilásica dependiente de Cd^(2)+). La curva de pH para el extracto proveniente del tratamiento por congelamiento y descongelamiento mostró dos máximos para la actividad 0D (Cd2+) [5.4 y 6.65] y uno para la actividad OD en ausencia de metal [5.4].

Purificación de la enzima. Obtención del polvo cetónico de levadura: de acuerdo a la técnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza levedura de panadería (Sacharomyces Cerevisiae) producto comercial, prensado y libre de fécula. Extracción de la enzima: con solución de fosfato bipotásico 0.092 M, en frío, con agitación ocasional durante 5 días, manteniendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado de amoniaco concentrado. Coagulación por calor de proteina inactiva: se ajusta el pH del sobrenadante de le extracción a 6.3 con ácido cítrico 1 M y se calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamente y se centrifuga. Precipitación ácida: sobrenadante de la etapa anterior se le baja el pHa 4.5 mediante el agregado lento de ácido cítrico 1 M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en el precipitado que se redisuelve en solución de fosfato bipotásico 0.025 MpH 6.3. Fraccionamiento salido con sulfato de amonio: se hace mediante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio. El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68% de seturación. Precipitado se redisuelve en solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTA 1 mM, pH 7.0. Filtración a través de gel de dextranos: Sephadex G-200 en una columna de 1.5 cm. de diámetro y 18 cm de largo equilibrada con amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTAl mM, pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer. Fracciones de mayoractividad especifica se recromatografían por la misma columna en iguales condiciones. Propiedades de la enzima. 1.- Especificidad de sustrato: La enzima presenta una especificidad muy amplia hacia sus sustratos; estos pueden ser a1dehidos alifáticos o aromáticos. Entre los primeros son oxidados el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y crotonaldehido; entre los segundos el benzaldehido y anisaldehido (p-metoxibenzaldehido). No se oxidan el gliceraldehido, p-dimetilaminobenzaldehido ni el salicilaldehido. Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensayados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima dado que son inhibidores del sistema enzimático cuando éste oxida al acetaldehido. 2.- Especificidad de coenzima: la aldehido deshidrogenasa además del NAD reduce al NADP, deamNAD, APAD y APdeamAD. El deamNAD es el más activo, la velocidad de la reacción es del 88% respecto a la del testigo con NAD,la del NADP es del 33%, APdeamAD 18% y APAD 10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos por el sistema enzimático si bien pueden ser reducidos químicamente o por acción de otras deshidrogenasas. 3.- Necesidad de activadores de la enzima: la NAD aldehido deshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximo de su actividad, en ausencia de la misma, la velocidad de la reacción es sólo del 14 al 16% de la correspondiente a la presencia de cisteina l mM. Si en esas condiciones se agrega al sistema enzimático aquellos complejantes de metales que en presencia de cisteina inhiben la acción catalitica (OP, HOQ y DDC)se ve que en ausencia de la misma la activan. La adición de cisteina l mM a una preparación parcialmente activada por OP aumenta ligeramente la actividad, pero no tanto como cuando actúa sola. La activación de la enzima en función de la concentración de OP llega a un máximo, concentraciones de OP por encima de ese valor (1 mM)producen inhibición. El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación. Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogos del NAD. se obtiene que la velocidad inicial de la reacción en ausencia de activador depende de la coenzima presente en el sistema enzimático, así con APAD la reacción no se produce, con NAD y APdeam AD la velocidad de la reacción enzimática es 9 y con deanNADes de 18. Los complejantes no tienen el mismo efecto activador (comparado con la cisteina) cuando los sistemas enzimáticos a los cuales se agregen tienen distintas coenzimas así, con HOQ se tienen las siguientes velocidades: 83 (NAD),72 (deamNAD), 87 (APdeamAD) y 67 (APAD). El estudio de la cinética de activación indica que la OP actúa sobre el KNAD, aumentando la asociación de la coenzima a la enzima. 4.- inhibidores de la reacción de la NAD aldehido deshidrogenasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clases de compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, análogos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sustrato y III) compuestos cuya estructura no está relacinada ni con el sustrato ni con la coenzima, este grupo comprende: a) sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejos con metales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles. I) Análogos del NAD, derivados piridínicos y adenílicos: los componentes de la molécula del NAD,adenina, nicotinamida y sus derivados, asi como los análogos del NAD(PAD, APdeanAD, NADP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhibidores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP, ADP, ATP, PyAlAD y PyAldeamAD. NMN, pirofosfato y fosfato no modifican la velociiad de la reacción enzimática. II) Inhibición por sustrato y sustancias análogas al sustrato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (glicolaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores del mismo cuando se los agrega junto con acetaldehido. El salicilaldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido.que no son oxidados por la enzima, son inhibidores de la misma, especialmente el último de los nombrados, que cuando se agrega concentración igual a la del acetaldehido inhibe el 100% de la actividad. En cambio el gliceraldehido, que no es oxidado, tampoco es un inhibidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de estos aldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de acetaldehido, no revela un comportamiento definido. III) Compuestos cuya estructura no está relacionada ni con las coenzimas ni con el sustrato: a) Sustancias complejantes de metales: la inhibición por agentes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos con metales indica que hay un metal involucrado en la reacción catalizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina, la 8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón, el α,α´-dipiridilo y la azida sódica tienen muy poca o ninguna acción. Estudios detallados de la influencia de la OP sobre la reacción de la NAD aldehido deshidrogenasa muestran que esta sustancia produce dos tipos de inhibición, una instantánea y reversible y otra dependiente del tiempo e irreversible. También el dietilditiocarbamato produce una inibición irreversible dependiente del tiempo. No se observa lo mismo con el zincón. La inhibición irreversible por OP depende del tiempo de incubación, del grado de pureza de la preparación enzimática. cuanto más pura más sensible a la acción del inhibidor y de la temperatura de incubación, aumenta con la misma. Estudios de protección por distintas sustancias de la inhibición irreversible por OP conducen a los siguientes resultados; la cisteina. dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolina previenen completamente la acción de la OP; cianuro y EDTA son también fuertemente protectores. De la coenzima, análogos de la misma y mononucleótidos que la componen sólo el PyAlAD y el PyAldeamAD actúan como protectores, los demás o bien potencian la acción de la OP como el NAD, NADP, ADP y APAD o no ofrecen ninguna acción como la adenina. El pirofosfato es ligeramente protector. El único catión que protege totalmente la enzima de la acción de la OP es el Zn^++;el K^+; Rb^+ y Sr^++ son algo protectores. El acetaldehido aumenta ligeramente el efecto inhibidor de la OP. Estudios cinéticos de la acción de la 0P, HOQ y DDC sobre los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestran que la inhibición instantánea es competitiva con el NAD y mixta del tipo competitivo- no competitivo con el acetaldehido. La cinética es consistente con la suposición de que se forma un complejo entre el metal unido a la enzima y la OP en el que ambos están en relación 1:1. b) Hidroxilamina: la inhibición de la NAD aldehido deshidrogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NAD actúa como coenzima del sistema enzimática, es del 90% con el APAD o APdeamAD para una concentración de hidroxilamina de 10 mM. En iguales condiciones con el NAD o deamNAD la inhibición observada es sólo del 15%. El estudio cinético indica que la hidroxilamina presenta una inhibición incompetitiva respecto de las coenzimas mientras que para el acetaldehido si la coenzima es NAD o deamNADse observa una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo, casi puramente competitivo, mientras que cuando el sistema enzimática actúa con APAD la inhibición es del tipo competitivo. c) Reastivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppani y Milstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa es sensible a los reactivos de tioles (72). Se estudió el comportamiento de los complejantes de metales frente a la acción del o-iodosobenzoato y del óxido de melarsen: tanto la OP como le HOQ aumentan la sensibilidad de la enzima hacia los reactivos de tioles. También se vió qué efecto tienen los análogos y componentes del NAD cuando se los incuba en presencia de los mismos; el NAD, NADP, PyAlAD, PyAldeamAD y deamNAD actúan protegiendo a la enzima. E1 APAD y APdeamAD, sustancias que se sabe que se combinan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumentan la inhibición por los reactivos de tioles utilizados. Los mononucleótidos adenilicos AMP, ADP y ATP son protectores, aunque no tanto como el dinucleótido; el piridinico es mucho menos eficaz.

Fil:Busconi, Liliana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas a homogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación de las isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevada a homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio es purificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa, filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas en presencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformas frente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzar el clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreó una biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar, en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteína recombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para la enzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparada cinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.

Los inhibidores de proteasas de naturaleza proteica son importantes moléculas reguladoras que inhiben la acción de enzimas proteolíticas y se encuentran extensamente distribuidos en diferentes tejidos de animales, plantas y microorganismos. En su gran mayoría, los inhibidores de proteasas presentes en la naturaleza son proteicos, con la excepción de pequeños inhibidores de microorganismos. Estas moléculas han demostrado su acción en el tratamiento de diferentes patologías en las cuales la desregulación en la acción de las proteasas puede conducir a desequilibrios fisiológicos que llevan a la muerte celular. El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo el estudio de nuevas miniproteínas inhibidoras de carboxipeptidasas de tipo “cystine knot” a partir de extractos de tubérculos de Solanum tuberosum grupo andígenum variedada Churqueña. Para este propósito se aplicaron una diversidad de técnicas tales como la espectrometría de masas, biología molecular, expresión recombinante de proteínas, ensayos enzimáticos y caracterización del plegamiento oxidativo. Dentro de estas técnicas, la espectrometría de masas ha sido de gran importancia en este trabajo la cual fue de utilidad en la identificación, caracterización y validación de las moléculas estudiadas. El trabajo se encuentra dividido en tres capítulos a través de los cuales se presentan los resultados obtenidos. En el primer capítulo se describe el estudio y caracterización de un extracto crudo de tubérculos de papa andina determinando su actividad inhibitoria frente a proteasas de diferente tipo mecanístico. Se estudió la estabilidad térmica de los inhibidores de carboxipeptidasas presentes en el extracto y se determinaron los pesos moleculares de las proteínas resistentes a este tratamiento térmico mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Además, se utilizó una técnica proteómica, denominada Intensity Fading MALDI-TOF, mediante la cual se verificó la interacción de moléculas presentes en el extracto con carboxipeptidasa A. Por último, se purificó una molécula que produce inhibición de carboxipeptidasa A mediante cromatografía de afinidad y se realizó un análisis de la huella peptídica o PMF (Peptide Mass Fingerprinting) para su identificación de su secuencia primaria en bases de datos. En el segundo capítulo se presenta el estudio de dos miniproteínas con potencial actividad inhibitoria de carboxipeptidasas. Para llevarlo a cabo, ambas proteínas se expresaron de forma recombinante, se determinó su actividad inhibitoria y se realizaron estudios de plegamiento oxidativo. Además se presentan en este capítulo, modelos estructurales de una de las miniproteínas expresadas utilizando herramientas bioinformáticas. En el tercer capítulo, se aisló desde un brote de tubérculo de Churqueña el ARNm de un tercer inhibidor de carboxipeptidasa. En este capítulo, se muestran los resultados de la expresión recombinante y purificación de este inhibidor, y se presenta su actividad inhibitoria frente a carboxipeptidasas A y B. Asimismo, se describe la identificación de la proteína nativa en el extracto de papa mediante técnicas proteómicas como PMF-MALDI-TOF MS y secuenciación de novo PMF-MALDI-TOF-TOF/MS/MS.

Fil:Fraidenraich y Waisman, Diego. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.