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Purificación, caracterización, clonado y expresión de malato dehidrogenasas del helminto parásito Echinococcus granulosus
Fernán Gonzalo Agüero Juan José Cazzulo
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas a homogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación de las isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevada a homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio es purificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa, filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas en presencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformas frente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzar el clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreó una biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar, en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteína recombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para la enzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparada cinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
ECHINOCOCCUS GRANULOSUS; MALATO DEHIDROGENASA; MDH; METABOLISMO INTERMEDIARIO; MALATE DEHYDROGENASE; INTERMEDIARY METABOLISM
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 2001 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
2001
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