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Purificación y propiedades de la NAD aldehído deshidrogenasa de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae)
Martha Norma Schwarcz Andrés Oscar Manuel Stoppani
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Purificación de la enzima. Obtención del polvo cetónico de levadura: de acuerdo a la técnica modificada por Stoppani y Milstein (8). Se utiliza levedura de panadería (Sacharomyces Cerevisiae) producto comercial, prensado y libre de fécula. Extracción de la enzima: con solución de fosfato bipotásico 0.092 M, en frío, con agitación ocasional durante 5 días, manteniendo el pH siempre superior a 6.6 mediante el agregado de amoniaco concentrado. Coagulación por calor de proteina inactiva: se ajusta el pH del sobrenadante de le extracción a 6.3 con ácido cítrico 1 M y se calienta a 55°C durante 15 minutos; se enfría rápidamente y se centrifuga. Precipitación ácida: sobrenadante de la etapa anterior se le baja el pHa 4.5 mediante el agregado lento de ácido cítrico 1 M, agitando continuamente y en frio. Actividad queda en el precipitado que se redisuelve en solución de fosfato bipotásico 0.025 MpH 6.3. Fraccionamiento salido con sulfato de amonio: se hace mediante el agregado de solución saturada de sulfato de amonio. El grueso de la actividad cae en el corte entre 45 y 68% de seturación. Precipitado se redisuelve en solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTA 1 mM, pH 7.0. Filtración a través de gel de dextranos: Sephadex G-200 en una columna de 1.5 cm. de diámetro y 18 cm de largo equilibrada con amortiguador de fosfato de potasio 0.5 M, cloruro de potasio 0.5 M, EDTAl mM, pH 7.0. Se eluye con el mismo buffer. Fracciones de mayoractividad especifica se recromatografían por la misma columna en iguales condiciones. Propiedades de la enzima. 1.- Especificidad de sustrato: La enzima presenta una especificidad muy amplia hacia sus sustratos; estos pueden ser a1dehidos alifáticos o aromáticos. Entre los primeros son oxidados el glicolaldehido, propionaldehido, butiraldehido y crotonaldehido; entre los segundos el benzaldehido y anisaldehido (p-metoxibenzaldehido). No se oxidan el gliceraldehido, p-dimetilaminobenzaldehido ni el salicilaldehido. Excepto el gliceraldehido, todos los demás aldehidos ensayados, aún los que no tienen actividad, se unen a la enzima dado que son inhibidores del sistema enzimático cuando éste oxida al acetaldehido. 2.- Especificidad de coenzima: la aldehido deshidrogenasa además del NAD reduce al NADP, deamNAD, APAD y APdeamAD. El deamNAD es el más activo, la velocidad de la reacción es del 88% respecto a la del testigo con NAD,la del NADP es del 33%, APdeamAD 18% y APAD 10%. PyAlAD y PyAldeamAD no son reducidos por el sistema enzimático si bien pueden ser reducidos químicamente o por acción de otras deshidrogenasas. 3.- Necesidad de activadores de la enzima: la NAD aldehido deshidrogenasa necesita cisteina para alcanzar el máximo de su actividad, en ausencia de la misma, la velocidad de la reacción es sólo del 14 al 16% de la correspondiente a la presencia de cisteina l mM. Si en esas condiciones se agrega al sistema enzimático aquellos complejantes de metales que en presencia de cisteina inhiben la acción catalitica (OP, HOQ y DDC)se ve que en ausencia de la misma la activan. La adición de cisteina l mM a una preparación parcialmente activada por OP aumenta ligeramente la actividad, pero no tanto como cuando actúa sola. La activación de la enzima en función de la concentración de OP llega a un máximo, concentraciones de OP por encima de ese valor (1 mM)producen inhibición. El cupferrón que no es inhibidor tampoco produce activación. Cuando se cambia el aceptador de hidrógeno por análogos del NAD. se obtiene que la velocidad inicial de la reacción en ausencia de activador depende de la coenzima presente en el sistema enzimático, así con APAD la reacción no se produce, con NAD y APdeam AD la velocidad de la reacción enzimática es 9 y con deanNADes de 18. Los complejantes no tienen el mismo efecto activador (comparado con la cisteina) cuando los sistemas enzimáticos a los cuales se agregen tienen distintas coenzimas así, con HOQ se tienen las siguientes velocidades: 83 (NAD),72 (deamNAD), 87 (APdeamAD) y 67 (APAD). El estudio de la cinética de activación indica que la OP actúa sobre el KNAD, aumentando la asociación de la coenzima a la enzima. 4.- inhibidores de la reacción de la NAD aldehido deshidrogenasa de levadura: La enzima es inhibida por distintas clases de compuestos, los que se pueden agrupar en: I) coenzima, análogos y derivados del mismo, II) sustratos y análogos del sustrato y III) compuestos cuya estructura no está relacinada ni con el sustrato ni con la coenzima, este grupo comprende: a) sustancias orgánicas e inorgánicas capaces de formar complejos con metales, b) hidroxilamina, c) reactivos de tioles. I) Análogos del NAD, derivados piridínicos y adenílicos: los componentes de la molécula del NAD,adenina, nicotinamida y sus derivados, asi como los análogos del NAD(PAD, APdeanAD, NADP)inhiben la reacción enzimática. Se comportan como inhibidores competitivos la adenina, nicotinamida, piridina, AMP, ADP, ATP, PyAlAD y PyAldeamAD. NMN, pirofosfato y fosfato no modifican la velociiad de la reacción enzimática. II) Inhibición por sustrato y sustancias análogas al sustrato: los aldehidos oxidados por el sistema enzimático (glicolaldehido, benzaldehido y anisaldehido) son inhibidores del mismo cuando se los agrega junto con acetaldehido. El salicilaldehido y el p-dimetilaminobenzaldehido.que no son oxidados por la enzima, son inhibidores de la misma, especialmente el último de los nombrados, que cuando se agrega concentración igual a la del acetaldehido inhibe el 100% de la actividad. En cambio el gliceraldehido, que no es oxidado, tampoco es un inhibidor de la enzima. El estudio cinético de la acción de estos aldehidos sobre el sistema enzimático, en presencia de acetaldehido, no revela un comportamiento definido. III) Compuestos cuya estructura no está relacionada ni con las coenzimas ni con el sustrato: a) Sustancias complejantes de metales: la inhibición por agentes orgánicos e inorgánicos capaces de formar complejos con metales indica que hay un metal involucrado en la reacción catalizada por la enzima. Son inhibidores la l,lO-fenantrolina, la 8-hidroxiquinolina y el dietil-ditiocarbamato; el cupferrón, el α,α´-dipiridilo y la azida sódica tienen muy poca o ninguna acción. Estudios detallados de la influencia de la OP sobre la reacción de la NAD aldehido deshidrogenasa muestran que esta sustancia produce dos tipos de inhibición, una instantánea y reversible y otra dependiente del tiempo e irreversible. También el dietilditiocarbamato produce una inibición irreversible dependiente del tiempo. No se observa lo mismo con el zincón. La inhibición irreversible por OP depende del tiempo de incubación, del grado de pureza de la preparación enzimática. cuanto más pura más sensible a la acción del inhibidor y de la temperatura de incubación, aumenta con la misma. Estudios de protección por distintas sustancias de la inhibición irreversible por OP conducen a los siguientes resultados; la cisteina. dietilditiocarbamato y 8-hidroxiquinolina previenen completamente la acción de la OP; cianuro y EDTA son también fuertemente protectores. De la coenzima, análogos de la misma y mononucleótidos que la componen sólo el PyAlAD y el PyAldeamAD actúan como protectores, los demás o bien potencian la acción de la OP como el NAD, NADP, ADP y APAD o no ofrecen ninguna acción como la adenina. El pirofosfato es ligeramente protector. El único catión que protege totalmente la enzima de la acción de la OP es el Zn^++;el K^+; Rb^+ y Sr^++ son algo protectores. El acetaldehido aumenta ligeramente el efecto inhibidor de la OP. Estudios cinéticos de la acción de la 0P, HOQ y DDC sobre los complejos enzima-coenzima y enzima-sustrato muestran que la inhibición instantánea es competitiva con el NAD y mixta del tipo competitivo- no competitivo con el acetaldehido. La cinética es consistente con la suposición de que se forma un complejo entre el metal unido a la enzima y la OP en el que ambos están en relación 1:1. b) Hidroxilamina: la inhibición de la NAD aldehido deshidrogenasa por hidroxilamina depende de qué análogo del NAD actúa como coenzima del sistema enzimática, es del 90% con el APAD o APdeamAD para una concentración de hidroxilamina de 10 mM. En iguales condiciones con el NAD o deamNAD la inhibición observada es sólo del 15%. El estudio cinético indica que la hidroxilamina presenta una inhibición incompetitiva respecto de las coenzimas mientras que para el acetaldehido si la coenzima es NAD o deamNADse observa una inhibición mixta del tipo competitivo-no competitivo, casi puramente competitivo, mientras que cuando el sistema enzimática actúa con APAD la inhibición es del tipo competitivo. c) Reastivos de tioles: en un trabajo anterior Stoppani y Milstein encontraron que la NADaldehido deshidrogenasa es sensible a los reactivos de tioles (72). Se estudió el comportamiento de los complejantes de metales frente a la acción del o-iodosobenzoato y del óxido de melarsen: tanto la OP como le HOQ aumentan la sensibilidad de la enzima hacia los reactivos de tioles. También se vió qué efecto tienen los análogos y componentes del NAD cuando se los incuba en presencia de los mismos; el NAD, NADP, PyAlAD, PyAldeamAD y deamNAD actúan protegiendo a la enzima. E1 APAD y APdeamAD, sustancias que se sabe que se combinan con la enzima, no sólo no la protegen sino que aumentan la inhibición por los reactivos de tioles utilizados. Los mononucleótidos adenilicos AMP, ADP y ATP son protectores, aunque no tanto como el dinucleótido; el piridinico es mucho menos eficaz.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1964 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1964
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