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El presente trabajo tuvo por finalidad investigar los posibles efectos mutagénicos y antimutagénicos de dos variedades de Ilex (Ilex paraguariensis var. paraguariensis e Ilex dumosa var. dumosa) empleadas corrientemente en la elaboración de infusiones utilizando ensayos de mutagenicidad in vitro (Ensayo de Salmonella microsoma) e in vivo (Test de Micronúcleo). Se trabajó con Ilex paraguariensis St Hil. var. paraguariensis e Ilex dumosa Reissek var. dumosa, ejemplares frescos provenientes de la Estación Experimental del INTA Cerro Azul (Misiones). Se prepararon extractos acuosos a partir de la infusión empleando 5g de hojas secas trituradas de Ilex en 70 ml de agua a 80ºC. Se filtraron y llevaron a volumen de 100 ml. Luego se liofilizaron y se conservaron congelados hasta el momento del ensayo. Para la obtención de los extractos orgánicos se partió de 120 g de hojas secas trituradas de ambas plantas y se realizaron extracciones sucesivas con cloroformo. El polvo remanente fue sometido a extracciones sucesivas con acetona. Luego los extractos secos se conservaron congelados hasta el momento del ensayo. Los extractos acuosos se solubilizaron en agua destilada y los orgánicos en dimetilsulfóxido (DMSO), solvente compatible con el ensayo de mutagenicidad. La investigación de la mutagenicidad y antimutagenicidad de los extractos se realizó según el procedimiento descripto por Maron y Ames (1983) con preincubación, utilizando cepas de Salmonella typhimurium TA98 (sensible a mutágenos que cambian el marco de lectura) y TA100 (sensible a mutágenos que producen sustituciones de pares de bases). Estas cepas han demostrado ser las de mayor sensibilidad para sustancias químicas. El ensayo se realizó con y sin activación metabólica, cofactores y solución reguladora.

Las infecciones entéricas que derivan en enfermedades diarreicas representan uno de los principales problemas de la salud mundial. En los países del tercer mundo, ocurren por lo menos mil millones de casos por año, resultando en 5 a 10 millones de muertes. Muchas de estas infecciones son transmitidas por alimentos contaminados, dentro de las cuales esta la salmonelosis. El género Salmonella comprende a bacilos gram-negativos anaeróbicos facultativos, agentes etiológicos de diferentes enfermedades referidas colectivamente como salmonelosis. La salmonelosis representa un importante problema de salud en todas partes del mundo. A diferencia de lo que ocurre en humanos no se dispone de una vacuna comercial contra Salmonella para uso animal. Las mutantes bacterianas termosensibles (ts), en su crecimiento son una herramienta promisoria para la producción de vacunas vivas contra enfermedades bacterianas. La atenuación de estas cepas se basa en la característica de las mutantes de poder replicarse a bajas temperaturas (26°C/ 28°C) pero de cesar su duplicación a la temperatura corporal (37°C). La sensibilidad a la temperatura como método de atenuación ofrecería la ventaja sobre otras atenuaciones de ser aplicable, en principio, para cualquier patógeno de mamíferos. En este trabajo se obtuvieron mutantes ts de diferentes fenotipos. Las mutantes analizadas en los estudios in vivo presentaron características bien diferenciables, en cuanto a sus propiedadaes inmunogénicas y en cuanto a sus patrones de permanencia en el huésped. La administración de los microorganismos por la vía i.g., incrementó el grado de colonización así como la permanencia de las distintas cepas ts. Sin embargo la distribución de las diferentes mutantes en los distintos órganos del huéped fue similar para las dos vías de inoculación ensayadas. La cepa ts que confirió una protección adecuada al ser administrada por la vía i.g. fue capaz de colonizar tanto las PP como el bazo, en cambio las otras dos cepas ts se las detectó en PP o en el bazo solamente. La inmunización i.g., tanto con la cepa protectiva E/l/3 como con la mutante C/2/2, que no otorgó una inmunidad protectiva adecuada, indujeron IgA en intestino. Solamente la cepa E/1/3 indujo niveles significativos de IgM circulante los que se hallaron al día 21 postinmunización. Las dos mutantes produjeron una respuesta IgG específica circulante, cuyos niveles aumentaron con el tiempo detectándose los niveles más altos en el día 21, resultando mayores en los animales inmunizados con la mutante E/l/3. La inmunización i. g. con la mutante E/1/3 indujo una respuesta celular de memoria, que se evidenció por la proliferación celular in vitro frente al antígeno específico. Al inmunizar los animales con la cepa C/2/2, la células tanto de ganglio mesentérico como de bazo presentaron índices de estimulación que no fueron diferentes cuando se enfrentaron con el antígeno específico con respecto a otro antígeno no relacionado. En presencia del antígeno específico, los sobrenadantes de las células provenientes de animales inmunizados con E/1/3 presentaron altos niveles de IFN-t (>4100 pg/ml), comparados con los de los animales controles (200-500 pg/ml). Tanto en los estudios de inmunización sistémica, p.o., o i.g. la mutante E/1/3 confirió la protección más adecuada, por este motivo es que se seleccionó a esta cepa como posible cepa vacuna. Se incorporó una segunda mutación atenuada al genoma de la cepas E/1/3L y E/1/3. Al analizar la atenuación de la cepa doble mutante, se vió que la alta inocuidad presentada por la cepa ts E/l/3, se siguió conservando al incorporarle una segunda mutación al genoma. El índice de reversión de las dos mutaciones en forma conjunta, resultó menor a 10-10), niveles tan bajos de reversión propiciarían a esta cepa para ser utilizada como vacuna en animales de consumo.

La enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) es un regulador global de la expresión de genes en bacterias. En estudios previos, las mutantes dam de Salmonella Typhimurium han sido postuladas como excelentes cepas vacunales por su atenuación y su capacidad protectiva. Por extensión, la mutación en el gen dam se ha propuesto como método de atenuación para una gran variedad de especies bacterianas. Dado nuestro interés en el estudio y prevención de las infecciones por Salmonella Enteritidis (serovariedad que con mayor frecuencia causa enterocolitis en humanos) generamos mutantes dam de dicha serovariedad, mediante mutagénesis por transposición y por mutagénesis dirigida por reemplazo. Curiosamente, los estudios en ratones Balb/c mostraron que las mutantes dam de S. Enteritidis, son sólo moderadas en su atenuación, ya que un 30 % de los animales inoculados por la vía intragástrica con la mutante muere dentro de las 3 semanas. Por otro lado, la protección de los animales inmunizados, contra el desafío con la cepa virulenta de Salmonella Enteritidis #5694, no alcanzó niveles aceptables. Dado el papel crítico que los macrófagos desempeñan en la inmunidad innata contra Salmonella, analizamos la interacción entre la mutante SEΔdam y la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Mediante ensayos de Western blot pudo determinarse que la expresión de moléculas proinflamatorias en los macrófagos infectados con SEΔdam está atenuada. Como en parte, la activación de la respuesta inflamatoria del macrófago se genera a través de antígenos bacterianos, nos preguntamos si la carencia de Dam podría estar afectando la estructura o función de ciertas proteínas efectoras o del lipopolisacárido (LPS) de Salmonella Enteritidis. Estudiamos entonces la participación de la proteína Dam sobre la síntesis y secreción de dos proteínas efectoras dependientes del Sistema de Secreción Tipo Tres (SSTT-1). A este fin debieron construirse y caracterizarse mutantes dam de Salmonella portadoras de genes sopA y sopB marcados con el epítope FLAG. Los resultados obtenidos mostraron que la mutante dam posee una reducida expresión y secreción de las proteínas de invasión SopA y SopB, dependientes de la isla de patogenicidad 1 de Salmonella (SPI- 1). Este hallazgo indica que la metilación por Dam participa en la regulación de la síntesis y secreción de SopA y SopB en Salmonella como un activador de estos genes. Investigamos también la participación de la enzima Dam en la síntesis del LPS de S. Enteritidis. Encontramos que la mutante SEΔdam sintetiza LPS con un antígeno polisacárido O de cadenas más cortas que el de la cepa parental. Dado que Wzz es responsable en la distribución del largo de cadena del antígeno O, analizamos si la metilación por Dam está involucrada en la regulación de la expresión del gen wzz. El análisis densitométrico de Western Blot con muestras de extractos proteicos mostró que la cantidad relativa de proteína Wzz producida por SEΔdam, es tres veces menor que la producida por la cepa parental. Concomitantemente, la actividad del promotor de wzz en SEΔdam medida con fusión transcripcional cromosómica con un gen reportero y la cantidad de ARNm medido por RT-PCR cuantitativa a tiempo real se vieron reducidas. También se redujo la expresión de los genes pmrA y rcsB (dos reguladores de wzz) en la mutante dam. Sin embargo, el defecto de SEΔdam en la distribución del largo de cadena del antígeno O, sólo se asoció con RcsB. Nuestros resultados demuestran que la metilación por Dam regula la síntesis del LPS en Salmonella. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la metilación por Dam en Salmonella regula funciones relacionadas íntimamente con la interacción huésped-bacteria. Por lo tanto, la deleción del gen dam como método de atenuación en cepas vacunales debe ser analizada críticamente.