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La Enfermedad de Alzheimer es la forma más frecuente de demencia en la adultez. Su prevalencia se encuentra en franco aumento a nivel mundial, y dada la ausencia de un tratamiento eficiente se proyecta como uno de los grandes desafíos en el campo de la salud con injerencia social y económica para las sociedades modernas. Se caracteriza por la presencia de depósitos extracelulares de péptidos amiloides en el parenquima cerebral y agregados intraneuronales de proteína Tau hiperfosforilada. Además, se hace evidente un cuadro de neuroinflamación crónica, desregulación de la autofagia neuronal y daño vascular. En este sentido, el estudio integrado de neuronas, células gliales y vasculares ?constituyentes de la unidad neurovascular- ha cobrado relevancia en los últimos años. En esta Tesis se planteó como principal objetivo estudiar el rol de las células microgliales, astrogliales y endoteliales ?así como la interacción entre ellas- durante la instalación del cuadro neuroinflamatorio en etapas tempranas de la patología. Asimismo, se evaluó en etapas avanzadas si el sistema degradativo por autofagia se encontraba afectado en estas células no-neuronales. Para ello se empleó la cepa de ratones transgénicos PDAPP-J20, modelo animal ampliamente validado en la bibliografía, y modelos in vitro de la patología empleando los tipos celulares mencionados.En etapas tempranas de la enfermedad ?antes de la presencia de depósitos amiloides- los ratones PDAPP-J20 presentan activación en la microglía y astroglia en el hipocampo. Sin embargo, la vasculatura no evidencia alteraciones ni en su morfología ni en su densidad. En etapas avanzadas, en cambio, la vasculatura cerebral presenta signos de atrofia y eventos detectables de daño vascular. Las células de la microglía y astroglía exhiben una evidente hipertrofia de su soma en la cercanía a placas amiloides, lo cual se asocia en parte a la acumulación de proteínas involucradas en el proceso de autofagia. En este sentido, en este trabajo de Tesis aporta evidencia original acerca del flujo autofagico en las células astrogliales en la cercanía de placas amiloides. Las células de la microglía, por su parte, presentan un impedimento en el flujo autofágico durante la estimulación crónica con péptidos amiloides fibrilizados y en el hipocampo de ratones PDAPP-J20.Por otro lado, la comunicación entre células astrogliales y endoteliales se vió afectada por el proceso de envejecimiento en este modelo animal. Los estudios realizados en sistemas in vitro demostraron que las células endoteliales son capaces de responder directamente a péptidos amiloides, pero también indirectamente a través de factores solubles liberados por microglía y astroglía que actuarían a través del receptor de moléculas asociadas al daño RAGE. Finalmente, el análisis por espectrometría de masa de la fracción proteica obtenida a partir de una muestra enriquecida en microvasculatura cerebral evidenció que los sistemas de metabolismo de ARN (principalmente la traducción y el splicing) se encuentran especialmente alterados en células vasculares durante etapas avanzadas de la patología.En su conjunto, estos resultados sugieren que hay claros indicios de instalación de un cuadro neuroinflamatorio en una etapa temprana de la patología, que contribuye a la progresiva disfuncion de la Unidad Neurovascular. En etapas avanzadas, alteraciones en la autofagia astroglial y microglial así como en los sistemas metabólicos básicos de las células endoteliales sugieren un cuadro de pérdida de homeostasis que probablemente promueva la exacerbación del proceso patológico.

Fil:Fló Diaz, Juan. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015.

Ratones transgénicos (knock-in, KI) con mutaciones del canal de calcio P/Q fueron utilizados como modelos murinos de Migraña Hemipléjica Familiar tipo I. Se estudiaron mediante técnicas de patch-clamp (whole cell) las corrientes de calcio presinápticas (IpCa) en los terminales nerviosos gigantes del caliz de Held y las corrientes postsinápticas en las neuronas que este inerva. En los KI S218L se observo la activación de las IpCa hacia potenciales más hiperpolarizados y una reducción de la amplitud de la corriente de calcio siendo esto ultimo dependiente de la duración de la repolarizacion del potencial de acción. A pesar de la reducción de las IpCa las corrientes postsinápticas evocadas están incrementadas así como la frecuencia pero no la amplitud de las espontaneas indicando la existencia de un ingreso continuo de calcio al terminal presinápticos, posible generador de cambios en la maquinaria de liberación responsable de la ganancia de función observada. La droga antiepiléptica pregabalina estudiada sobre ratones normales mostró ser efectiva en disminuir la liberación evocada a través de la reducción de la amplitud de las IpCa y de la remoción de su inactivación. La mayor tasa de inactivación observada en el KI R192Q fue absolutamente removida por la pregabalina.

En un trabajo anterior Parodi (1) determinó el fósforo inorgánioo y orgánico presente en el liquido alantoideo de huevoe de gallina embrionados, inoculados con virus de influenze tipo A y encontró un descenso significativo de le fosfocreatina y del fósforo total. El presente trabajo continua esos estudios determinando fósforo inorgánico de fosfocreatia, ATP y ácido soluble total, en músculo de ratones blancos inoculadoe con virus de influenza, cepa Formosa. Materiales y Métodos. Animales: Se usaron ratones blancos adultos. Un lote se inoculó ip. con 0,2 m1 de líquido alantoideo normal y otro con 0.2 m1 de líquido alantoideo infectado con virus de influenza, cepa Formosa, cuyo título hemoaglutinante era 1:1280¡ un tercer lote se inoculó con 0.2 ml de una mezcle de virus y antisuero totalmente neutralizada segun pruebes de infectividad en embriones. Estos animales se sacrificaron a las 24, 48 y 72 hs. luego de la inoculación anestesiándolos oon pentotal y sumergiéndolos luego en una mezcla de nieve carbónica-éter. Mientras estaban congelados se les extrajo músculo que se pesó en una balanza de torsión y luego se trató con Cl3CCOOH Al 5% en Frío. Se filtró por un tubo de Barber y sobre este liquido libre de proteÍnas se hicieron lee siguientes determinaciones de fósforo. Determinación del fósforo: a) Fósforo inorgánico: Se llevó a cabo según el método de Lowry y Lopez (2) b) Fósforo de fosfocreatina: se dejó el filtrado libre de proteínas durante l bora a temperatura ambiente y sobre una parte alícuota se determinó fósforo según el método de Fiske-Subbarow (3). c) Fósforo de ATP: igual que el anterior pero se hizo previamente una hidrólisis de 10 minutos a 100°C en HCl 1N. d)Fósforo ácido soluble total: igual que el anterior pero ee hidrolizó 3 hs. a 100°C en ClH 1N. Determinación del glucógeno muscular: Se trató un trozo de músculo de ratones obtenidos como anteriormente con KOH al 30% en caliente, luego se precipitó glucógeno con l,l volumen de alcohol absoluto, se determinó y luego se hidrolizó en medio ácido. Se determinó glucosa según el método de Valverde (4). Obtención del antisuero específico: Se inoculó un conejo adulto por vía intramuscular con 0,5 mL de líquido alantoideo infectado con virus de influenzc más 1 m1 de adjuvante de Freund. Se lo sangró por punción cardíaca a los 15 dias y se obtuvo el suero. Determinación de infectividad en músculo: Se tomó una porción del músculo de le pata de ratones inoculados con virus de influenza, se maceró con caldo con antibiótico. (penicilina y estreptomicina), se centrifugó y se usó el sobrenadante. Este se inoculó en diluciones 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10.^-4, 10^-5 en cavidad alantoidea de embriones de pollo de 11 días de incubación. Los embriones se mantuvieron 24 hores a 37°C y luego se mataron por frío y se extrajo liquido alantoides, con el que se realizó una reacción de hemoaglutinación. Resultados: En la Tabla I se presentan los promedios,las desviaciones standard, y los valoren de t (para el ensayo t) para las determinaciones de ésteres fosforados. *Ver tabla en tesis* A las 24, 48 y 72 horas de la inoculación se observa un descenso significativo de la fosfocreatina, ATP y fósforo total. Esto no ocurre en los animales controles. Los valores de glucógeno muscular se dan en la Tabla II. *Ver tabla en tesis* No se observan variaciones en el contenido del glucógeno muscular de los ratones infectados. Los extractos de músculo de los ratones infectados con virus que fueron inoculados en embriones de pollo no demostraron poseer ninguna actividad infecciosa. Discución El virus de influenza provoca cambios metabólicos en los huespedes en los cuales desarrolla. En huevoss de gallina embrionadas se han encontrado variaciones en el volumen del líquido alantoideo, de su pH, del peso de la membrana corioalantoidea y de la glicólisis anaerobia de la membrana corioalantoidea. Unade las alteraciones más importantes es la detención de su desarrollo, fenómeno que se ha relacionado con el metabolismo del fósforo y sus ésteres, eapecialmente de la fosfocreatina y del ATP. Pappalardo (6) encuentra un aumento en 1a cantidad total de creatinina y creatina en el líquido alantoideo de embriones infectados. Parodi observa una notable disminución de la rostecreatina en los embriones infectados que comienza a las 4 hs., se acentúa a las 7 hs. y vuelve a sun valores normales a las 24 hs. luego de la inoculación. Tambien observa un descenso del fósforo inorgánico y del fósforo ácido soluble total. En este trabajo se trató de observar si existían alteraciones similares en ratones infectados intraperitonealmente con el virus de influenza. Se ha encontrado un descenso significativo del fósforo proveniente de la fosfocreatina y del ATP,así comodel fósforo ácido soluble total. Los valores hallados en ratones inoculados con liquido alantoideo no infectado no muestran variaciones con respecto a los normales, salvo en un caso (a las 48 hs. el fósforo del ATP aumenta) al cual no lo atribuimos significado. Las determinacionos de virus infeccioso en el músculo del animal infectado han dado resultado negativo; tampoco co ha encontrado variación en los valores del glucógeno muscular aunque éstos oscilan, en todos los casos, dentro de limites muy amplios. Siendo la fosfocreatina la fuente de fosfatos para la resíntesis del ATP una disminución en los valoren de ambos hace pensar en la inhibición del proceso de síntesis de la primera que se reflejaría también en los valores del segundo. Un efecto análogo se encuentra en los músculos "envenenados" con iodoacetato en los cuales desaparece la fosfocreatina, aunque se encuentra un aumento del fósforo inorgánico y de la creatina. Este efecto se atribuyo a la inhibición de la gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa y al bloque de la resíntesis del ATP a partir del ATP. Dado que en el músculo no se encuentra virus infecciosos se puede pensar que éste ejerce una acción tóxica que se manifiesta de esta manera. Dicha acción podría deberse a la partícula en si o bien a alguna subunidad derivada de ella. Es conocida la toxicidad que tiene el virus de influenza. Hasta hace poco se pensaba que dicha toxicidad se debia a 1a partícula completa, pero en un reciente trabajo Kato y Okada han desintogrado el virus por ultrasonido y han encontrado que a pesar de la perdida de infectividad, la toxicidad no disminuye y en algunos casos aumenta. Sugieren que la acción tóxica se debería a una proteina o lipoproteína fuertemente adherida a la hemoaglutinina, aunque parte de ella permanece unida al antígeno. Una observación semejante de acción tóxica quo provoca un descenso de la fosfocreatina es el hallado por Pinchot y Blocv al inocular toxina diftérica en ratas por vía subcutánea. De todas maneras, las experiencias anteriores indican que la noción tóxica es neutralizada por el antisuero específico. En cambio en este trabajo no se consiguió neutralizar el descenso del fósforo por la inyección simultánea del virus y del antisuero neutralizente, salvo en el caso del fósforo total. Esto podria explicarse si el descenso del fósforo se debiera a subunidades derivadas de la partícula viral y contra las cuales no hubiera anticuerpos en el conejo, a pesar de que el virus se descompone en unidades menores al infectar las células o tejidos. Por otra parte se debe tener en cuente uns posible acción debida al interferon. Se sabe que las células normales a las cuales se les agrega interferon aumentan su consumo de 02 así como su producción de ac. láctico, pero el proceso de glicólisis queda desconectado de la producción de ATP, pensándose que la falta de este último es un factor importante en la acción del interferon frente a los virus, dado que ellos precisan del ATP para sus procesos sintéticos. Podemos pensar entonces que nuestros descensos del ATP y fosfocreatina pueden ser causados por la acción del interferon que fabricaría el animal el ser inoculado o por su presencia en el líquido alantoideo infectante. Conclusiones: 1.- Se hicieron determinaciones del fósforo inorgánico, del de fosfocreatina, ATP y ácido soluble total en ratones blancos inoculados con virus de influenza y en controles inoculados con líquido alantoideo normal. 2.- Se observó un descenso significativo en la fosfocreatina, ATP y fósforo total. 3.- Se discuten los resultados obtenidos y se propone su interpretación.

Se evidenció que a partir de la activación nuclear hepática del tetracloruro de carbono (CCl4) se forman radicales libres triclorometilo (*CCl3). Los radicales *CC13 y los CCl3O2* derivados de la reacción de los primeros con el oxígeno, promueven reacciones de adición y de abstracción de H desde los lípidos nucleares. Las reacciones de adición son más intensas con los *CCl3 ; mientras que las de abstracción de H son promovidas más fuertemente por los CCl302*. Los *CCl3 se adicionan preferentemente a los ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos (PUFA) de la membrana perinuclear. Los CCl3O2* y los *CCl3 abstraen hidrógenos de los PUFA (especialmente ac. araquidónico) e inician procesos de peroxidación de lípidos de la membrana perinuclear que conducen a la formación de aldehídos reactivos (ej. malondialdehído). También abstraen H del colesterol de la membrana perinuclear formando productos de oxidación y cetoderivados del mismo. Por estudio comparativo en dos cepas de ratas con distinta susceptibdidad a sufrir cáncer hepático por efecto del CCl4, se deduce que la intensidad de producción de los radicales *CCl3 en las cercanías del ADN y la unión covalente de los mismos a fosfolípidos específicos, colesterol y ésteres de colesterol podrían tener relación con la susceptibilidad a sufiir los efectos carcinogénicos ejercidos por el CCl4. En resumen: Los resultados evidencian que durante la biotransformación nuclear hepática del CCl4 se forman radicales libres *CCl3 y CCl302*. Dichos radicales interactúan con los lípidos de la membrana perinuclear y generan productos potencialmente capaces de reaccionar o regular la función del ADN y/o las proteínas nucleares, con consecuencias potencialmente graves a nivel celular.

El objetivo del presente trabajo fue analizar los efectos de la quimioterapia sobre la cavidad bucal en pacientes con diagnóstico de carcinoma de colon y mama a través de evaluaciones sialoquímicas e índices de salud bucal en etapas inicial, intermedia y final. El tratamiento con 5-FU+LV disminuyó el flujo basal y estimulado y el pH, con incremento de Na+, K+ y urea basal en etapa intermedia. Los índices de salud bucal se deterioraron en etapa intermedia revirtiendo en etapa final, salvo la profundidad de sondaje, que se mantuvo al finalizar el tratamiento. El tratamiento de carcinoma de mama no alteró el flujo basal. Con AC disminuyó la secreción estimulada recuperándose al finalizar. El tratamiento con AC y FAC acidificó la saliva basal e incrementó el Cl- ; DD sólo disminuyó la concentración de PO4-3. La respuesta inflamatoria aumentó en los diferentes esquemas; sólo revirtió en AC. La profundidad de sondaje mostró efectos similares al grupo tratado con 5-FU+LV. En ratas, se evaluó el efecto de 5-FU + LV sobre parámetros sistémicos y glandulares en a) ratas C b) ratas con AA c) ratas tratadas con 5-FU d) ratas tratadas con 5-FU + LV. Los tres grupos disminuyeron el peso corporal con relación a C; la disminución del peso glandular fue mayor en 5-FU+LV que en dieta apareada al igual que el flujo salival estimulado y la concentración de Ca+2y PO4-3. El tratamiento con citostáticos alteró: índices hematológicos, consumo de glucógeno y la respuesta secretoria.

Numerosas patologías hepáticas poseen un componente oxidativo como parte de su mecanismo de daño tisular. El estrés oxidativo eleva los niveles citosólicos de Ca2+ y puede, potencialmente, activar una serie de eventos de señalización induciendo cambios morfológicos y funcionales que conducen, en última instancia, a la muerte celular. La comprensión de estos procesos es de suma importancia, ya que puede promover el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas con capacidad para prevenir, o mejor aún, revertir los daños al tejido hepático inducidos por estrés oxidativo. En este trabajo de tesis, se demostró la participación de proteína quinasa C (PKC) dependiente de Ca2+ en la disfunción biliar, y en la desorganización del citoesqueleto de actina y de las uniones estrechas, inducidos por el pro-oxidante modelo tert-butil hidroperóxido (tBOOH), utilizando el modelo de duplas aisladas de hepatocitos de rata. tBOOH (100 μM, 15 min) elevó los niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS), indicado por el aumento en la lipoperoxidación (+186%, p < 0,05) y la producción ROS-dependiente de 2´,7´-diclorofluoresceína (+36%, p < 0,05). A su vez, generó un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ (+100%, p < 0,05), y estimuló la translocación a membrana de la isoforma dependiente de Ca2+ de PKC PKCα como parámetro de su activación (+79%, p < 0,05). También, se observó una reducción en el número de duplas capaces de acumular y de retener (aprox. -50% en ambos parámetros, p < 0,05) en su vacuola canalicular el análogo fluorescente de sal biliar colil-lisil fluoresceína (CLF). Estos eventos se acompañaron de internalización de la bomba exportadora de sales biliares Bsep, redistribución de la proteína asociada a uniones estrechas ZO-1, desorganización de F-actina y formación de protrusiones de membrana (+285%, p < 0,01), este último un marcador precoz del daño estructural al citoesqueleto. Todos estos eventos fueron completamente prevenidos por el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA/AM (20 μM), los inhibidores panespecíficos de PKC H7 (100 μM) y SP (10 μM), el inhibidor de isoformas de PKC dependientes de Ca2+ Gö6976 (2 μM) y el activador de PKA DB-AMPc (500 μM); PKA frecuentemente contrarregula los efectos de PKC. Por otro lado, una dosis mayor de tBOOH (500 μM, 15 min) indujo despolarización mitocondrial (aprox. +80%, p < 0,01), fenómeno asociado a la apertura de poros de transición de permeabilidad (PTPM), y aumento en la producción de ROS de origen mitocondrial (+1000% en los niveles de lipoperoxidación, p < 0,01). Estos eventos fueron prevenidos (aprox. –30%, p < 0,05) por el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA/AM (50 μM), por los inhibidores de CaM W7 (100 μM) o trifluoperazina (TFP, 10 μM) y por el inhibidor de CaMKII KN-62 (10 μM); el nivel de prevención alcanzado fue similar al obtenido con el bloqueante de PTPM CsA (5 μM), indicando que la exacerbación del daño hepatocelular oxidativo, vía formación de PTPM, se encuentra mediada por la vía citosólica de señalización Ca2+-CaM-CaMKII. En conclusión, estos resultados indican que los ROS pueden ejercer efectos deletéreos en el hepatocito activando cascadas de transducción de señal, y no sólo actuando como efectores directos del daño oxidativo

Luego de las lesiones de la médula espinal los pacientes experimentan déficits cognitivos relacionados con funciones hipocampales. En este sentido, el objetivo general de esta Tesis es estudiar las bases neurobiológicas responsables de dichos déficits. Para cumplirlo desarrollamos un modelo de lesión espinal parcial por compresión en ratas y ratones que permite evaluar el estado cognitivo de los animales lesionados, ya que estos tienen la misma actividad locomotora que los animales Sham pero severos problemas en la coordinación de sus pasos. Los resultados demostraron que luego de 60 días de la injuria espinal los animales presentaron déficits en la memoria de reconocimiento y en la memoria de trabajo espacial. Estos déficits coinciden con una disminución del número de neuronas del hileo, de CA1 y de la capa granular. También se observó una disminución de la neurogénesis tanto en la etapa aguda como en la crónica. En la fase aguda encontramos una disminución del número de progenitoras neurales amplificadas (ANP) mientras que en la etapa crónica se observó una disminución de la taza de proliferación de las células madres neurales (RGL) y de los ANP. Las alteraciones neuronales observadas en la etapa crónica coincidieron con alteraciones en la respuesta de las poblaciones de células gliales. De hecho en la etapa crónica, aumentó el número de astrocitos reactivos en ratas y ratones. Además, se produjo en ratas un incremento de las células microgliales activas, aumentando la expresión del ARNm de TNFα e IL-1β y disminuyendo el porcentaje de células microgliales del fenotipo M2 (anti-inflamatorio). En la etapa aguda, si bien el número de astrocitos reactivos y células de la microglía aumentaron, no se incrementaron los niveles del ARNm para TNFα e IL-1β. Con respecto a los mecanismos por los cuales la lesión espinal genera estas alteraciones hipocampales exploramos el rol de los glucocorticoides (GC) y de la degeneración transneuronal de los axones seccionados. En cuanto a los GC describimos que los animales sólo tuvieron altos niveles plasmáticos en la etapa aguda alcanzando valores similares a animales intactos en la etapa crónica. Mediante dos abordajes experimentales diferentes se bloqueó la acción de los GC en la etapa aguda y se estudió en la etapa crónica el proceso de neurogénesis y el desempeño cognitivo. Los resultados mostraron que la neurogénesis fue parcialmente restaurada, sin embargo los déficits cognitivos persistieron. Por otro lado, realizamos una hemisección de la médula espinal mediante la cual sólo los haces del funículo ventrolateral, que en su mayoría decusan, fueron dañados y medimos la neurogénesis 60 días después en el hipocampo ipsilateral y contralateral a la lesión. Observamos que la neurogénesis del lado contralateral a la lesión disminuyó con respecto al lado ipsilateral, involucrando a la degeneración transneuronal en esta disminución. El desarrollo de este trabajo sugiere que las alteraciones hipocampales descriptas en las neuronas maduras, en la neurogénesis y en el ambiente glial podrían explicar los déficits cognitivos observados en los roedores y en los pacientes. Los resultados sugieren que la lesión espinal podría generar un ambiente inflamatorio en la etapa crónica que conduzca eventualmente a la neurodegeneración hipocampal. Con respecto a los mecanismos subyacentes comenzamos estudiando la disminución de la neurogénesis y demostramos que los GC generados en la etapa aguda en parte fueron responsables de la disminución del proceso en la etapa crónica. También observamos que otro factor involucrado en la disminución de la neurogénesis en la etapa crónica fue la degeneración transneuronal. Este trabajo es pionero en el estudio de la encefalopatía luego de la lesión espinal y abre nuevas perspectivas que permiten la comprensión integral de la fisiopatología del paciente con lesión medular.