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La enzima nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa) es ubicua y cataliza la síntesis de NTPs a partir de sus correspondientes NDPs y un NTP dador (fisiológicamente el ATP). La reacción sigue una cinética de ping-pong con la formación del intermediario de alta energía (P)NDP quinasa. Aparte de su rol fundamental en la síntesis de NTPs, se ha relacionado a esta enzima con a) la activación de proteínas G en la transducción de señales, b) la diferenciación de Drosophila y distintas líneas celulares, c) inhibición de metástasis (nm23), y recientemente ha sido identificada como d) un factor de transcripción. En el presente trabajo se presentan resultados de la purificación y caracterización de la NDP quinasa de Candida albicans, un hongo patógeno oportunista de vertebrados. Se caracterizó la enzima bioquímicamente, en cuanto a su tamaño, al número de subunidades, su punto isoeléctrico, su estabilidad térmica, y la posibilidad de usar distintos NTPs y NDPs como dadores y aceptores de la reacción. A través de dos enfoques experimentales diferentes se demostró que los nucleótidos de guanina y adenina son los mejores aceptores de la reacción (Arch). Biochem. Biophys. (1995), 187-194). Se evaluó a su vez, la capacidad de NDP quinasas de distinto origen de fosforilar a análogos de nucleótidos utilizados en terapias antivirales; para ello, se desarrolló la metodología para medir la actividad NDP quinasa con estos sustratos (J. Biol. Chem. (1996), 271, en prensa). Se estudió la actividad y la presencia de la enzima durante el crecimiento y la morfogénesis del hongo; la actividad específica máxima se encontró durante el crecimiento logarítmico (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Se realizó un estudio detallado del proceso de autofosforilación de la NDP quinasa, y se encontró que sólo se encuentra autofosforilada en residuos de histidina. La autofosforilación de la enzima también se realizó en extractos crudos de C. albicans y de Escherichia coli. Dado que la NDP quinasa se autofosforila en residuos de histidina como parte de su mecanismo de acción, los ensayos para estudiar la posible regulación de la enzima por fosforilación a través de alguna quinasa necesitan de una metodología que pueda distinguir la fosforilación en histidina de aquella en serina o treonina. Se desarrolló entonces una metodología sobre membranas de Immobilon con el uso de buffers de pH 1 y 14 con el agregado de 5 por ciento metano. Esta metodología se utilizó para estudiar la fosforilación in vivo en C. albicans y en células HeLa en cultivo. Se discuten las posibles implicancias de la fosforilación en serina in vivo.

Si bien las enzimas proteolíticas se hallan presentes en todas las células, en los organismos multicelulares de mayor complejidad suelen no tener una distribución uniforme y con frecuencia algunos tejidos y órganos las contienen en elevada concentración. Dadas las múltiples aplicaciones industriales de este tipo de enzimas, la detección de nuevas fuentes de proteasas a partir de recursos naturales renovables sigue siendo un tema de gran atractivo dentro del campo de la Química de Productos Naturales. En esta línea de razonamiento, la selección de nuevos materiales dentro de las plantas superiores tuvo que basarse necesariamente tanto en la información fitoquímica preexistente como en los aportes que la Fisiología y la Bioquímica Vegetales han realizado en cuanto a las funciones biológicas que desempeñan o se les atribuyen a las peptidasas en las células que las contienen y en los organismos de los que forman parte. Aún cuando el número de especies estudiadas con el propósito antes mencionado sigue siendo muy reducido (bastante menos del 1% de las especies conocidas), los datos de los que se dispone brindan una razonable orientación en cuanto a materiales vegetales que pueden resultar fuente promisoria de nuevas peptidasas. Si bien no en todos los casos, el contenido de los tubos laticíferos suele ser rico en este tipo de sustancias, a tal punto que la mayoría de las fitopeptidasas conocidas provienen de especies pertenecientes a familias caracterizadas por producir látex: Asclepiadaceae, Apocynaceae, Caricaceae, Euphorbiaceae y Moraceae, entre otras. Por otra parte, así como la presencia de látex no garantiza la existencia de enzimas proteolíticas, su ausencia tampoco descarta la posibilidad de hallarlas en especies pertenecientes a familias “no laticíferas”, como lo demuestra su hallazgo en Asteraceae, Bromeliaceae, Cucurbitaceae y Fabaceae, por citar los casos más conocidos. Parece más allá de toda duda que el desarrollo de la capacidad de producción de peptidasas en alta concentración tiene claras implicancias evolutivas. En el caso de la familia Bromeliaceae dicha capacidad parece estar restringida a sólo una de las tres subfamilias que la componen: las Bromelioideae, hecho en el que basamos nuestra hipótesis de trabajo al seleccionar los frutos de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (n.v. “ihvirá”, “falso ananá”) como material de estudio de nuevas fuentes de fitopeptidasas. Una vez seleccionado el material y comprobada que fue la presencia de enzimas proteolíticas, resultó necesario establecer el procedimiento de extracción que permitiera obtener la mayor cantidad de proteína activa y al mismo tiempo preservar la integridad funcional de la misma, de modo de disponer de suficiente material de estudio y, además, que el mismo fuera representativo del estado en el que se encontraban las peptidasas en su localización original en la planta. Dado que las enzimas proteolíticas son utilizadas en distintos procesos industriales y teniendo en cuenta que en estos casos se recurre a preparaciones prácticamente no purificadas, también se consideró esencial contar con información sobre el comportamiento de estas últimas. En función de ello se decidió verificar el efecto del pH y de la fuerza iónica sobre la actividad proteolítica, así como la estabilidad de la enzima parcialmente purificada en distintas condiciones de pH y de temperatura. El paso siguiente consistió en diseñar una estrategia de purificación que permitiera separar las principales proteínas responsables de la actividad proteolítica de la muestra, necesaria para la posterior caracterización bioquímica y estructural de las mismas. En la elección de la metodología de purificación se procuró en lo posible que la misma resultara factible de ser escalada, teniendo en cuenta que las enzimas purificadas tienen alto valor agregado. La etapa final en el conocimiento de este tipo de biomoléculas es su caracterización, que además de las condiciones óptimas de acción implican el conocimiento de su masa molecular y del punto isoeléctrico, de sus características cinéticas y de su secuencia aminoacídica, estableciendo en este último caso la pertinente comparación con las estructuras de otras proteasas, a efectos de determinar el grado de homología que presenta en relación con las mismas, tanto por las implicancias filogenéticas como por el aporte que puede ofrecer al esclarecimiento de la especificidad de sustrato.

Jacaratia dodecaphylla (Vell.) A.DC. es un árbol de la familia de las Caricáceas, de la selva subtropical misionera. El fruto se usa en medicina popular como laxativo suave e indoloro. Los frutos contienen látex y solo son comestibles cuando estan muy maduros. Un extracto con un buffer fosfato de fuerza iónica moderada del mesocarpio del fruto analizado por SDS- PAGE y teñido con Azul Brillante, mostró 11 bandas proteínicas, y una banda no resuelta que migra con el frente. Ocho de estas proteínas estaban glicosiladas. Variaciones en el procedimiento de extracción y en la fuerza iónica del buffer, permitió la separación de dos extractos con un número de bandas diferente, ambos con actividad proteolítica, nominados fracciones A y B, la fracción B contenía tres proteínas de P.M. 29,5kDa, 26,0 kDa , 23,0 kDa y P.\. de las tres sobre 9. Electroforesis en Rocket de la fracción B mostró precipitinas con anticuerpos de quimopapaína y papaína. Infiltración al vacio con agua del tejido durante 5 minutos seguido de centrifigación a baja velocidad para la recuperación del lavado extracelular, permitió la extracción selectiva de cuatro proteínas. Filtración en gel de Sephadex G-75 permitió la purificación de una proteína con un peso molecular analizado por cromatografía de exclusión molecular de 35,2 kDa, por SDS-PADE de 34 kDa y un punto isoelectrico sobre 9. Activadores de las tiol proteasas aumentaron la actividad proteolítica de la enzyma y su actividad fue inhibida por los inhibidores de las mismas, lo que indica que la enzima es una peptidasa cisteínica. La enzima fue muy efectiva para hidrolizar sustratos naturales. Mostró un pico de actividad en condiciones alcalinas y a 65°C. En su estructura no se detectaron carbohidratos. Ensayos de antibiogramas mostraron acción inhibitoria sobre el crecimiento de hifas de Colleotrichum gloeosporioides Y C/adosporium herbaum, caraterizando la enzima como una peptidasa cisteínica extracelular de defensa.

Objetivos del trabajo: - Aislar, purificar y caracterizar las peptidasas presentes en frutos de Bromelia hieronymi Mez, planta que crece espontáneamente en nuestro país. - Contar con nuevas fuentes de enzimas proteolíticas que eventualmente reemplacen a las preparaciones comerciales importadas que actualmente se usan en diversos procesos biotecnológicos. - Ensayar esta preparación enzimática en la elaboración de quesos. - Obtener cDNA de peptidasas a partir del RNA total del fruto. - Clonar y secuenciar los cDNA correspondientes a peptidasas cisteínicas.

En la búsqueda de una especie vegetal que resultara buena productora de proteasas, utilizando como criterios selectivos la biomasa disponible, la accesibilidad de su obtención y la posibilidad de su aprovechamiento industrial, se realizaron ensayos preliminares en especies pertenecientes a taxones promisorios en este sentido. Finalmente se seleccionaron los frutos de Maclura pomífera (Raf.) Schneid. (Moraceae) para estudiar las proteasas presentes en el látex que contienen los mismos. Una vez elegido el material vegetal, se elaboró la estrategia experimental que permitiera conseguir los siguientes objetivos: a) Establecer la relación entre el grado de madurez de los frutos, la producción de látex y el contenido de proteasas de los mismos. b) Obtener preparaciones enzimáticas crudas y determinar las condiciones óptimas para su conservación. c) Caracterizar las preparaciones crudas en cuanto al efecto del pH, la temperatura, la fuerza iónica y el agregado de activadores c inhibidores, así como conocer su estabilidad durante lapsos variables en diferentes condiciones de pH y temperatura y ensayar la actividad protcolítica frente a diferentes sustratos naturales y sintéticos. d) Someter las preparaciones a un proceso de purificación que permita obtener una o más fracciones de elevada actividad específica con alto grado de rendimiento. e) Caracterizar las fracciones así purificadas.

A pesar de que la fuente tradicional de enzimas coagulantes de la leche para la fabricación de quesos ha sido el estómago de mamíferos lactantes, motivos económicos, nutricionales, culturales, religiosos y/o de disponibilidad de estómagos han hecho necesaria la búsqueda de sustitutos de origen vegetal, fúngico y bacteriano para la elaboración de quesos. Respecto a las enzimas de origen vegetal, sólo un reducido número de peptidasas han sido aisladas, caracterizadas y purificadas a partir de las plantas superiores. En este sentido es necesario destacar que sólo el uno por mil de las especies conocidas se han analizado con respecto a su contenido y perfil de peptidasas. En plantas que crecen en nuestro país se han aislado y caracterizado peptidasas serínicas y cisteínicas en algunas especies de Asclepiadaceae, Bromeliaceae y Moraceae. En cuanto a las peptidasas aspárticas, sólo se ha estudiado una enzima producida por discos de papa sometidos a estrés abiótico, no existiendo otros antecedentes de estudios sobre fitoproteasas aspárticas y ninguno sobre enzimas de plantas que coagulen la leche. En este trabajo de tesis se propone estudiar las peptidasas que poseen acción coagulante de la leche y que se encuentran presentes en Cynara scolymus L. (alcaucil, alcachofa), tanto en la planta cultivada a campo como en cultivos in vitro. Para lograr este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos parciales: Estudiar la actividad proteinolítica y coagulante de la leche de los extractos crudos de las diferentes partes del alcaucil. Caracterizar la preparación enzimática cruda que presente las mejores condiciones caseinolíticas, de acuerdo a los resultados del ítem anterior. Purificar dicho extracto crudo y caracterizar las fracciones purificadas. Inducir la expresión in vitro de peptidasas coagulantes de la leche de Cynara scolymus L. mediante el agregado de diferentes reguladores de crecimiento. Realizar estudios comparativos entre las peptidasas coagulantes de la leche obtenidas de las plantas crecidas a campo y de las provenientes de cultivos in vitro. Elaborar y evaluar quesos con las enzimas estudiadas.

Fil:Santa Coloma, Tomás Antonio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El picudo del algodonero, Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae), es considerado una de las plagas más importantes de algodón en América, presente en Argentina desde 1993. El objetivo general del trabajo fue seleccionar aislamientos nativos de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Hypocreales) virulentos para el picudo del algodonero. Para ello se obtuvieron aislamientos nativos provenientes de muestras de suelo e insectos, así como cepas pertenecientes a la micoteca del Laboratorio de Hongos Entomopatógenos (IMYZA, INTA). Se evaluó la patogenicidad y virulencia de 28 aislamientos de M. anisopliae y 66 aislamientos de B. bassiana sobre adultos de picudo y se estudiaron los efectos subletales sobre la alimentación y oviposición producidos por estos hongos. Por otro lado, fueron evaluadas distintas características de los aislamientos seleccionados, como la compatibilidad con los insecticidas químicos utilizados en campo, el efecto conjunto de los insecticidas químicos y los aislamientos sobre la plaga, y la tolerancia a altas temperaturas de los aislamientos. Finalmente, se evaluaron parámetros de producción masiva de conidios de los aislamientos seleccionados y se realizaron evaluaciones en campo de las formulaciones experimentales. Los aislamientos de M. anisopliae (Ma 50 y Ma 20) resultaron los más virulentos donde la concentración letal media fue 1,13 x 10*7 y 1,20 x 10*7 conidios/ml, respectivamente. Además, se encontró una disminución en la alimentación de las hembras infectadas con los aislamientos Ma20 y Bb23, y una disminución de la oviposición con Ma 20. Por otro lado, los aislamientos de M. anisopliae evaluados fueron compatibles con los insecticidas piretroides y más tolerantes a temperaturas altas. Los resultados obtenidos indican la posibilidad de utilizar M. anisopliae como agente de control microbiano incluyéndolo en un programa de Manejo Integrado del Picudo del Algodonero.