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Tesis para obtener el grado de Máster en Biotecnología de Plantas, de la Universidad Internacional de Andalucía, en 2011

Fil:Wieder, Carolina María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Se evaluaron los efectos de los antagonistas spiperona (dopaminérgico) y Cheraxnaloxone (encefalinérgico) sobre el crecimiento ovárico de quadricarinatus (Decapoda, Parastacidae), en diferentes períodos del ciclo reproductivo, tanto mediante ensayos in vitro como vivo. La incubación in vitro de piezas de ovario junto con ganglio torácico (sitio de producción de la hormona estimuladora gonadal, GSH), mas el agregado de cada antagonista mencionado, consiguió potenciar la síntesis proteica en ovario durante el período posreproductivo, sugiriendo una fuerte inhibición de las encefalinas endógenas sobre la secreción de GSH. Este resultados fue corroborado mediante ensayos in vivo, administrando los antagonistas incorporados al alimento; durante el periodo posreproductivo, el naloxone, mostró ser el inductor mas efectivo, al producir un aumento significativo tanto del índice gonadosomático como del diámetro oocitario. Por otra parte, se verificó la producción efectiva de hembras ovígeras, así como la viabilidad normal de los juveniles eclosionados de hembras tratadas con los antagonistas. Estos resultados constituyen una potencial herramienta en acuicultura, al permitir modificar el calendario reproductivo natural de una especie de alto valor comercial.

En este trabajo de tesis abordamos el estudio de la función corticotrofa normal y tumoral focalizándonos en tres temas fundamentales: a) los eventos moleculares involucrados en la regulación de los factores de transcripción Nur y sus consecuencias en la activación del gen de proopiomelanocortina (POMC) por la hormona liberadora de corticotrofina (CRH) y AMP cíclico (cAMP), b) la implicancia de los factores Nur en la regulación corticotrofa por interleuquina-1 (IL-1) y c) la de interacción entre IL-1,CRH y glucocorticoides. Demostramos en células corticotrofas AtT20 que la entrada por canales de calcio tipo L es esencial para la inducción de los mRNAs de Nur77 y Nurr1 y la estimulación de la actividad Nur por CRH a través de la actividad de CAMKII. La entrada de calcio es suficiente para producir la estimulación. El tratamiento con cAMP estimula Nur77 también independientemente del calcio entrante. Existe una vía de MAPK (Rap1/B-Raf/MEK1,2/ERK1,2) funcional en corticotrofos que estimula la fosforilación y actividad transcripcional de Nur77 y que es activada por CRH y cAMP en forma calcio-dependiente y calcio-independiente. La regulación por estas vías de señalización sobre la actividad Nur correlaciona con la regulación sobre el promotor de POMC. Demostramos también que Nur77 media la acción estimulatoria de IL-1 sobre el promotor de POMC: IL-1 estimula la actividad Nur sobre el sitio NurRE; produce la inducción del mRNA de Nur77 y no de Nurr1, un efecto transcripcional a nivel del promotor de Nur77; estos efectos dependen de la actividad de la protein quinasa p38; una línea que sobreexpresa una mutante dominante negativa de Nur77 es insensible a la estimulación por lL-1 de la secreción de ACTH, la actividad Nur y la inducción de POMC. La activación del factor de transcripción NFkB ejerce un efecto negativo en la estimulación de la actividad Nur y la inducción de POMC por IL-1. Demostramos que la potenciación entre IL-1 y CRH sobre la secreción de ACTH se observa también sobre la actividad Nur. El tratamiento con IL-1 aumenta la sensibilidad a la inhibición de la secreción de ACTH por glucocorticoides, tanto en la línea celular AtT20 como en cultivos primarios de adenomas corticotrofos humanos. Este efecto no es consecuencia de la inhibición del mRNA de POMC sino un efecto a nivel de la secreción y no es consecuencia de una diferencia en la afinidad de GR por los glucocorticoides ni una diferencia en el número de GR. En conclusión, en este trabajo de tesis caracterizamos por primera vez las vías de señalización involucradas en la regulación de la actividad Nur y la función corticotrofa por IL-1, CRH, glucocorticoides y sus interacciones, demostrando que la regulación de la expresión de POMC y ACTH en corticotrofos involucra: la existencia de una vía de MAPK funcional, la actividad fundamental de Nur tanto para CRH como para IL-1 y la interacción funcional de IL-1 con CRH (sinergismo) y con glucocorticoides (aumento de la sensibilidad a la inhibición).

Tradicionalmente se pensaba que las mucosas poseían un sistema inmune propio y común con pocos puntos de contacto con el resto del sistema inmune. Esto se fundamentaba en que las mucosas se caracterizan por (l) el predominio de la IgA, (2) la dificultad de obtener respuesta inmune en las mucosas con una inmunización sistémica y (3) que con una inmunización por una mucosa es posible dar protección en otras mucosas distantes. Con posterioridad, se encontraron varias interacciones entre los tejidos linfoides de las mucosas y los sistémicos que llevan a pensar que en realidad no hay una clara separación en dos sistemas inmunes, sino que constituyen una unidad. El fenómeno de la tolerancia oral, la posibilidad (en algunos casos) de inducir la respuesta inmune sistémica por inmunización por la vía de las mucosas y el transporte hepatobiliar de IgA polimérica desde el suero al intestino son ejemplos de esa comunicación. Otra conexión posible es que la médula ósea reciba células productoras de anticuerpos luego de una inmunización sistémica. Es bien conocido que en la médula ósea aparecen células plasmáticas luego de una inmunización sistémica. La médula ósea es el principal productor de anticuerpos en la respuesta secundaria. Pese a esto, no era claro si una inmunización por las mucosas podía llevar a que la médula ósea se convierta en productora de anticuerpos especificos. En este trabajo efectuarnos inmunizaciones orales (intragástricas e intra-placas de Peyer) utilizando toxina colérica, uno de los más potentes antígenos y adyuvante por las mucosas, para observar la cinética de aparición de las células plasmáticas antitoxina en el intestino, el bazo y la médula ósea. También observamos la respuesta de memoria. En estas condiciones encontramos que: - Tanto durante el primado como en la memoria, en la médula ósea aparecen células plasmáticas y este es el principal órgano productor de anticuerpos destinados a la circulación sanguínea. - La médula ósea es, además, el único órgano que mantiene células secretoras de anticuerpos muchos meses después de la inmunización oral, cuando consideramos que ya no queda antígeno en el organismo. - Existe una muy temprana presentación antigénica en el bazo, paralela a la que ocurre en el intestino. - La médula ósea posee linfocitos T y B de memoria, aunque el ganglio mesentérico y el bazo tienen mayor concentración de células de memoria. Todas estas observaciones contribuyen al mejor conocimiento de la amplia comunicación entre el llamado sistema inmune de las mucosas y el central y sostienen la idea de la unidad del sistema inmune.