Catálogo de publicaciones

Garona, J. (2015). Actividad antitumoral del nuevo análogo de desmopresina [V⁴Q⁵] dDAVP sobre células de carcinoma mamario. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

Fil:Wachsman, Mónica Beatriz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Meliacina (MA), un principio antiviral presente en las hojas de la planta Melia azedarach L., es capaz de inhibir in-vitro la multiplicación de un amplio espectro de virus, algunos patógenos para el hombre como HSV-1 y el virus Junín (agente de la fiebre hemorrágica argentina), entre otros. El tratamiento con MA de células en cultivo antes de la infección (pretratamiento) también desencadena un estado antiviral que afecta la multiplicación de diferentes virus. En el presente trabajo de tesis los objetivos planteados fueron, caracterizar el establecimiento del estado refractario a la infección viral en células Vero y determinar el mecanismo de acción de MA sobre el virus de la estomatitis vesicular (VSV), elegido como modelo de estudio. Los resultados obtenidos al utilizar inhibidores de diferentes funciones o procesos celulares permiten concluir que para inducir el estado antiviral MA no requiere de los mecanismos de transcripción y traducción celulares activos; ni de la paiticipación de la PKR ni the ninguna otra quinasa o fosfatasa de Ser/Thr, mientras que, tanto la actinomicina D como el vanadato y la tirfostina B46 potenciaron su establecimiento. Al estudiar el efecto de MA sobre distintos pasos del ciclo de multiplicación de VSV se logró identificar al desnudamiento y al transporte de la glicoproteína G cómo los blancos de acción del pre y del post-tramiento, respectivamente. Considerando que, ambos procesos tienen lugar en compartimentos celulares ácidos (endosomas y sistema de Golgi) y que hay una correlación entre la acción antiviral y la basificación que MA provoca en los endosomas, se plantea la hipótesis de que la acción antiviral de MA es una consecuencia directa de su efecto sobre la ATPasa vacuolar responsable de la acidificación de dichas organelas.

Las enfermedades infecciosas ocasionadas por virus representan aún en muchoscasos un problema a resolver dentro del campo de la medicina humana. Es conocido que la forma más efectiva de combatirlas es mediante la prevención por la aplicación de vacunas especificas, tal comoha ocurrido por ejemplo con la viruela, la poliomielitis y el sarampión. Sin embargo, hoy en dia existen muchas enfermedades virales para las que no se han podido desarrollar vacunas efectivas. Tal es el caso de las infecciones herpéticas originadas por virus herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), citomegalovirus humano (HCMV)y varicella-zoster (VZV), diarreas producidas por rotavirus, algunas enfermedades respiratorias ocasionadas por adenovirus y virus respiratorio sincicial (RSV), y por último, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) producido por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). En todos estos casos la única forma de enfrentar la enfermedad es mediante la quimioterapia. La detección de un número creciente de casos de SIDA con su secuela de enfermedad y muerte es precisamente uno de los factores que más ha motivado e impulsado el desarrollo de antivirales. Dado que en los pacientes con SIDA como en otros procesos de inmunodepresión se manifiestan con mayor severidad las infecciones con HSV y HCMV, además de ensayar drogas que sean efectivas contra HIV, también se trabaja intensamente en la búsqueda de compuestos activos contra dichos agentes. El presente trabajo de tesis constituye un aporte dentro de este campo, abordando el estudio y la caracterización de la actividad antiherpética de polisacáridos sulfatados aislados a partir de algas marinas.

Se investigó la variación de la actividad bacteriofágica para bacterias de los grupos coli-salmonella-disentérico y la supervivencia de bacterias de los grupos ooli-salmonella durante el proceso de digestión a 37° y 55°c de barro cloacal. Los ensayos se efectuaron con muestras de barro cloacal de la ciudad de Buenos Aires procedentes de la Estación de Bombas de Wilde y obtenidas por sedimentación directa del líquido cloacal. Para el aislamiento del bacteriófago se empleó el siguiente método: la muestra de barro, cuyo pH fué ajustado previamente a un valor próximo a 7.5, fué adicionada de caldo nutritivo y enriquecida con un cultivo jóven de la bacteria susceptible. Luego de incubar a 37° durante 24 horas se filtró primero por papel de filtro y luego por bujía Berkefeld W. La actividad lítica se ensayó con la técnica de las diluciones en serie del filtrado en caldo nutritivo (hasta la dilución 10^10) y subsiguiente siembra con un cultivo jóven de bacterias y por la acción de una gota del filtrado original sobre una capa uniforme en agar en cajas de Petri de un cultivo de la bacteria susceptible. La investigación de las bacterias del grupo salmonella se hizo empleando como medio de enriquecimiento el de Kauffmann-Müller (doble concentración); y como medio de aislamiento el de Kristensen, Lester y Jürgens (agar verde brillante) y el agar lactosa-tornasol. Para el E. coli (tipo I) se empleó el medio de Mc Conckey. Durante todos los ensayos de digestión de los barros se observó una gradual disminución de la actividad bacteriofágica hasta su anulación completa y una rápida desaparición de las bacterias ensayadas.

Staphylococcus aureus(SA) es un patógeno humano. Se estudió: 1) 109 SAmeticilino-sensible (SAMS)-(2006-2007), 2) 112 meticilino-resistenteSA(SAMR)-(2006-2008) de pacientes que asistieron al Hospital Cullen, Santa Fe-Argentina. Objetivos SAMS: detectar actividades bacteriostáticas y bactericidas (AB) para cefalotina(CEF), distinguir cepas tolerantes según diferentes criterios, analizar genes mecA, hlg y pvl por PCR en SAMS tolerantes y proponer una técnica simple para determinar ABCEF. CIM y CBM se determinaron por macrodilución en caldo. Aislamientos con CEFCBM/CIM>8 se estudiaron por CM. CEFCIM50/90 y CEFCBM50/90 fueron 0,5/1 y 1/8 µg/mL.Según CBM/CIM: 6 tolerantes, ABCEF: 77,1%. CM: 4 tolerantes mecA(-), ABCEF 99,1%. Con la simple técnica usando discos de CEF, oxacilina y cefoxitina goteados con betalactamasa casera para detectar ABCEF, oxacilina resultó la mejor. Objetivos SAMR: detectar actividades bacteriostática y AB para vancomicina (VAN), distinguir cepas tolerantes según distintos criterios, investigar polimorfismo genómico entre cepas VAN-tolerantes, estudiar VANBA contra SA adquiridos en la comunidad (SAMR-AC) y su relación con la leucocidina de Panton-Valentine(LPV), estudiar actividad sinérgica de VAN con ciprofloxacina, gentamicina, rifampicina e imipenem con VAN-tolerantes. VANCIM50/90 y VANCBM50/90 fueron 0,5/1 y 1/8 µg/mL. Según CBM/CIM: 12 tolerantes, ABVAN: 65,2%. CM: 4 tolerantes y ABVAN: 96,4%. Los 4 tolerantes pertenecieron a dos clones. ABVAN in CA-SAMR fue 96% indepediente de la producción de LPV pero las LPV(+) redujeron más lentamente el inóculo inicial a las 6 h por CM. Todas las combinciones fueron sinérgicas. Conclusión: CEF y VAN pueden ser utilizadas en el hospital Cullen-Santa Fe-Argentina y ABVAN frente a CA-SAMR fue independiente de la presencia de LPV.

De acuerdo a los objetivos planteados en este trabajo, hemos investigado la asociación entre componentes subcelulares del parásito con el gatillado y/o desarrollo del daño tisular en la forma crónica de la Enfermedad de Chagas. Nuestro primer paso fue investigar los componentes de la fracción CS responsables de la respuesta inmune humoral en los PChCr y en particular, identificar aquellos que pudieren ser reconocidos exclusivamente por los PChCr con cardiopatía severa. Para ello CS fue separada empleando geles de poliacrilamida, transferencia a hojas de nitrocelulosa y enfrentada con sueros de PChCr en distintos estadios clínicos. Estos estudios revelaron 32 componentes proteicos con PM entre 88 y 15 kDa, 30 de los cuales junto a 1 no visible por tinción para proteinas fueron reconocidos por al menos 1 de los 36 sueros ensayados, cada uno de los cuales reconoció entre 4 y 20 (media=12.6) bandas en CS. Si bien no pudo determinarse un perfil de reconocimiento particular para los PChCr con distinto compromiso clínico, se observó que el 75 % de los sueros reconocía 2 polipéptidos con PM aparente de 52 y 42/42 kDa. En un segundo momento intentamos una caracterización química inicial de las estructuras peptídicas antigénicas de CS y Mc. El tratamiento con ácido periódico disminuyó significativamente la reactividad de los sueros contra ambas fracciones, indicando el rol central de los carbohidratos en su antigenicidad. El tratamiento de CS con tripsina eliminó prácticamente toda la reactividad con los sueros de PChCr. El calentamiento y la reducción con 2 ME aunque también redujeron la capacidad total de unión de los anticuerpos hacia CS y Mc, el efecto fue más pronunciado para Mc. Sin embargo estos estudios revelaron que el antígeno calentado y reducido se resuelve en un mayor número de polipéptidos que el antígeno nativo, o solamente calentado o reducido. Con el objetivo de purificar antígenos relevantes se produjeron AcMo contra Mc. La reactividad anti-Mc y anti-CS de dichos AcMo fue evaluada empleando técnicas de ELISA, dot blotting (DB) e inmunoblotting (WB). Se seleccionaron así 45 hibridomas reactivos con Mc (28), Mc y CS (14) y CS (3). Entre los hibridomas productores de anticuerpos capaces de reconocer en Mc al menos un polipéptido con PM aparente mayor o igual a 50 kDa se seleccionaron 4 para su clonado. De estos 4 AcMo, todos del tipo IgM, fue posible aislar un total de 24 clones: 3 a partir del hibridoma 1A10, 12 a partir de 1D10, 2 a partir de 3C4 y 7 a partir de 2E9, la mayoría de los cuales se mostró reactivo con varios polipéptidos (3 a 9) en el mismo gel. Si bien el rendimiento de los procesos de clonado fue diverso, de 2 a 23 clones productores de AcMo reactivos con Mc según el hibridoma de partida, la eficacia del clonado fue buena: en 3 de los 4 casos fue posible identificar y aislar clones productores de Ac reactivos con polipéptidos del tamaño buscado, y en todos estos casos con reactividad más restringida que la del hibridoma original. A fin de investigar la presencia de determinantes antigénicos comunes al T. cruzi y a tejidos humanos se estudió la reactividad de los AcMo con muestras de tejidos humanos, obtenidas a partir de dadores cadavéricos no chagásicos, libres de enfermedades autoinmunes, coronarias y tumorales. Empleando ensayos de DB se estudió la reactividad anti-miocardio (MIO) y anti-músculo esquelético (MES) de 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS y 11 sobrenadantes negativos con ambas fracciones. En este primer estudio 27 de los 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS resultaron reactivos con MIO y/o MES. Con el propósito de establecer el perfil polipeptídico de MIO y MES humano ambos homogenatos fueron separados utilizando geles desnaturalizantes de poliacrilamida y transferidos a nitrocelulosa. Una porción de la misma se coloreó con Negro de Amido para evidenciar proteínas y la otra porción se aplicó a la determinación de glicoproteínas con Concanavalina A, para identificar residuos hidrocarbonados ricos en manosa y glucosa. MIO presentó 25 polipéptidos en el rango 79-15 kDa, 6 de los cuales contenían residuos azucarados, mientras MES reveló 24 bandas polipeptídicas, 7 de las cuales contenían hidratos de carbono. Una vez definido el perfil de MIO y MES se realizaron ensayos de WB para identificar los polipéptidos reconocidos por los AcMo en ellos. La fracción Mc es obtenida a partir de parásitos cultivados en un medio no definido que contiene homogeneizado de corazón bovino (TCM). Es entonces posible que componentes del medio de cultivo acompañen la purificación y hayan “ensuciado” la producción y selección de los AcMo, que así podrían incluir anticuerpos específicos para corazón bovino capaces de dar reacción cruzada con miocardio humano. A fin de investigar esta posibilidad se determinó en primer lugar la reactividad de dichos AcMo contra TCM y en aquellos casos donde esta fue encontrada se realizaron experimentos de absorción cuyos resultados demostraron que si bien para algunos AcMo existe reactividad cruzada entre Mc y TCM, la reactividad de los mismos hacia TCM es despreciable frente a la reactividad hacia Mc. Con el propósito de determinar no sólo la presencia sino también la localización subcelular de los antígenos de MIO y MES humano reconocidos por los AcMo anti-Mc se realizaron experimentos de inmunohistoquímica. Además se evaluó la especificidad de huésped y tejido empleando tejidos humanos y de hamster. En particular los AcMo ensayados (1A10C11, 1F3G2, 5A9B11 y 5F2) reconocieron estructuras en el MES humano y en MIO humano y de hamster. En todos los casos los AcMo se unen a antígenos intracitoplasmáticos, y en algunos casos (5A9B11 y 5F2) también a antígenos de la capa muscular de los vasos. El hecho de haber demostrado reactividad contra M10 de hamster dejó abierta la posibilidad de estudiar la actividad biológica de los mismos en modelos experimentales y por lo tanto consideramos importante estudiar el grado de homología entre los componentes del miocardio de distintos mamíferos. El perfil polipeptídico obtenido por la separación electroforética de homogenatos de MIO mostró un importante grado de homologia entre especies. Por otro lado la realización de ensayos de Inmunoiluorescencia sobre parásitos fijados mostró que los epitopos reconocidos por los AcMo, a pesar de pertenecer originalmente a una fracción interna del parásito, están también representados en la superficie y/o el flagelo del mismo. Otros estudios de caracterización de los AcMo anti-Mc revelaron que gran parte de los epitopos reconocidos por los mismos son al menos parcialmente de naturaleza glucídica. En particular entre los AcMo con reactividad cruzada dos (1A10C11 y 1F3G2) reconocen parcialmente epitopos de naturaleza glucídica mientras en los dos restantes (5A9B11 y 5F2) los residuos hidrocarbonados no forman parte del sitio reconocido. Para determinar si los epitopos con reactividad cruzada eran reconocidos por los PChCr y evaluar se ello tiene alguna importancia desde el punto de vista biológico, se realizaron ensayos de inhibición. La capacidad para inmunoinhibir la reacción del AcMo 5F2 con Mc fue significativamente mayor entre los sueros de PChCr que en los controles. Más aún, 5F2 fue capaz de diferenciar a la población de PChCr sin compromiso cardíaco, o con grado mínimo, de la de PChCr con compromiso cardiaco. Es también interesante destacar que la capacidad para inmunoinhibir la reacción de 5F2 resultó entre sueros de PChCr sin compromiso cardíaco directamente proporcional a la edad de los pacientes. El AcMo 5A9B11 también fue capaz de separar la población de PChCr de la de los controles. Más aún, los epitopos del 5A9B11 fueron reconocidos en distinta medida por los PChCr sin compromiso cardiaco, definiendose dos poblaciones con baja y alta capacidad de inmunoinhibición respectivamente. Por último, y atendiendo al rol central que las citoquinas y las moléculas de adhesión celular tienen en la modulación de la respuesta inmune, tanto en su faz protectora como en su potencial faz autoagresiva, en este trabajo estudiamos la cinética de expresión endógena de genes para citoquinas e ICAM-1 en células de bazo (B) y corazón (C) de ratones infectados con las cepas Tulahuén y CA-1 del parásito. Luego de obtener el ARN y ADNc a partir de homogenatos de B y C se realizaron ensayos de PCR cuali y cuantitativo usando "primers" y/o competidores específicos para IFN γ, TNF α, IL α, IL-6 e ICAM-1, encontrándose que la infección por el parásito va acompañada por un claro aumento en los niveles intracelulares de precursores para citoquinas e ICAM-1, aunque la cinética depende del órgano estudiado y de la naturaleza de los parásitos infectantes.

La hipótesis de trabajo sobre la cual se han formulado los objetivos específicos es la siguiente: péptidos provenientes de proteínas de la semilla de Amaranthus hypochondriacus presentan propiedades anti-inflamatorias capaces de modular la respuesta inmune innata, mediante la inhibición de la vía NF-κB y la respuesta inflamatoria. Objetivos específicos: - Obtener, caracterizar y aislar péptidos a partir de hidrolizados de proteínas, provenientes de semillas de Amaranthus hypochondriacus. - Modular la expresión de la quimioquina CCL20, inducida por flagelina en células epiteliales de colon humano, mediante la administración de hidrolizados proteicos y péptidos sintéticos, provenientes de Amaranthus hypochondriacus. - Modular in vivo la respuesta inmunológica Th2-dependiente específica de proteínas de leche bovina en un modelo en ratón de alergia alimentaria IgE-mediado, mediante la administración oral de péptidos sintéticos provenientes de Amaranthus hypochondriacus.

En este trabajo se presentan resultados sobre la búsqueda y análisis de la actividad cometaria en objetos de la región externa del cinturón de asteroides con el objetivo de entender mejor el transporte de material volátil de las zonas externas a las regiones más internas del Sistema Solar, tales como el cinturón de asteroides o las proximidades a la Tierra.Inicialmente se realizó una búsqueda de objetos provenientes del Sistema Solar exterior que, luego de ser perturbados por Júpiter, llegan transitoriamente a la región de los Hildas. Como las propiedades fı́sicas superficiales de estos objetos y los asteroides del grupo Hilda son similares, la única manera de distinguirlos es mediante estudios de su evolución dinámica. Mediante este procedimiento se seleccionaron 11 candidatos.A continuación se seleccionaron algunos de estos candidatos para su observación con el objeto de detectar actividad cometaria cuando se encuentran próximos al perihelio de su órbita. En esta Tesis se muestran particularmente los resultados obtenidos para el objeto (457175) 2008 GO98 el cual ha mostrado actividad en un importante arco de su órbita.Los datos observacionales que se utilizaron en este trabajo fueron adquiridos exclusivamente por mi persona, mediante observaciones realizadas en el Complejo Astronómico El Leoncito, Instituto operado por convenio entre el Consejo Nacional de Investigaciones Cientı́ficas y Técnicas de la República Argentina (CONICET) y las Universidades

Se estudió la actividad de oxidasa alternativa y la respiración mitocondrial en mitocondrias aisladas de diferentes tejidos de plantas superiores. Incubando tejido de tubérculos de papa en una cámara húmeda (envejecimiento) durante 24 y 48 horas se observó un incremento de la proteína mitocondrial con un concomitante aumento en la actividad de oxidasa alternativa. Además en dichas mitocondrias se observó un incremento en el consumo de oxígeno y una disminución en el control respiratorio con el tiempo de incubación. Al determinar la producción de anión superóxido en mitocondrias aisladas de tubérculos de papa se encontró que representa una pequeña fracción del consumo de oxígeno total y que no se incrementa con el envejecimiento. El envejecimiento del tejido produce un considerable incremento en la actividad de superóxido dismutasa citosólica (enzima Cu-Zn) lo cual es consistente con un incremento en la producción citosólica de Ō¯2̄ en condiciones fisiológicas. En la determinación de la actividad de oxidasa alternativa en mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de semillas de soja no se observó una actividad apreciable de oxidasa alternativa durante los primeros estadíos de incubación como habían propuesto Yentur y Leopold (1976) y su nivel se mantuvo bajo entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En embriones de soja se observó un incremento en el consumo de oxígeno que es paralelo al observado en el peso fresco entre las 2 y las 14 horas de imbibición. En mitocondrias aisladas de ejes embrionarios de soja se observó un incremento en la respiración por el agregado de citocromo c exógeno, y una disminución del efecto del citocromo c con el tiempo de imbibición. Al medir la respiración de embriones de soja se observó que el 46-50% del consumo de oxígeno total es de origen mitocondrial siendo el resto del consumo de oxígeno extramitocondrial y debido a la actividad de otras enzimas como oxidasas, oxigenasas (por ej. tirosinasa, lipoxigenasa, etc.). Esto coincide con trabajos realizados con quimioluminiscencia (Boveris y col., 1980) donde se obtiene una gran actividad de lipoxigenasa en homogenados de semillas de soja. Esta actividad de lipoxigenasa es insensible al cianuro y a la antimicina, pero es sensible al SHAM, similarmente a la oxidasa alternativa que es sensible al SHAM e insensible a los otros dos inhibidores. En mitocondrias de raíces de maiz que crecen en una solución nutritiva, se encontró una actividad de oxidasa alternativa que da cuenta del 41% del consumo de oxígeno total. En dichas mitocondrias la actividad de la oxidasa alternativa parece asociarse a la denominada "respiración salina" donde se produce exceso de ácidos orgánicos cuya función es mantener la electroneutralidad frente a la absorción de iones. Se observó con el uso de inhibidores de la respiración, que en mitocondrias de raíces de maíz, el SHAM y la antimicina actúan en sitios separados, pero que muestran una ligazón cooperativa entre ambos sitios. Los estudios realizados sobre la actividad de oxidasa alternativa y su papel fisiológico se han hecho sobre tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos. En los trabajos realizados con tejidos enteros, no se puede afirmar que la actividad medida sea la que corresponde a la oxidasa alternativa, porque hay que considerar otros factores que pueden influir en su determinación. En el trabajo realizado para esta tesis utilizando tejidos y mitocondrias aisladas de los mismos permite concluir que para determinar la actividad de la oxidasa alternativa de un tejido hay que aislar las mitocondrias del mismo.