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La función de la glándula tiroides está regulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH), una hormona glicoproteica secretada por la hipófisis anterior. En respuesta principalmente a TRH, la TSH madura se libera a la circulación e induce la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas: triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), que son las hormonas metabólicamente activas. La secreción de TSH está regulada por TRH y por un ciclo de retroalimentación negativa en el que las hormonas T3 y T4 actúan a nivel pituitario e hipotalámico. Dado que el control por retroalimentación de la secreción de TSH es exquisitamente sensible a las hormonas tiroideas periféricas, la mayoría de los trastornos tiroideos pueden diagnosticarse midiendo los niveles de TSH y de las hormonas tiroideas. Por esta razón, para la toma de decisiones clínicas, la medición de TSH en suero humano ha sido establecida como la "primera línea" para el diagnóstico de la función tiroidea. La mayoría de los métodos actuales para la determinación de TSH utilizados en los laboratorios clínicos son inmunoensayos heterogéneos "sandwich" que implican (1) enzimas, (2) sustratos fluorométricos o (3) marcadores quimioluminiscentes. En comparación con los inmunoensayos competitivos tradicionales, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos heterogéneos para cuantificar TSH ofrecen (1) límites de detección más bajos, (2) tiempo de respuesta rápido y (3) un rango de medición lineal más amplio. En virtud de su obvia importancia para el diagnóstico clínico, se ha realizado un esfuerzo constante para desarrollar métodos analíticos con alta sensibilidad para TSH en fluidos corporales humanos. Aunque la sensibilidad y la reproducibilidad de los inmunoensayos de TSH han ido mejorando progresivamente en los últimos 30 años, existen discrepancias analíticas en las determinaciones cuantitativas de TSH entre los sistemas disponibles comercialmente. La mayor variabilidad entre métodos se encuentra a bajas concentraciones de la hormona (por debajo de 0,4 μUI/ml), debido a la menor capacidad de detección y a la sensibilidad analítica de los inmunoensayos en este rango de concentraciones. En 1992, Sano y col. crearon una técnica llamada inmuno-PCR (IPCR), en la que reemplazaron la enzima de detección del ELISA por una sonda de ADN conjugada a biotina. Esta sonda de ADN luego es amplificada mediante PCR para la generación de señal, siendo el número de amplicones producidos proporcionales a la cantidad antígeno detectado. Desde la aparición de esta técnica, diversas aplicaciones y estrategias de IPCR se han desarrollado para la detección de innumerables antígenos. A lo largo de los años, estos estudios han demostrado que un ensayo de IPCR puede mejorar el límite de detección de 10 a 10.000 veces más que el de un ensayo de ELISA homólogo.En este trabajo de tesis desarrollamos un ensayo de ELISA sandwich y uno de IPCR altamente sensible, específicos para la detección de la hormona estimulante de la tiroides humana (hTSH). Se generó un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra hTSH por tecnología de hibridomas y se seleccionaron racionalmente combinaciones de anticuerpos. Se establecieron las condiciones de ensayo óptimas para la determinación de la hormona por ELISA sandwich y se seleccionaron dos pares de MAbs (B-4 y B-9). Estos prototipos de ELISA se evaluaron frente a patrones calibrados con la 2ª preparación internacional de referencia de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y en comparación con un kit ELISA comercial. Aunque el límite de detección (LD) fue de 0,1 μUI/ml en todos los casos, el prototipo de ELISA B-9 mostró un rendimiento analítico similar al kit de ELISA comercial. Por lo tanto, seleccionamos B-9 para desarrollar el ensayo de IPCR sandwich específico, utilizando el formato "Universal", en tubos de PCR estándar sin pretratamiento. La amplificación de la señal se logró a través de la interacción entre el MAb de detección biotinilado y la sonda de ADN mono-biotinilada, previamente autoensamblada con neutravidina. En comparación con los ELISAs evaluados, el ensayo de IPCR mostró un menor LD y un considerable aumento de la sensibilidad (pendiente), proporcionando una mejor resolución cuantitativa en el rango de bajas concentraciones de la hormona. La sensibilidad, facilidad de uso y el bajo costo de la técnica IPCR desarrollada ubican a esta metodología como una plataforma potencial para la detección cuantitativa de hTSH en muestras de suero humano. Además, el método de IPCR descripto (universal) demostró ser un formato práctico y versátil, realizado en tubos de PCR estándar. Nuestros resultados respaldan el potencial de la técnica para su aplicación en el diagnóstico de los estados tiroideos y para la medición confiable de niveles bajos clínicamente relevantes. Consideramos que el método propuesto puede posicionarse como alternativa metodológica para el análisis de hormonas.

En este trabajo de tesis se desarrolló un sistema de encapsulación compuesto para la vehiculización de extracto de yerba mate y zinc, simultáneamente. Se obtuvo un extracto acuoso de yerba mate con alto contenido de compuestos fenólicos y una elevada actividad antioxidante frente al radical DPPH•. Este se encapsuló en matrices de alginato de calcio adicionadas de almidón en distintas concentraciones. La incorporación de almidón de maíz al 2% resultó la más adecuada, aumentando la eficiencia de carga, conservando las características morfológicas luego del secado y disminuyendo la porosidad del sistema. Además el empleo de dicha concentración de almidón, moduló la velocidad de liberación de los polifenoles en fluido gástrico simulado, principalmente en cápsulas secas. La obtención del sistema de encapsulación compuesto se realizó partiendo de la formulación óptima de almidón-alginato de calcio al 2% p/v. Se analizó y se seleccionó la concentración más adecuada de zinc a vehiculizar en el almidón. Fue posible obtener cápsulas conteniendo extracto de yerba mate y zinc simultáneamente, al emplear el almidón cargado con bajas dosis del mineral. En estos sistemas no se afectaron las propiedades individuales de cada compuesto activo manteniendo su funcionalidad, ni sus características morfológicas. Los sistemas de encapsulación obtenidos en este estudio constituyen una alternativa efectiva para la protección de compuestos activos de interés para la salud, aportando distintas funcionalidades complementarias entre si.

En el presente trabajo de Tesis se han logrado desarrollar diversos tipos de matrices poliméricas utilizando estructuras basadas en celulosa bacteriana. Luego de comprender los procesos de producción y purificación de la celulosa se procedió a generar modificaciones en las matrices con el objetivo de lograr que puedan encapsular Doxo y liberarla de manera sostenida. Todas las matrices desarrolladas fueron diseñadas para ser utilizadas específicamente como sistemas de liberación controlada para una aplicación antitumoral localizada. La primera modificación realizada en las membranas de celulosa fue una modificación ex situ que permitió inmovilizar micropartículas hibridas de CaCO3, utilizando dichas partículas como núcleos de carga del fármaco. Las caracterizaciones fisicoquímicas realizadas sobre el biomaterial permitieron identificar la conservación de la esfericidad y tamaño de las micropartículas. Además, se determinó un incremento en la estabilidad del material asociado a la presencia de las micropartículas. A continuación, se evidenció una buena capacidad de encapsulación del fármaco y una liberación sostenida en el tiempo y dependiente de la carga y del pH circundante. En una siguiente etapa se realizó una modificación in situ en las membranas mediante el agregado de alginato en el medio de cultivo del microorganismo productor de celulosa (K. Hansenii). Este tipo de modificación se realizó por dos cuestiones básicas. Por un lado, necesitábamos conocer el comportamiento de la celulosa ante el agregado de otro polímero en su medio de cultivo. Por el otro lado, se necesitaba conseguir que el nuevo material lograra liberar Doxo en concentraciones más elevadas. La síntesis de la matriz hibrida BC-Alg dio lugar a un biomaterial con propiedades muy diferentes a las de la celulosa nativa. En primera medida se pudo determinar la presencia del alginato integrado con la red de celulosa. Dicha integración permitió obtener una red cooperativa entre ambos biopolímeros otorgándole a la matriz propiedades diferentes, tales como aumento de su fase amorfa e incremento considerable en la porosidad y área superficial del biomaterial. Dichas nuevas características demostraron ser relevantes al momento de encapsular Doxo. La nueva matriz demostró una buena versatilidad en cuanto a su capacidad de carga del fármaco y también se demostró la capacidad de liberar el mismo de modo sostenido en el tiempo. Por último, se evaluó la acción citotóxica sobre una línea celular de adenocarcinoma de colon (HT-29) la cual posee una relativa resistencia a la Doxo. Los resultados fueron de sumo interés debido a que la Doxo liberada desde las membranas demostró ser más efectiva que la exposición de las células a Doxo libre. En este sentido, se sugirió que la encapsulación del fármaco y liberación lenta podían estar evitando procesos de precipitación de la Doxo. Hasta este punto, se habían podido generar sistemas capaces de encapsular y liberar Doxo de manera sostenida en el tiempo. Sin embargo, con el objetivo de poder garantizar un aumento en la efectividad del tratamiento se decidió avanzar en el diseño de una formulación de nanopartículas capaces de encapsular y liberar Doxo. Las mismas serian liberadas a su vez desde las membranas de celulosa. El sistema elegido y desarrollado consistió en nanopartículas lipídicas nanoestructuradas (NLCs). En las mismas se logró la encapsulación de dos especies iónicas de la Doxo. Por la naturaleza de las nanoparticulas la especie de Doxo más hidrofóbica fue la que presentó una EE más elevada y una liberación más lenta. Además, las técnicas fisicoquímicas permitieron determinar la existencia de interacciones entre la matriz lipídica y las moléculas de Doxo, especialmente en el caso de la especie hidrofóbica. Se demostró que el tamaño, dispersión y carga superficial de las partículas era muy similar en ambas formulaciones, y además era indicativo de la potencialidad para obtener una buena capacidad de internalización celular. Los ensayos in vitro demostraron que las NLCs presentaban una capacidad citotóxica dependiente del tiempo. Las NLCs-H mostraron su capacidad para generar más daño que las NLCs-N. A continuación, los ensayos de internalización demostraron diferencias en los mecanismos utilizados por la célula en comparación con la Doxo libre. Aquí se determinó que el mecanismo utilizado era por vía endosómica, terminando en lisosomas y accediendo desde ahí al núcleo celular y posiblemente a otros blancos de acción. Por último, utilizando ambas formulaciones de NLCs se generó una matriz hibrida de tipo NP-Gel integrando las nanoparticulas en la red de celulosa. Este nuevo sistema fue caracterizado mostrando la capacidad de contener a las NLCs sin modificar su tamaño y morfología. Se realizaron pruebas de encapsulación y liberación sostenida, mostrando ser un sistema apto para ser evaluado en ensayos in vivo. Dichos ensayos se realizaron mediante la implantación de las membranas BC-NLCs-NH en un modelo tumoral ortotópico de cáncer de mama. Los resultados obtenidos exhibieron una capacidad antiproliferativa por parte de las membranas y comparable con el efecto obtenido con el control de Doxo i.t. Además, se observó un efecto de inhibición en la generación de metástasis. De esta forma el sistema BC-NLCs-NH demostró poseer una cierta potencialidad como sistema de liberación controlada de Doxo para aplicación local. Este sistema pretende ser utilizado como quimioterapia adyuvante a la administración sistémica de fármacos. De esta manera, se intentaría disminuir las dosis elevadas y, consecuentemente, toxicas de los quimioterapéuticos administrados por vía intravenosa. Los casos donde este sistema pretende cobrar valor podrían ser aquellos donde la extirpación del tumor primario es demasiado riesgosa por tamaño o locación. Este tipo de implantes promete ser una herramienta que permita atacar el problema sin someter a un paciente inmunodeprimido a una quimioterapia sistémica con elevada toxicidad.

Los analitos de interés biológico utilizados fueron una familia de alcaloides b-carbolínicos denominados Harmanos, entre ellos podemos destacar al Harmano, Norharmano, Harmol, Harmalol, Harmina y Harmalina. Todos estos alcaloides son estructuralmente muy similares y de pesos moleculares muy cercanos (en algunos casos de 1 Da) con lo cual la separación de los mismos constituye un interesante desafío. El interés de su análisis radica en que estos alcaloides están presentes en cantidades variables en varias especies vegetales y que, a su vez, a ciertas concentraciones poseen efectos psicotrópicos y alucinógenos en seres humanos, así como se presume que son cancerígenos según estudios recientes. Los mismos en concentraciones elevadas en alimentos los harían no aptos para el consumo humano. Por otra parte se estudiaron péptidos opiáceos que están relacionados con enfermedades como el dolor crónico, alzheimer, entre otras. Su determinación a concentraciones extremadamente bajas en plasma humano sería de mucha utilidad al momento de realizar diagnósticos precoces. Mediante técnicas electroforéticas de preconcentración en línea y mediante el uso de distintos sistemas de detección se intenta alcanzar los límites de detección deseados para cada muestra en particular. Además se desarrollan nuevos métodos de concentración utilizando a la temperatura como variable.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Los organismos vivos basan su fisiología en el uso de un conjunto de aminoácidos que es común a todos los seres vivos sobre la tierra. Los aminoácidos presentan dos posibles formas enantioméricas y por tanto todas las proteínas, enzimas, moléculas sintetizadas por células, y extendiendo así hasta generalizar a toda la fisiología de los seres vivos sobre la tierra se ha desarrollado en base a una de las formas isoméricas para cada especie. La introducción por parte del hombre de compuestos (alimentos, aditivos, fármacos, etc..) sintetizados por vía química, que dan como producto mezclas racémicas, genera la necesidad de separar, estudiar y controlar por separado cada uno de los enantiómeros producidos, dado que uno de ellos se metabolizará de una manera en los organismos vivos y el otro puede hacerlo de una manera diferente o directamente, no metabolizarse. En la década del '60 se produjo un suceso lamentable, de gran repercusión: el caso de la talidomida. Este fármaco se prescribía a las embarazadas como antiemético, pero luego de unos años de uso (1958-1963) se verificó un importante número de casos de malformaciones en los bebés y se prohibió. Hacia fines de los '70 se descubrió que esa droga, sintetizada químicamente como mezcla racémica, contenía una de las formas enantioméricas, la R-talidomida, que generaba el efecto deseado, mientras que la otra forma, la S-talidomida, resultaba teratogénica y generaba, durante la gestación, las malformaciones observadas en los recién nacidos. A partir de entonces se tomó conciencia de la importancia de controlar las formas enantioméricas de un compuesto quiral, lo cual generó todo un campo de investigación en las separaciones analíticas. Si bien este campo comenzó a tomar relevancia a principios de los '80 cobrando fuerza en los '90, aún hoy no existe un método, fase estacionaria o columna de uso general, con lo cual todo aporte que se pueda introducir en el tema resulta valioso. Dadas las similitudes en las propiedades físicas de las formas enantioméricas, la única manera de separar ambas formas es mediante una interacción selectiva de una de las formas con otra molécula de quiralidad definida, presente en la fase estacionaria o en la fase móvil. Debido a esto, el objetivo general planteado en el trabajo de tesis doctoral consistió en desarrollar herramientas para estudiar sistemas de asociación entre analitos y selectores quirales para su posterior utilización en la optimización de electroseparaciones enantioméricas. Para cumplir con el mismo se abordaron cuatro objetivos específicos:(I) Desarrollar un modelo teórico para estudiar el equilibrio de asociación analito-selector quiral involucrado en la separación mediante electroforesis capilar. Emplear dicho modelo para obtener constantes termodinámicas de asociación.(II) Desarrollar un método para optimizar la concentración de selector quiral para la separación simultánea de una mezcla compleja de analitos seleccionados como modelo.(III) Estudiar los mecanismos que contribuyen a la separación quiral mediante electroforesis capilar.(IV) Desarrollar métodos para fabricar columnas capilares particuladas de alta eficiencia.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020

El sustrato es un insumo para el sector florícola de gran interés en el Área metropolitana bonaerense (AMBA) y el suelo mineral es uno de los materiales más utilizado como componente. Sin embargo, por ser un recurso limitado y de variable calidad, es necesario buscar alternativas para disminuir su uso. Por este motivo esta tesis tiene como objetivo verificar la calidad de materiales disponibles en el AMBA para desarrollar sustratos sin suelo para el cultivo en maceta de plantas florales. Muestras de turba subtropical, pinocha y corteza de pino compostada, obtenidas mensualmente durante un año en tres empresas de la zona, fueron analizadas física y químicamente para determinar la variabilidad temporal de las propiedades. Se seleccionaron los materiales de menor variabilidad para formular siete sustratos que fueron analizados y comparados con un sustrato comercial y local. Posteriormente, fueron evaluados mediante el cultivo en maceta de plantas florales. Los resultados indicaron que la turba subtropical, la pinocha y la corteza de pino compostada son materiales viables para ser utilizados como componente de sustratos. La variación temporal de cada material fue disminuida cuando fueron procesados y la conductividad eléctrica fue una de las propiedades más variables. Todos los sustratos formulados produjeron plantines florales de calidad, pero se destacaron las mezclas con las siguientes proporciones de corteza de pino compostada, pinocha y turba subtropical: 1:1:1, 1:2:1, 1:2:2, 2:1:2 y 2:2:1. Estos sustratos se caracterizaron por tener una capacidad de retención de agua superior a 50% y una porosidad de aireación menor a 35%.

Esta tesis trata fundamentalmente sobre el desarrollo de técnicas ópticas útiles en la determinación del tamaño de partículas tanto dieléctricas en el rango micrométrico como metálicas en el rango nanométrico. Dichas técnicas están basadas en el análisis espectroscópico de la radiación interactuante con el material particulado. Para el caso de partículas dieléctricas se implementó la llamada espectroscopía de retrodispersión, mientras que para partículas metálicas se recurre a la espectroscopía de resonancia de plasmones. Las propiedades de las nanopartículas se diferencian notablemente de su comportamiento como material volumétrico (bulk). La Ingeniería y la Física Aplicada están trabajando actualmente en forma interdisciplinaria para el estudio y desarrollo de materiales nanoestructurados con propiedades novedosas que puedan ser diseñados y funcionalizados para aplicaciones específicas. Se han obtenido resultados empleado la transformada de Fourier para la determinación de tamaño de partículas dieléctricas en suspensiones mono y multimodales resultando un método relativamente sencillo. El rango de tamaños de partículas abarcado ha sido desde el micrómetro hasta 60 micrómetros dependiendo la región del espectro electromagnético utilizada. Se discuten los principales mecanismos involucrados en la fabricación y fragmentación de partículas metálicas de oro utilizando pulsos láser ultracortos, algunos de ellos son: modificación del espectro irradiado debido a efectos no lineales en el medio donde se sumerge la muestra (parámetro de Keldish). y formación del espectro supercontinuo debido a efectos no lineales. Como métodos para funcionalización se presentan resultados empleando fluencia controlada. Se examinan los efectos del supercontinuo en el proceso de fragmentación aplicando fluencias bajas. El supercontinuo fue generado externamente en un cristal de zafiro y en agua. El cambio más grande fue obtenido para 0.855 J/cm² de fluencia aplicadas al agua, pues el pico del plasmón pasó a estar en 521 nm. respecto del pico de la solución inicial ubicado en 531 nm. También se han diseñado procedimientos para la funcionalización de partículas metálicas núcleo cubierta utilizando distintas fluencias. Se analiza la extinción óptica de las suspensiones coloidales de Nps de Ag generadas usando un amplio rango de fluencias (60 J/cm², 160 J/cm², 800 J/cm² y 1000 J/cm²) para caracterizar el tamaño del núcleo y espesores de la cubierta, observándose como resultado cambios en la posición del pico de extinción del plasmón de acuerdo a los distintos espesores de la cubierta. En estos casos para obtener la extinción se han utilizado expresiones de la aproximación electrostática para partículas Por último se han analizado reflectancias de films delgados.Se propone un nuevo método híbrido para medida de espesores en multicapas basado en las propiedades ópticas de la resonanacia de plasmones superficiales y del modo acoplado de guia de onda óptica.Por medio de la simulación de la reflectancia para sistemas multicapa constituidos por plata y óxido de plata se han obtenido parámetros caracteristicos que dependen sensiblemente de los espesores y en consecuencia hacen posible la medida.