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El ensamblado y la anotación de genomas es un área de particular interés en genómica, que ha abierto un horizonte de posibilidades impensadas en la época de los primeros avances de la genómica preinformática. Desde las primeras secuenciaciones de genomas completos, se han desarrollado diferentes métodos y herramientas para el procesamiento y anotación de datos genómicos. La aparición de las tecnologías de secuenciación de nueva generación ha significado una verdadera revolución en la biología y, sobre todo, en las denominadas ciencias ómicas. Sin embargo, los enormes volúmenes de datos generados representan nuevos desafíos, tanto a nivel técnico como de análisis. Se genera mucha más datos de los que pueden procesarse para posibilitar la extracción de información en forma confiable, con lo que la cantidad de datos no curados en diferentes repositorios es cada vez mayor. La velocidad con la que crecen las bases de datos y la dificultad de garantizar la calidad de las mismas, hacen que las anotaciones, principalmente automáticas, requieran siempre un gran esfuerzo posterior de curado manual. Asimismo, la disparidad en los formatos y fuentes de datos y la falta de estandarización en las metodologías dificulta la integración entre diferentes análisis, lo que suele requerir también un gran insumo de tiempo para poder extraer información a partir de datos obtenidos por medios diversos. El presente trabajo de tesis tuvo como principal objetivo el diseño, programación, testeo y aplicación de protocolos de trabajo (pipelines) para ensamblado y anotación de genomas y transcriptomas de organismos con diversos niveles de complejidad. Se programaron pipelines para ensamblar y anotar organismos desde virus y bacterias a eucariotas superiores. Cada pipeline fue organizado en forma modular, permitiendo iniciar el proceso desde los primeros pasos de secuenciación hasta las etapas más avanzadas, con la posibilidad de incorporar información procedente de fuentes diversas, tanto internas como externas y de combinar los diferentes pipelines entre sí, según el nivel de análisis que se necesite y la información de que se disponga. A su vez, las anotaciones finales son incorporadas a la plataforma web de BIA (Plataforma de Bioinformática Argentina), interrelacionándose y enriqueciéndose con otros módulos y pudiendo visualizarse y filtrarse en forma flexible. Paralelamente al proceso de desarrollo de los pipelines, los mismos fueron aplicándose a diversos organismos, en un proceso iterativo de testeo y mejoramiento. De esta forma, se ensamblaron y anotaron diversas especies de bacterias, arqueas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores, entre ellos: anotación de la arquea extremófila Halorubrum sp. AJ67 y de la bacteria probiótica Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, ensamblado y anotación de las cepas M y B del complejo Mycobacterium Tuberculosis; ensamblado y anotación de un hongo no caracterizado del género Trichoderma, ensamblado, anotación y estudio comparativo del patógeno de maíz Puccinia sorghi race RO10H11247; ensamblado y anotación de Ilex Paraguariensis A. St.-Hil., en el marco del Proyecto de Secuenciación del Genoma de Yerba Mate (PRO.MATE.AR).

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2018

La biología del desarrollo ha comenzado a describir diversas maneras a través de las cuales el perfil metabólico de las células que componen los diferentes tejidos interactúa con mecanismos ontogenéticos. Sin embargo, hasta el momento las estrategias utilizadas no estuvieron basadas en la detección de cambios metabólicos a nivel de célula única. En este trabajo hemos desarrollado herramientas moleculares en la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, que permitirán estudiar, mediante técnicas de microscopía, el perfil bioenergético de células individuales in vivo, en distintos tejidos durante el desarrollo. Estas herramientas consisten en una serie de líneas transgénicas de Drosophila que expresan biosensores basados en el fenómeno de FRET, capaces de monitorear niveles de metabolitos o co‐factores del metabolismo energético a nivel de célula única. Estos son: LACONIC, sensor de lactato, PYRONIC, sensor de piruvato y OGSOR, sensor de 2‐oxoglutarato citosólico. También se generó un reportero transcripcional de la enzima piruvato deshidrogenasa kinasa (PDHK), el cual permite identificar células que podrían estar dependiendo de un metabolismo esencialmente glucolítico. Con estas herramientas intentaremos identificar reprogramaciones del metabolismo energético durante el desarrollo de Drosophila.

El virus de Anticarsia gemmatalis, AgMNPV, es el bioinsecticida viral que ha sido más utilizado en el mundo. Este virus, perteneciente a la familia de los baculovirus, actúa específicamente sobre larvas de la oruga de las leguminosas, Anticarsia gemmatalis, un lepidóptero que causa severos daños en los cultivos de soja y otras leguminosas. A pesar del amplio uso de AgMNPV en países con climas cálidos, como Brasil y Paraguay, la aplicación de este baculovirus en Argentina se ha visto limitada por su tiempo de acción lento en comparación con los insecticidas químicos de amplio espectro. El objetivo del trabajo desarrollado en esta tesis consiste en la generación de herramientas que permitan mejorar las posibilidades de aplicación de AgMNPV como bioinsectida mediante el uso de estrategias de biología molecular. En el segundo capítulo se describe el desarrollo de un sistema de recombinación que establece la base para la modificación genética de AgMNPV. En el tercer capítulo se describe el desarrollo de líneas celulares derivadas de lepidópteros que expresan la proteína mayoritaria del cuerpo de oclusión de los baculovirus, poliedrina. Este desarrollo permitió la generación de cuerpos de oclusión de AgMNPV de genotipo poliedrina negativo (polh-), lo cual representa un avance importante en la generación de bioinsecticidas con una barrera de contención ecológica. En el cuarto capítulo se detalla el desarrollo de una línea celular que expresa un gen indicador (GFP) inducible por la infección con baculovirus. Este tipo de líneas celulares representa un recurso importante para la manipulación cotidiana de baculovirus en cultivo celular y para estudios básicos. En el quinto capítulo se describe la transactivación de promotores del alfabaculovirus AgMNPV y del betabaculovirus EpapGV por parte de factores de transcripción provistos por la infección con AgMNPV en un entorno celular en el que no se replica EpapGV. Este tipo de estudio permite avizorar la perspectiva de expandir el rango de hospedador de AgMNPV a través del desarrollo de baculovirus recombinantes quiméricos entre dos especies de la familia. En el sexto capítulo se describen los avances en el desarrollo de sistemas de recombinación más eficientes para AgMNPV y se discuten algunos resultados novedosos acerca de la función del gen 1629 en la replicación y la infectividad de los baculovirus en cultivo celular.

Diachasmimorpha longicaudata Ashmead (Hymenoptera: Braconidae) es un endoparasitoide solitario de estadios larvales de moscas de la fruta perteneciente a la familia Tephritidae. Es criado a nivel masivo en bioplantas y utilizado en diversas partes del mundo para las estrategias de control biológico (CB) principalmente de dípteros de importancia económica de los géneros Ceratitis, Anastrepha y Bactrocera. Actualmente, se estudia su implementación en nuestro país para el control de Ceratitis capitata Wiedemann (Diptera: Tephritidae). Se cuenta con una vasta cantidad de información acerca de su biología general, fisiología, comportamiento y condiciones de cría artificial. Recientemente se han descripto aspectos genéticos y citogenéticos que permiten profundizar los conocimientos respecto a sus procesos fisiológicos. Este parasitoide posee un ciclo de vida haplodiploide (machos haploides, hembras diploides) y la determinación sexual está gobernada por el mecanismo de alelos complementarios CSD (de las siglas en inglés “Complementary sex determination”) con al menos dos loci involucrados en las vías tempranas de este complejo mecanismo, aunque aún son escasos los conocimientos que se poseen acerca de sus bases genéticas. Estos conocimientos tienen un impacto potencial relevante tanto sobre el diseño de estrategias de mejoramiento de la productividad y calidad de las crías artificiales como sobre la implementación del CB basado en D. longicaudata en el campo. A fin de aportar información genética para mejorar las condiciones artificiales de cría de D. longicaudata y profundizar el conocimiento sobre aspectos moleculares de mecanismos de relevancia para la aplicación del CB en nuestro país, este trabajo de tesis se centró en el estudio de las bases moleculares del sistema de determinación del sexo en esta especie. Se tomaron dos aproximaciones, una aproximación indirecta, caracterizando regiones genómicas a partir del conocimiento de genes involucrados en la determinación del sexo en especies relacionadas y una aproximación directa mediante el análisis de regiones codificantes específicas a través de la secuenciación del transcriptoma de la especie y el análisis comparativo descriptivo de expresión entre machos y hembras del parasitoide. A partir de esta última aproximación, se generó una cantidad masiva de datos de alta calidad, que permitieron conocer una alta proporción de las secuencias expresadas en D. longicaudata. Mediante una búsqueda por homología de secuencia a partir de nuestra base de datos, se ha logrado identificar transcriptos homólogos a dos de las llaves involucradas en la determinación del sexo: el regulador transcripcional feminizer/transformer y el efector que se encarga de regular genes que determinarán caracteres sexuales secundarios, doublesex. Se validaron a posteriori los resultados por medio de la técnica de RT-qPCR y se analizó la expresión diferencial de las variantes de fem y dsx entre machos y hembras; encontrando que existen dos variantes del transcripto homólogo a fem que se expresan diferencialmente entre sexos. Paralelamente, la tecnología de secuenciación masiva posibilitó la identificación y caracterización in sílico de 7000 marcadores moleculares potenciales (SSR y SNP) estableciendo la utilidad de 1106 marcadores microsatélites disponibles para estudios genético-poblacionales para caracterizar la variabilidad genética de poblaciones silvestres y cepas establecidas en condiciones de laboratorio o cría masiva de D. longicaudata.

El uso de herramientas de biología sintética permite realizar una contribución significativa para el avance de la ingeniería genética, mediante la reducción de los tiempos de desarrollo de organismos recombinantes. Sin embargo, la mayoría de las herramientas de biología sintética has sido obtenidas para E. coli. En este proyecto se ha desarrollado una plataforma para modificar genéticamente de manera rápida un microorganismo de alto interés industrial como C. glutamicum. En este trabajo fue diseñado un vector sintético denominado pTGR, en el cual todos sus componentes se encuentran flanqueados por sitios de restricción únicos. El mismo permite el rápido intercambio de secuencias regulatorias así como la obtención de construcciones que permiten la expresión de varios genes simultáneamente. La plataforma que provee el sistema del pTGR contribuye a la exploración de partes involucradas en la expresión génica y facilita el rápido ensamblado de circuitos genéticos el cual permite realizar ingeniería metabólica en C. glutamicum. El sistema fue validado utilizando genes reporteros para ensayar promotores y RBSs y para el ensamblado de operones duales y clústers que contienen dos unidades transcripcionales. Por otro lado se estudiaron estrategias alternativas, que no dependen de elementos reguladores de la transcripción. En este sentido, se determinó que tanto la variación la concentración del inductor así como el intercambio de orígenes de replicación con distinto número de copias, también pueden ser utilizados como herramientas para regular los niveles de expresión de proteínas recombinantes en C. glutamicum. Utilizando las ventajas que provee la plataforma pTGR se estudiaron distintas secuencias de secreción del sistema Tat en C. glutamicum reportadas en la bibliografía, demostrando que la correspondiente a la proteína PhoD de B. subtilis resultó la más eficiente al momento de secretar el gen reportero mCherry. Además, aprovechando la versatilidad que brinda esta herramienta, se sobre-expresaron los traslocadores de la vía Tat, desde el vector pTGR, demostrando que es posible lograr un aumento de la eficiencia de secreción mediante esta estrategia. A continuación se busco emplear la herramienta genética creada para su utilización en sistemas de expresión de proteínas de interés industrial. Así, se utilizaron diferentes péptidos señales evaluados con el sistema pTGR para expresar y secretar la fosfolipasa C de B. cereus (BC-PLC). Esta enzima es un candidato atractivo para el proceso de desgomado enzimático, de aceites consumibles, debido a su capacidad de degradar fosfolípidos. Durante el refinamiento del aceite los fosfolípidos capturan los triacilglicéridos disminuyendo el rendimiento del proceso. Entre las distintas secuencias señales ensayadas, la salvaje de la BC-PLC que utiliza la vía general Sec, fue la que demostró la mayor eficiencia de secreción. A partir de la misma se obtuvieron 0.12 g/L de enzima en sobrenadante de cultivos en Batch de C. glutamicum. En la última etapa del trabajo con el fin de obtener un proceso industrial económicamente viable para la manufactura de la BC-PLC, se evaluó un proceso de Fed-batch a partir de la cepa de C. glutamicum previamente desarrollada para la producción y secreción de esta enzima. Utilizando un medio semi definido y una estrategia de alimentación con flujos escalonados, se alcanzó una concentración final de 5.5 g/L luego de 55 h de proceso. La misma corresponde a una productividad volumétrica de 0.1 g/L.h, siendo hasta el momento el valor más alto reportado de expresión de una enzima heteróloga en esta especie. Finalmente a partir de ensayos de RMN, se demostró que la enzima recombinante fue capaz de hidrolizar completamente los fosfolípidos mayoritarios del aceite crudo de soja fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, demostrando su capacidad para el proceso de desgomado enzimático.

Modificando la dieta de las aves de postura podemos concentrar nutrientes en huevos generando productos funcionales que ayuden a una alimentación más saludable para la humanidad. El objetivo de este trabajo es desarrollar un producto diferencial, huevos fortificados con ácidos grasos omega 3 y selenio orgánico, mediante la demostración práctica comercial y en un esquema de validación de caso tratado versus caso control repetible en el tiempo que permita la certificación de origen. Las evaluaciones se realizaron con dos lotes de gallinas ponedoras en situación de campo comercial ubicadas en galpones convencionales dentro de la dinámica normal de trabajo del establecimiento. Se simularon dietas iso-nutricionales con ingredientes alternativos como fuente de ácidos grasos de acuerdo su matriz nutricional y a su precio relativo. Se realizaron 3 ensayos preliminares para definir la inclusión de ingredientes evaluando el producto final obtenido. A posteriori se realizó la validación de los resultados preliminares. Para ello, se evaluaron dos dietas en gallinas de 29 semanas de vida de la línea Lohmann Brown formuladas en base a las materias primas seleccionadas siguiendo las indicaciones del manual de la línea genética. Como control, tratamiento 1, se utilizó una dieta comercial estándar y al tratamiento 2, dieta fortificada, se formuló con adición de 2,5 % de aceite de lino y 0,37 ppm de selenio orgánico. Se realizaron controles seriados del producto obtenido a partir de los 21, 50 Y 90 días de iniciada la alimentación experimental. La suplementación genero un aumento en los valores de acidos grasos omega n- 3, con incrementos para el acido alfa linolénico de 1,27 % a 5,4 % y de DHA (Docosahexanoico) de 0,99 % a 1,63 %. El EPA (Docosapentaenoico) aumento pero en poca cuantía. Los valores de selenio total en huevo casi se duplicaron, aumentando de concentraciones de 1,6 mg/kg a 3 mg/kg. Los parámetros productivos tanto de % postura, mortandad, consumo no se vieron aparentemente afectados con estos niveles de inclusión (aceite de lino y selenio metionina). Se podría inferir que las futuras evaluaciones de producto sean aprobadas en auditorías internas y externas de calidad diferenciada.

In Santa Fe city, the capital of Santa Fe province, 92.60% of the population has access to drinking water. Nowadays, Aguas Santafesinas S.A. is the company that provides the drinking water and sewer services. The main objective of this thesis was to develop economic and social indicators to achieve a more efficient and equitable water service. For this purpose, a geographic information system was implemented as an integrated and organized tool to store, manipulate, analyze and map the data corresponding to the services coverage area and the different social and economic sectors, and in this way to provide updated information of drinking water service. Relevant data were obtained from users of the service, according to economic activities that they develop. This allowed identify areas with high drinking water consumption and sectors in which water is used as part of the productive processes. Census data were analyzed to evaluate dissatisfy basic needs of both the neighborhoods of the city and the areas that are not linked to the mains. Vulnerable areas with high rates of poverty and risk of waterborne diseases and consequently, with high economic and political cost, were identify.

El presente Trabajo Final Integrador plantea generar una propuesta que permita configurar una adecuada articulación entre teoría y práctica, entendida como proceso dialéctico permanente en la construcción del conocimiento, reformulando la forma en que actualmente se concibe el aprendizaje de la teoría, es decir, aislada en sí misma, y no como sostén y soporte conceptual, referente del aprendizaje de los procedimientos prácticos. El proyecto de intervención que se propone, consiste en la elaboración del diseño de propuestas metodológicas para las clases denominadas “prácticas” de la asignatura Teorías Territoriales, que partan de experiencias de trabajo con el conocimiento que requiera la puesta en juego de las categorías teóricas abordadas en el marco de la misma. Esto supone también la revisión de los modos en que se desarrolla el espacio de las clases “teóricas”, sobre las que se generan asimismo interrogantes y preguntas que desafían a esta integración.

Tesis (Doctor en Física)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Matemática, Astronomía, Física y Computación, 2018.