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El estilbestrol a1 igual que las hormonas esteroides, inhibe selectivamente la cadena de transporte de electrones mitocondrial. La NADH oxidasa es mucho más sensible que la succinato oxidasa, ubicándose inicialmente su sitio de acción en el segmento NADH-(Q,cit b). Se ensayó un fraccionamiento de la cadena, con el objeto de eliminar sectores no involucrados, utilizándose particulas NADH y succinato citocromo c reductasa. En adelante se utilizaron segmentos funcionales, ya que las modificaciones preparativas introducidas por el fraccionamiento, alteraban las respuestas al estrógeno. Se utilizó el segmento NADH-citocromo b. Con el estilbestrol y análogos, se determinaron por espectrofotometría diferencial modificaciones en los niveles de óxido-reducción de los componentes de la región "NADH flavoproteína" en primer lugar citocromo b y en segundo lugar flavoproteínas y otros componentes que contribuyen a las variaciones espectrofotométricas a 465-510 nm. Se determinó que el estilbestrol produce desplazamientos del nivel de estado estacionario de óxido-reducción del citocromo b hacia la oxidación en el sistema aeróbico y coincidentemente una inhibición de la reducción directa en el sistema inhibido por cianuro. Se tituló el efecto del estrógeno y análogos sobre este sistema NADH-citocromo b y se encontró que actúan con la misma especificidad que sobre la respiración mitocondrial, sobre la NADH oxidasa y sobre la NADH-Q reductasa, segmento funcional utilizado posteriormente. Los dimetiléteres (fisiológicamente inactivos) no inhiben la transferencia de electrones. La concentración I (50) para estos efectos fué para Stil: 2 μM. Sobre la NADH-oxidasa midiendo consumo de O2 polarográficamente, se obtuvo un valor 0.75 μM. Se encontró que el ascorbato potencia significativamente la inhibición por estilbestrol. La antimicina A modifica el flujo de electrones hacia el b por acción sobre dicho componente, además del bloqueo que produce a un sitio inmediato posterior. No se observa efecto del Stil cuando el parámetro utilizado es reducción del b en sistema anaeróbico por cianuro más antimicina A. El ascorbato es capaz de antagonizar el efecto del antibiótico y restablecer el efecto de Stil. En el sistema cerrado, con cianuro como inhibidor terminal el citocromo b se mueve libremente en presencia de Stil, en un equilibrio de óxido-reducción sumamente sensible a las variaciones del flujo de electrones desde el NADH. Se ensayó el agregado de Q2 y fumarato. En todos los casos, la reoxidación del citocromo b resulta dependiente de la concentración del estrógeno, en función de su efecto primario: inhibición del transporte a un sitio anterior a b. Por lo tanto b no es el sitio de acción del estrógeno. Queda abierta la cuestión de una posible influencia sobre la conformación del mismo, pero no en relación con el sitio de acción fundamental. El citocromo b, según criterios cinéticos no se encontró alineado en la cadena principal, sino en posición de salto tal como ocurre en general en este tipo de preparaciones no fosforilantes. La reoxidación observada del citocromo b en el sistema cerrado por cianuro se efectuaría a través de una vía paralela a la vía principal, insensible al cianuro. En cuanto a las variaciones espectroscópicas a 465-510 nm (flavoproteínas), en el sistema aeróbico, Stil no modifica la reducción y sí la reoxidación. En sistemas cerrados, inhibidos con cianuro se produce una curva bifásica de reducción y sí el estrógeno se agrega a la flavoproteína ya reducida, se logra un pequeño aunque significativo desplazamiento hacia la oxidación. Agregando ascorbato al medio de reacción la acción de Stil se potencia, al igual que el caso observado del citocromo b y el sector NADH-deshidrogenasa se resuelve en dos componentes de óxido-reducción, uno de bajo potencial del lado sustrato y otro del lado O2 del sitio sensible al Stil. El succinato resulta capaz de reducir a este último, además de su correspondiente flavoproteína. Se ensayó la acción de Stil y análogos sobre el segmento NADH-Q exógena de la cadena respiratoria con idénticos resultados que los comentados para el segmento NADH-citocromo b. Se mantiene el requerimiento de OH fenólicos libres. Las concentraciones inhibidoras 50 %(I50) son para Q2 μM 4.0 (Stil); 7.5 (Hex); 15 (Stil MME)y para Q0 (Stil) 18; (Hex) 15 y (Stil MME) 30. Los dimetiléteres no resultaron activos en ninguno de los sistemas ensayados. Se determinó que la disminución de la actividad enzimática en presencia de Stil es proporcional a la cantidad de enzima presente y depende de la concentración del inhibidor en la mezcla de reacción. La inhibición se revierte por simple dilución de la mezcla enzima/inhibidor. La naturaleza reversible de la inhibición permitió un tratamiento cinético en el estudio de la inhibición sobre el segmento NADH-Q. Se descarta una probable competencia entre Stil y quinona ya que los gráficos (Lineweaver y Burk) obtenidos dan una inhibición no competitiva de Stil con relación al sitio fundamental de entrada de la quinona. Los valores de Ki obtenidos confirman la naturaleza no competitiva de la inhibición en cuanto a la reacción de quinona con la cadena al sitio fundamental de entrada. Se hace un cálculo relativo de las contribuciones respectivas a dos sitios de entrada de la quinona exógena. Se analiza una supuesta competencia que resulta de la aparición de una actividad NADH-Qo insensible al estrógeno a altas concentraciones de quinona. Esta actividad seria la consecuencia de una interacción directa de Qo con el grupo flavina de bajo potencial de la NADH-deshidrogenasa. Como se esperaba, dicha actividad resultó competitiva con respecto al NADH. Se ensaya el efecto de Stil sobre reacciones que involucran directamente a dicho grupo flavina tales como transhidrogenasa y ferricianuro reductasa. El estilbestrol no afecta estas actividades de acuerdo con lo encontrado para la actividad NADH-Qo reductasa a altas concentraciones de la quinona. Se descarta el grupo flavina como sitio de acción del inhibidor. En experimentos de preincubación de la enzima con Stil no directamente comparables se obtienen variaciones de las actividades NADH-citocromo c reductasas y ferricianuro reductasa que se deberían a cambios conformacionales de la NADH deshidrogenasa particulada funcional. En correspondencia se obtiene aumentada reactividad a mercuriales. Todos estos resultados localizan el sitio sensible sobre el sector NADH deshidrogenasa en las proximidades del componente I (excluyendo al grupo flavina), dejando un segundo componente redox del lado oxígeno. La naturaleza de este segundo componente es por el momento discutible ya que se han propuesto dos esquemas diferentes. Se ha ensayado el efecto de Stil y rotenona, resultando aditivas las inhibiciones ó dando respuestas análogas cuando se ensayaron separadamente. Esto indicaría que ambos inhibidores afectarían al mismo componente enzimático, no necesariamente al mismo grupo ya que se encontraron diferencias en presencia de ferricianuro y ascorbato. Pueden suponerse diferentes mecanismos de acción dada la diferencia de estructuras. Se ha postulado un probable mecanismo de acción en lo que respecta a la acción del estilbestrol y análogos, no comprobado, pero que responde a los hechos experimentales observados. El estilbestrol actuaría en este sistema por su capacidad de producir radicales libres H., capaces de ceder electrones a un sustrato orgánico adecuado, grupos disulfuro u otros equivalentes. El agregado de acido ascórbico potenciaría al sistema por regeneración del difenol a partir de la doble quinona, explicándose así la mayor actividad del sistema acido ascórbico-estilbestrol que el del estilbestrol aislado. El monometiléter tendría menor eficacia ya que daría l H. por mol en lugar de dos. El otro radical sería menos reactivo ya que puede estabilizarse por resonancia. Finalmente los dimetiléteres inactivos formarían bisradicales pero no H., cumpliéndose de esta manera la proporcionalidad del efecto con el número de OH fenólicos libres. Los experimentos de preincubación aunque no directamente comparables, sugieren la formación de grupos sulfhidrilos libres ya que se observa aumentada reactividad a mercuriales. El ferricianuro interferiría la reacción a nivel de la enzima compitiendo con el grupo Prot-S, por el electrón cedido por el átomo de hidrógeno. Esta hipótesis sería válida exclusivamente para el estilbestrol y análogos en coincidencia con los requerimientos para su acción estrogénica, no así para los estrógenos naturales en los cuales no se requieren OH fenólicos libres para la inhibición, como lo prueba la acción de los dimetil-derivados del 17 estradiol.

El control estacional de la reproducción a través de la información fotoperiódica se basa en la melatonina como mensajero clave que actúa sobre los componentes del eje hipotalámicohipofisario-gonadal (H.H.G.). Esta hormona es producida en la glándula pineal por la enzima AANAT, y se une a los receptores MT1 y MT2 del hipotálamo, hipófisis y ovario, modulando la secreción de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), la hormona luteinizante (LH) y los esteroides sexuales estradiol y progesterona, respectivamente. La vizcacha de las llanuras de Sudamérica (Lagostomus maximus) posee caracteres reproductivos únicos, como poliovulación natural de hasta 800 oocitos por ciclo estral, inhibición de la atresia folicular, una preñez prolongada con reabsorción embrionaria selectiva y reclutamiento folicular, y una pseudo-ovulación con generación de cuerpos lúteos accesorios durante la gestación. Presenta dos períodos reproductivos al año, siendo el que va de abril a agosto más eficiente que el que abarca de octubre a febrero. El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia del fotoperíodo sobre el funcionamiento del eje H.H.G. de la vizcacha. En primer lugar se determinó la secuencia del ARNm de la prepro-GnRH hipotalámica. Se encontraron dos isoformas que difieren únicamente en el largo de la secuencia 5’-UTR. La variante de GnRH determinada fue mGnRH, y presentó un alto grado de conservación entre caviomorfos emparentados, mientras que la secuencia del péptido asociado a GnRH (GAP) mostró alta una variabilidad. El análisis de la expresión del sistema melatoninérgico a lo largo del ciclo reproductivo de la vizcacha arrojó como resultado la co-localización de GnRH con ambos receptores de melatonina en núcleos hipotalámicos que controlan la reproducción, el área preóptica y los núcleos supraóptico y supraquiasmático. Además, se determinó un incremento de la expresión de AANAT y de los niveles de melatonina conforme progresa la gestación, y los menores niveles de MT1 y MT2 hipotalámicos se registraron en la etapa media de la preñez. Esto indicaría que el sistema melatoninérgico contribuye al mantenimiento de la extensa gestación de la vizcacha. El efecto de la disponibilidad lumínica se determinó en vizcachas en fase folicular y en fase lútea inducida. En el primer caso, la exposición contínua a la luz redujo los niveles séricos de melatonina pero incrementó la expresión de AANAT y en el ovario aumentó el número de folículos antrales y de cuerpos lúteos, los niveles de progesterona y la expresión de MT2 , mientras que la oscuridad constante incrementó los niveles de GnRH y MT1 , los niveles séricos de estradiol y la expresión de MT1 en el ovario. En animales en fase lútea, la luz incrementó los niveles de melatonina y de LH, mientras que la oscuridad estimuló la expresión de AANAT y del MT1 hipotalámico. Estos resultados indicarían que los desajustes fotoperiódicos y hormonales alteran la respuesta del hipotálamo, de la hipófisis y del ovario de manera diferencial en función de la etapa del ciclo estral. La expresión hipotalámica de los receptores de estrógenos α (REα) y β (REβ) también varió con la disponibilidad lumínica; en animales en fase folicular se observó un incremento de los niveles de REα con la luz y un aumento de REβ con la oscuridad. Por otro lado, en animales en fase lútea, la luz constante aumentó la expresión hipotalámica del REβ. En ensayos de pulsatilidad, se observó que la melatonina estimula la secreción de GnRH y de LH en hembras con ovulación inducida. Asimismo, se determinó el efecto inhibitorio del neuroestradiol sobre la secreción de GnRH, mientras que la incubación con melatonina revirtió ese efecto. Por otro lado, la incubación conjunta de melatonina con estradiol o con un agonista del REβ incrementó la liberación de GnRH, sugiriendo que la interacción de melatonina y estradiol resulta necesaria para la actividad del eje H.H.G. En conclusión, este es el primer trabajo que demuestra que en la vizcacha, la regulación de cada órgano a través de la información fotoperódica, así como su respuesta a la melatonina y el contexto hormonal del ciclo estral, confluyen en la modulación del eje reproductivo de manera de ajustar el inicio de la actividad del eje H.H.G. con la estación más favorable para la reproducción. Esta regulación particular, dependiente de la etapa del ciclo estral y de la disponibilidad lumínica, demuestra la relevancia de la información ambiental para llevar a cabo una gestación exitosa y remarca la importancia de esta especie como un valioso modelo de regulación neuroendócrina de la reproducción en mamíferos.

El Hexaclorobenceno (HCB) es un pesticida organoclorado considerado como probable carcinógeno humano. A nivel regional, este contaminante fue encontrado en leche materna de puérperas y en muestras de leche vacuna para consumo humano. Es un tóxico tipo dioxina, y como tal se une al receptor de hidrocarburos aromáticos (RHA), un factor de transcripción que modula procesos tales como apoptosis, proliferación y migración celular. El RHA está presente en el citosol e interacciona con el complejo que contiene a la quinasa de tirosina c-Src. Cuando estos tóxicos se unen al RHA, se pueden desencadenar dos mecanismos: 1) que el complejo tóxico-RHA se transloque al núcleo y module la expresión de genes con elementos de respuesta a dioxinas (DREs) en sus promotores y 2) que se libere la c-Src del complejo citosólico y active receptores de factores de crecimiento, como el Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (HER1). Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que el HCB aumenta el desarrollo y malignidad de tumores mamarios inducidos por N-Nitroso-N-metilurea en rata. En este mismo modelo se observó que el HCB activa la vía de señalización de c-Src/HER1 y disminuye la actividad del receptor de estrógenos (REα) en los tumores mamarios. Por otro lado, en estudios in vitro se demostró que el tóxico incrementa la proliferación y la actividad de c-Src en la línea celular de cáncer de mama MCF-7 (+REα). La tumorigénesis ocurre frecuentemente como resultado de la sobreexpresión de proteínas como el HER1 y la c-Src, que están involucradas en procesos celulares normales. Estas proteínas están usualmente sobreexpresadas en cáncer de mama en estadíos tardíos, y cooperan en la formación y progresión tumoral al favorecer procesos como la proliferación, migración e invasión celular, actividad de metaloproteasas y metástasis. Los objetivos de este trabajo fueron investigar en ensayos in vitro, utilizando una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (-REα) los efectos del tóxico en: a) la migración e invasión celular, b) la actividad y expresión de c-Src y HER1, c) la estimulación de las vías de señalización de ERK1/2, Akt2 y STAT5b, d) la actividad y expresión de metaloproteasas 2 y 9 (MMP2 y 9), y e) si los efectos observados dependen de las vías de señalización en estudio y de la unión del pesticida al RHA. Por otro lado, nos propusimos estudiar en ensayos in vivo, la acción del HCB sobre el crecimiento tumoral y la metástasis en modelos espontáneos y experimentales. Nuestros resultados muestran que el HCB estimula las vías de transducción de señales de c- Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, la migración e invasión celular, la expresión de MMP2 y 9, así como la secreción y actividad de MMP9 en la línea celular MDA-MB-231, in vitro. Observamos que la migración e invasión celular inducida por el tóxico están mediadas por c-Src, HER1 y el RHA. A su vez, la secreción y actividad de la MMP9 estimulada por el HCB depende de HER1 y del RHA, mientras que el aumento en la expresión de MMP2 depende tanto de c-Src, HER1 como del RHA. Asimismo, en un modelo de xenotrasplante con la línea celular MDA-MB-231 en ratones atímicos, demostramos que el pesticida estimula el crecimiento tumoral (0.3 y 3 mg/kg p.c.), mientras que induce la activación de c-Src, HER1, ERK1/2 y STAT5b e incrementa los niveles proteicos de MMP2 y 9 en los tumores mamarios en todas las dosis ensayadas. Por otro lado, en estudios de metástasis espontánea con tumores C4-HI en ratones BALB-c, encontramos que el HCB (0.3 y 3 mg/kg p.c.) aumenta el crecimiento de los tumores mamarios y el número de micrometástasis en hígado y pulmón. En los estudios de metástasis experimental con la línea celular LM3 en ratones BALB-c, el pesticida (3 mg/kg p.c.) incrementa el tamaño de las metástasis en pulmón. En conclusión, en el presente trabajo demostramos por primera vez, que el HCB promueve la migración e invasión celular por las vías de c-Src/HER1/STAT5b y HER1/ERK1/2, así como la expresión de MMP2 y MMP9 de manera dependiente del RHA. A su vez, observamos que el tóxico estimula el crecimiento tumoral y metástasis en pulmón e hígado en modelos experimentales de cáncer de mama.

Fil:Rosenblatt, Rosa. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El objetivo del presente trabajo es evaluar los procesos de cicatrización de los tejidos blandos de la mucosa oral, ante la aplicación en forma tópica de propóleos.

Resumen: El sistema inmunitario está regulado por una compleja red de factores endócrinos e inmunes y su correcto funcionamiento también depende de un adecuado aporte de micronutrientes. Entre estos factores, se ha demostrado que las hormonas tiroideas (HT) influyen en la respuesta inmune ya que, el estado hipotiroideo genera inmunosupresión. Otro factor estrechamente relacionado con la inmunidad es el zinc; de hecho, está bien establecido que su deficiencia induce una disminución de la actividad linfocitaria generando una mayor susceptibilidad a infecciones y al desarrollo tumoral. Sin embargo, el impacto de los bajos niveles circulantes de las HT sobre el metabolismo de este mineral y su posible relación con el sistema inmune aún no ha sido investigado en profundidad. En este trabajo de tesis se estudió el rol inmunomodulador del zinc y parte de los mecanismos bioquímicos involucrados en un modelo murino de hipotiroidismo. Dado que nuestros estudios previos indicaron que tanto el déficit de las HT como del mineral afectan negativamente la actividad de los linfocitos T (LT), se planteó como hipótesis de trabajo que el estado hipotiroideo podría conducir a una deficiencia de zinc, la cual estaría implicada en la alteración de la funcionalidad linfocitaria T. En este sentido, en el modelo murino de hipotiroidismo se encontró una disminución significativa de la cantidad de zinc con respecto a los ratones eutiroideos, tanto en el hueso como en los ganglios linfáticos. También se encontraron alteradas las respuestas proliferativas ante estímulos antigénicos y policlonales. Es interesante resaltar que todos estos efectos pudieron ser restaurados con la administración de T3 como así también con la suplementación de zinc. Sin embargo, el agregado de este oligoelemento no mejoró la respuesta proliferativa severamente reducida por la ausencia de las HT in vitro, que solo pudo ser restaurada por el agregado de T3 al medio de cultivo. Por otro lado, se estudió la actividad linfocitaria T en un modelo murino deficiente en zinc y se encontró que, de manera similar al efecto de un estado hipotiroideo, la deficiencia del mineral generó una disminución de la respuesta proliferativa ante un estímulo mitogénico. Sin embargo, la deficiencia de zinc, a diferencia del hipotiroidismo, también fue capaz de inducir la apoptosis linfocitaria. En ambos modelos se observó una reducida activación de PKC, sin embargo, únicamente en los ratones hipotiroideos se halló disminuida significativamente la actividad total de la enzima. Con respecto a la expresión de PKC se analizaron sus isoformas α, β y θ, y se encontraron afectadas las expresiones de las tres isoenzimas en los ratones DZn (deficientes en zinc), en cambio, en los hipotiroideos solo las isoformas α y θ presentaron una menor expresión mientras que la β no se vio alterada. Es de importancia destacar que todos los efectos observados en los ratones hipotiroideos se lograron revertir tanto con la administración de T3 como de zinc. Sin embargo, los niveles hormonales no pudieron ser restablecidos por la suplementación del mineral...

Meliacina (MA), un limonoide presente en las hojas de la planta Melia azedarach L., es capaz de inhibir in vitro la replicación de un amplio espectro de virus y actuar también como un potencial inmunomodulador. En este trabajo de tesis se demuestra la efectividad de meliacina como antiviral contra el patógeno HSV-2, ya sea inhibiendo la replicación del virus en cultivos celulares o por su efecto terapéutico administrado en forma tópica en un modelo de infección genital en ratones. Se confirma, además, su actividad como inmunomodulador por su efecto sobre macrófagos peritoneales murinos cultivados in vitro. MA aumenta la producción de citoquinas, en especial el TNF-α, cuando es administrada sola o en combinación con distintos inductores y este aumento está relacionado con la activación del factor de transcripción NF-kB. Por otro lado, MA inhibe la replicación del virus HSV-2 en células Vero suministrada sola o en forma aditiva en combinación con IFN-α, IFN-γ o los dos juntos indicando que aumenta la acción de ambas citoquinas. Estos resultados en conjunto sugieren que MA puede ejercer distintos efectos dependiendo del tipo celular sobre el que actúa: como antiviral en células epiteliales y como modulador de la producción de citoquinas en los macrófagos. A estas acciones combinadas podría deberse el efecto terapéutico ejercido en el modelo in vivo.

Esta Tesis se inscribe en el área temática que analiza el accionar del Estado en el proceso de producción social de servicios públicos, en particular, aquellos dirigidos a garantizar el Derecho Humano al Agua y al Saneamiento (DHAS). En la presente investigación, se abordó este problema a partir del estudio del caso de la provincia de Santa Fe, que presenta importantes desigualdades socio-estructurales en cuanto al acceso a los servicios de agua y saneamiento. Nos propusimos analizar si, desde que el Frente Progresista Cívico y Social asumió el gobierno provincial en diciembre de 2007, se lograron superar o se siguieron reproduciendo estas desigualdades y si se configuró una lógica estatal de gestión que garantice el DHAS. Para poder responder a estas cuestiones, partimos de un abordaje del accionar del Estado desde el Enfoque Estratégico Relacional (EER) propuesto por Bob Jessop, que conceptualiza al Estado como una relación social compleja. En las conclusiones identificamos que predominan dos tipos de estrategias selectivas. Por un lado, se llevaron adelante acciones de carácter discrecional y discontinuo, no existiendo un plan sistemático que logre modificar el sistema discriminatorio de gestión de los servicios de agua y saneamiento, más allá de los reclamos y exigencias de los prestadores locales, las cooperativas, los usuarios y los vecinos que no contaban con estos servicios. Por el otro, identificamos que la estrategia predominante impulsada por el gobierno provincial, a través de la empresa pública, consistió en cubrir los costos de los servicios de agua y saneamiento a través de los aumentos tarifarios, en el lugar de priorizar el servicio desde una perspectiva del DHAS. Estas estrategias reforzaron la lógica estatal de gestión de los servicios de agua y saneamiento con los principios propios del modo privatista. Asimismo, respecto a los procesos de toma de decisiones, predominaron los principios propios del modelo racional administrativo.