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Acción del dietilestilbestrol y análogos sobre la cadena de transporte de electrones mitocondrial
María Elisa Diz de Otamendi Andrés Oscar Manuel Stoppani
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El estilbestrol a1 igual que las hormonas esteroides, inhibe selectivamente la cadena de transporte de electrones mitocondrial. La NADH oxidasa es mucho más sensible que la succinato oxidasa, ubicándose inicialmente su sitio de acción en el segmento NADH-(Q,cit b). Se ensayó un fraccionamiento de la cadena, con el objeto de eliminar sectores no involucrados, utilizándose particulas NADH y succinato citocromo c reductasa. En adelante se utilizaron segmentos funcionales, ya que las modificaciones preparativas introducidas por el fraccionamiento, alteraban las respuestas al estrógeno. Se utilizó el segmento NADH-citocromo b. Con el estilbestrol y análogos, se determinaron por espectrofotometría diferencial modificaciones en los niveles de óxido-reducción de los componentes de la región "NADH flavoproteína" en primer lugar citocromo b y en segundo lugar flavoproteínas y otros componentes que contribuyen a las variaciones espectrofotométricas a 465-510 nm. Se determinó que el estilbestrol produce desplazamientos del nivel de estado estacionario de óxido-reducción del citocromo b hacia la oxidación en el sistema aeróbico y coincidentemente una inhibición de la reducción directa en el sistema inhibido por cianuro. Se tituló el efecto del estrógeno y análogos sobre este sistema NADH-citocromo b y se encontró que actúan con la misma especificidad que sobre la respiración mitocondrial, sobre la NADH oxidasa y sobre la NADH-Q reductasa, segmento funcional utilizado posteriormente. Los dimetiléteres (fisiológicamente inactivos) no inhiben la transferencia de electrones. La concentración I (50) para estos efectos fué para Stil: 2 μM. Sobre la NADH-oxidasa midiendo consumo de O2 polarográficamente, se obtuvo un valor 0.75 μM. Se encontró que el ascorbato potencia significativamente la inhibición por estilbestrol. La antimicina A modifica el flujo de electrones hacia el b por acción sobre dicho componente, además del bloqueo que produce a un sitio inmediato posterior. No se observa efecto del Stil cuando el parámetro utilizado es reducción del b en sistema anaeróbico por cianuro más antimicina A. El ascorbato es capaz de antagonizar el efecto del antibiótico y restablecer el efecto de Stil. En el sistema cerrado, con cianuro como inhibidor terminal el citocromo b se mueve libremente en presencia de Stil, en un equilibrio de óxido-reducción sumamente sensible a las variaciones del flujo de electrones desde el NADH. Se ensayó el agregado de Q2 y fumarato. En todos los casos, la reoxidación del citocromo b resulta dependiente de la concentración del estrógeno, en función de su efecto primario: inhibición del transporte a un sitio anterior a b. Por lo tanto b no es el sitio de acción del estrógeno. Queda abierta la cuestión de una posible influencia sobre la conformación del mismo, pero no en relación con el sitio de acción fundamental. El citocromo b, según criterios cinéticos no se encontró alineado en la cadena principal, sino en posición de salto tal como ocurre en general en este tipo de preparaciones no fosforilantes. La reoxidación observada del citocromo b en el sistema cerrado por cianuro se efectuaría a través de una vía paralela a la vía principal, insensible al cianuro. En cuanto a las variaciones espectroscópicas a 465-510 nm (flavoproteínas), en el sistema aeróbico, Stil no modifica la reducción y sí la reoxidación. En sistemas cerrados, inhibidos con cianuro se produce una curva bifásica de reducción y sí el estrógeno se agrega a la flavoproteína ya reducida, se logra un pequeño aunque significativo desplazamiento hacia la oxidación. Agregando ascorbato al medio de reacción la acción de Stil se potencia, al igual que el caso observado del citocromo b y el sector NADH-deshidrogenasa se resuelve en dos componentes de óxido-reducción, uno de bajo potencial del lado sustrato y otro del lado O2 del sitio sensible al Stil. El succinato resulta capaz de reducir a este último, además de su correspondiente flavoproteína. Se ensayó la acción de Stil y análogos sobre el segmento NADH-Q exógena de la cadena respiratoria con idénticos resultados que los comentados para el segmento NADH-citocromo b. Se mantiene el requerimiento de OH fenólicos libres. Las concentraciones inhibidoras 50 %(I50) son para Q2 μM 4.0 (Stil); 7.5 (Hex); 15 (Stil MME)y para Q0 (Stil) 18; (Hex) 15 y (Stil MME) 30. Los dimetiléteres no resultaron activos en ninguno de los sistemas ensayados. Se determinó que la disminución de la actividad enzimática en presencia de Stil es proporcional a la cantidad de enzima presente y depende de la concentración del inhibidor en la mezcla de reacción. La inhibición se revierte por simple dilución de la mezcla enzima/inhibidor. La naturaleza reversible de la inhibición permitió un tratamiento cinético en el estudio de la inhibición sobre el segmento NADH-Q. Se descarta una probable competencia entre Stil y quinona ya que los gráficos (Lineweaver y Burk) obtenidos dan una inhibición no competitiva de Stil con relación al sitio fundamental de entrada de la quinona. Los valores de Ki obtenidos confirman la naturaleza no competitiva de la inhibición en cuanto a la reacción de quinona con la cadena al sitio fundamental de entrada. Se hace un cálculo relativo de las contribuciones respectivas a dos sitios de entrada de la quinona exógena. Se analiza una supuesta competencia que resulta de la aparición de una actividad NADH-Qo insensible al estrógeno a altas concentraciones de quinona. Esta actividad seria la consecuencia de una interacción directa de Qo con el grupo flavina de bajo potencial de la NADH-deshidrogenasa. Como se esperaba, dicha actividad resultó competitiva con respecto al NADH. Se ensaya el efecto de Stil sobre reacciones que involucran directamente a dicho grupo flavina tales como transhidrogenasa y ferricianuro reductasa. El estilbestrol no afecta estas actividades de acuerdo con lo encontrado para la actividad NADH-Qo reductasa a altas concentraciones de la quinona. Se descarta el grupo flavina como sitio de acción del inhibidor. En experimentos de preincubación de la enzima con Stil no directamente comparables se obtienen variaciones de las actividades NADH-citocromo c reductasas y ferricianuro reductasa que se deberían a cambios conformacionales de la NADH deshidrogenasa particulada funcional. En correspondencia se obtiene aumentada reactividad a mercuriales. Todos estos resultados localizan el sitio sensible sobre el sector NADH deshidrogenasa en las proximidades del componente I (excluyendo al grupo flavina), dejando un segundo componente redox del lado oxígeno. La naturaleza de este segundo componente es por el momento discutible ya que se han propuesto dos esquemas diferentes. Se ha ensayado el efecto de Stil y rotenona, resultando aditivas las inhibiciones ó dando respuestas análogas cuando se ensayaron separadamente. Esto indicaría que ambos inhibidores afectarían al mismo componente enzimático, no necesariamente al mismo grupo ya que se encontraron diferencias en presencia de ferricianuro y ascorbato. Pueden suponerse diferentes mecanismos de acción dada la diferencia de estructuras. Se ha postulado un probable mecanismo de acción en lo que respecta a la acción del estilbestrol y análogos, no comprobado, pero que responde a los hechos experimentales observados. El estilbestrol actuaría en este sistema por su capacidad de producir radicales libres H., capaces de ceder electrones a un sustrato orgánico adecuado, grupos disulfuro u otros equivalentes. El agregado de acido ascórbico potenciaría al sistema por regeneración del difenol a partir de la doble quinona, explicándose así la mayor actividad del sistema acido ascórbico-estilbestrol que el del estilbestrol aislado. El monometiléter tendría menor eficacia ya que daría l H. por mol en lugar de dos. El otro radical sería menos reactivo ya que puede estabilizarse por resonancia. Finalmente los dimetiléteres inactivos formarían bisradicales pero no H., cumpliéndose de esta manera la proporcionalidad del efecto con el número de OH fenólicos libres. Los experimentos de preincubación aunque no directamente comparables, sugieren la formación de grupos sulfhidrilos libres ya que se observa aumentada reactividad a mercuriales. El ferricianuro interferiría la reacción a nivel de la enzima compitiendo con el grupo Prot-S, por el electrón cedido por el átomo de hidrógeno. Esta hipótesis sería válida exclusivamente para el estilbestrol y análogos en coincidencia con los requerimientos para su acción estrogénica, no así para los estrógenos naturales en los cuales no se requieren OH fenólicos libres para la inhibición, como lo prueba la acción de los dimetil-derivados del 17 estradiol.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1969 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1969
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