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La soja (Glycine max L. Merr.) es actualmente, el principal cultivo agrícola de la zona pampeana y el más importante rubro de exportación en Argentina. La soja es afectada por diversas enfermedades, las cuales pueden reducir el rendimiento entre un 8 a un 10% con un máximo del 30%. Dentro de las diversas enfermedades que afectan al cultivo de soja se encuentran las denominadas Enfermedades de Fin de Ciclo (EFC) que aumentan su intensidad después del estado de desarrollo R3-4. En marzo de 2002, la roya asiática de la soja (RAS) causada por el patógeno biotrófico Phakopsora pachyrhizi, fue detectada por primera vez en la provincia de Misiones, incorporándose al complejo de EFC en Argentina, que por sus características distintivas de fácil propagación y de alta esporulación, en menos de 21 días llega a afectar el 90% del cultivo y puede reducir el rendimiento significativamente, convirtiéndola en la enfermedad más temidas por los productores de soja en el mundo. Esta tesis hace referencia sobre la virulencia de P. pachyrhizi en Argentina, mediante la recolección de poblaciones de uredinios y urediniosporas de roya en diferentes regiones del país, Cerro Azul (Misiones), Ledesma (Jujuy), Rosario (Santa Fe) y Pergamino (Buenos Aires) durante el ciclo 2011/2012. Para determinar la virulencia patogénica se utilizaron 16 variedades diferenciales (V.D.) de soja que presentan distintos genes de resistencia, ayudando a identificar la presencia de virulencia de P. pachyrhizi en Argentina. Los resultados de este trabajo han demostrado diferente virulencia de P. pachyrhizi en Argentina entre los cuatro aislamientos de P. pachyrhizi analizados. Diversos trabajos sugieren que el locus Rpp5 que se encuentra en la V.D. Shiranui (PI 200526) es el que más contribuyó para todos los caracteres de resistencia y que puede ser considerado como el principal factor para la resistencia a P. pachyrhizi. En esta experiencia se ha encontrado diferencia en la virulencia de los aislamientos en P. pachyrhizi, entre las diferentes provincias de Argentina, durante el año 2012. Ninguna de las Variedades Diferenciales (V.D.) fueron resistentes a los cuatro aislamientos analizados. La V.D. Shiranui (PI 200526) que contiene el gen Rpp5 presentó reacción de susceptibilidad frente al aislamiento de Pergamino (Buenos Aires). Las variedades PI 594767 A y PI 587855 de genes desconocidos, resistente a todos los aislamientos anteriores analizados en el país, resultaron ser susceptible al aislamiento de Cerro Azul (Misiones) y la V.D. PI 587855 también susceptible al aislamiento de Pergamino (Buenos Aires) en el año 2012.

El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la epidemiología molecular de la infección por HBV y HDV, determinar los genotipos y analizar la variabilidad genética de los aislamientos detectados en distintas poblaciones y regiones de Argentina. Se estudiaron donantes de sangre de Buenos Aires y Misiones, y Amerindios de cuatro comunidades originarias: Mbyá-guaraníes (Misiones), Kollas (Jujuy), Sagua-Huarpes (San Juan) y Wichis (Formosa). Las cifras de prevalencia para el HBsAg variaron de 0,2 a 0,73% para donantes y de 1,4 a 1,7% para originarios. El análisis filogenético de las secuencias de HBV determinó la circulación en ambas poblaciones de los subgenotipos A2, B2, C2, D3, D3/D6, F1b y F4. En las secuencias de HBV se detectaron mutaciones en regiones regulatorias asociadas a mayor severidad de la enfermedad hepática y en las proteínas del pre-Core (productoras de fenotipo e minus), del Core (dentro de los epítopes para linfocitos T), preS1-S2 (posiblemente asociadas a infección oculta por HBV), S (mutantes de escape a la respuesta inmune humoral), P (asociadas a resistencia antiviral) y X (implicadas en el desarrollo del hepatocarcinoma celular). Se describe por primera vez la circulación del genotipo 1 de HDV en donantes de sangre de Buenos Aires y en originarios de Misiones; con el interesante hallazgo de la detección de este virus en casos de infección oculta por HBV. Además, se identificaron mutaciones en el antígeno Delta que podrían justificar la no detección de anticuerpos anti-HDV (infección “oculta”) en estos casos.

En las últimas etapas del ciclo de replicación de los virus de immunodeficiencia de simios (SIV), ocurre el ensamblado de las partículas virales en la membrana plasmática de las células infectadas. Durante la morfogénesis de los viriones se produce la incorporación de la glicoproteína viral de envoltura (Env), proceso que es esencial para la infectividad viral. La glicoproteína Env se sintetiza como un precursor proteico, el cual es clivado en las subunidades de superficie y transmembrana por proteasas celulares. A diferencia de otros retrovirus, SIV posee una proteína transmembrana con un dominio citoplasmático (CD) particularmente largo, de 164 residuos. Para investigar el rol que cumple el CD en la incorporación de Env a las partículas virales y en la infectividad, se generaron y caracterizaron glicoproteínas Env mutantes llevando pequeñas deleciones internas de 4 a 7 aminoácidos en el CD o bien acortamientos progresivos de 20 residuos desde su extremo carboxilo. Las mutaciones introducidas no tuvieron efecto alguno sobre la síntesis, procesamiento y expresión en la superficie celular de la glicoproteína Env. Sin embargo, las deleciones internas que afectaron el tercio carboxilo terminal del CD de Env inhibieron significativamente tanto la incorporación de Env a viriones como la infectividad viral. El mismo fenotipo defectivo fue observado al remover 20 a 100 aminoácidos del extremo carboxilo del CD. En cambio, glicoproteínas Env con CDs de 44 o 24 aminoácidos se incorporaron a viriones en forma más eficiente que la proteína Env salvaje, e incrementaron no menos de 10 veces la infectividad viral respecto de la de viriones llevando la Env salvaje. Por otro lado, se realizó un estudio de evolución forzada de un virus mutante llevando una deleción interna en el CD de Env que bloquea la capacidad replicativa del virus. La propagación durante períodos prolongados de tiempo de células linfoideas infectadas con este virus mutante condujo a la selección de poblaciones virales revertantes. En estos virus, el fenotipo defectivo causado por la deleción original fue revertido por mutaciones puntuales en el gen env que acortaron el CD a una longitud de 52 o 48 aminoácidos. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis demuestran cómo variaciones en la longitud del CD de la glicoproteína Env de SIV modulan las funciones virales mediadas por Env.

La capacidad de los baculovirus de producir epizootias y regular el tamaño de las poblaciones de insectos ha sido aprovechada para la sustitución de insecticidas tóxicos de amplio espectro en programas de manejo integrado de plagas. En tal sentido, numerosos baculovirus han sido desarrollados como bioinsecticidas y registrados para su comercialización. Sin embargo, salvo ciertas excepciones, el uso de baculovirus como alternativa de control de plagas se ha enfrentado con una serie de inconvenientes. En primer lugar, en la mayoría de los países, su costo de producción es elevado en comparación con el de los insecticidas químicos. En segundo lugar, la velocidad de acción de los insecticidas virales es baja (4-8 días). Por último, la producción del virus sobre larvas del hospedador requiere de un estricto control de calidad tanto de la cría de insectos como del inoculo, factor que a menudo no ha sido tenido en cuenta. Parte de estas desventajas podrían solucionarse utilizando estrategias de modificación genética del genoma viral. Es con esta premisa que en el laboratorio se abordó la caracterización bioquímica y molecular de un aislamiento viral (EpapGV) obtenido en Oliveros (Santa Fe) con alta virulencia para el insecto plaga de la soja Epinotia aporema o “barrenador de los brotes”. Se construyó una genoteca del DNA viral de EpapGV que sentó las bases para los estudios posteriores relativos al análisis del papel que juegan los diferentes factores virales en la patogenicidad en E. aporema. Específicamente se ha estudiado al gen egt y a su producto ecdisona glicosil transferasa (EGT). La elección de este gen se basó fundamentalmente en dos aspectos: la observación de un retraso en la muda de la larva de E. aporema infectada con EpapGV y la similitud de estas observaciones con otras informadas para infecciones virales producidas por NPVs, las cuales han sido asociadas a la presencia del gen egt. Los resultados obtenidos a partir de estos estudios permitieron determinar que el gen egt de EpapGV se encuentra bajo la acción de un promotor temprano y que su producto de expresión efectivamente modifica a la hormona ecdisona. Asimismo, se inició el estudio del gen de helicasa relacionado con la especificidad de rango de huéspedes. Se encontraron dos genes, helicasa I y II. Se pudo detectar que Helicasa I posee motivos asociados a su función de desenrrollamiento sobre el DNA mientras que Helicasa II posee motivos AAA-ATPasa, encontrados en la super familia 1 de las RNA helicasas virales, asociados al mantenimiento de múltiples funciones celulares. Finalmente se desarrolló un método de control de calidad de los stocks virales que formarán parte de la formulación del bioinsecticida. Se desarrolló un método de multiplex PCR que permite identificar a EpapGV en formulados bioinsectidas de manera específica y sensible. Los patrones obtenidos para este virus pueden diferenciarse de los obtenidos para un granulovirus (CpGV) y un poliedrovirus (AgMNPV). Los resultados alcanzados sobre caracterización de EpapGV contribuyeron al conocimiento de la interacción insecto-patógeno y aportaron información básica de importancia en el futuro diseño de estrategias de mejoramiento genético del virus. Además, el desarrollo de las técnicas moleculares aplicadas en el control de calidad complementa los requisitos imprescindibles para el registro del virus como insecticida biológico.

El virus del papiloma humano, es un grupo de pequeños virus epiteliotrópicos de doble cadena de ADN, al alcanzar las células basales, puede permanecer en forma episomal en estado latente o bien abandonar esa latencia y aprovechar la diferenciación celular, para comenzar su replicación. Las especies que infectan las mucosas orales y anogenitales pueden ser de alto y bajo riesgo. En la actualidad al tener conocimiento de que su vía de transmisión no es solo sexual, si no que se puede dar por transmisión horizontal y vertical, ha llevado a que el VPH tome gran interés en la población de niños y adolescentes. Se destaca en los últimos años el aumento de su prevalencia y la asociación entre las lesiones que desarrolla y el cáncer. La prevalencia de esta patología en niños y adolescentes es cada vez mayor y a edades mas tempranas. Gran cantidad de manifestaciones clínicas, tanto en boca como en genitales, se presentan en esta etapa, el inicio de las relaciones sexuales se dan durante este período y la inmunización se debe realizar en este momento de la vida de los individuos.

El virus de la fiebre aftosa pertenece a la familia Picornaviridae y es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de gran importancia económica, que afecta a los animales de pezuña hendida. Algunos de los aislamientos pertenecientes al serotipo O originarios de Asia fueron clasidicados en tres topotípos, el topotipo Catay ( con una deleción en los aminoácidos 93-102 de la proteína 3A) y el topotipo Sudeste Asiático (con deleción en los aminoácidos 133-143 de la proteína 3A) y el topotipo Panasiático (sin deleción). Con algunos de estos aislamientos se contruyeron virus quimeras con las diferentes formas de 3A descriptas e inclusive virus con una deleción aún mayor, entre los aminoácidos 63-144. Se construyeron tambipen virus quimeras con una sola proteína 3B. Tanto los aislamientos naturales como los virus quimeras fueron evaluados in vitro, en células derivadas de bovino y porcino, e in vivo, en porcinos. Estudios de efectividad en células y en porcinos, así como estudios en virulencia, patogenia y transmisibilidad en porcino nos permiten concluir que los virus pertenecientes al topotico Catay, aunque atenuados para el bovino, son altamente virulentos para el procino y prodijeron una enfermedad aguda y sincrónica, de transmición rápida y efectiva. Mientras que los virus pertenecintes al topotipo Panasiático mostraron similar replicación en ambos tipos celulares, su comportamiento in vivo fue más heterogéneo, no fueron tan virulentos y produjeron una enfermedad más atenuada. Los virus con una sola proteína 3B mostraron una inefectividad reducida en células de porcino y nula en células de bovino, mientras que prodijeron una enfermedad suave en porcino.

Fil:Alonio, Lidia Virginia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Castilla, Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Con el fin de facilitar la presentación y lectura, la información contenida en la presente Tesis se organizó modularmente en partes y capítulos, y en un caso en secciones. En la Parte I, que comprende los Capítulos 1 a 4, se presenta una introducción a los virus con genoma de RNA, a la familia Arenaviridae y, especialmente, al virus Junín. En las Partes II (Capítulos 5 a 8) y III (Capítulos 9 a 11), se presentan sintéticamente los resultados y aspectos informativos más elementales derivados del clonado, secuenciamiento y análisis estándar de la información de secuencia obtenida. En el Capítulo 8, en particular, se presentan los resultados obtenidos en ensayos de expresión de la proteína de la nucleocápside de la cepa MC2 del virus Junín en el sistema baculovirus-células de insecto y su empleo en experimentos de replegamiento, ELISA, unión a RNA y unión a Zn+2; algunos de los resultados presentados en este capítulo dieron origen a planes de Tesis concretados en el IBBM en los últimos años. Estas dos partes fueron pensadas sólo como presentación de la información, razón por la cual carecen de una discusión y de conclusiones generales. En la Parte IV, que comprende los Capítulos 12 a 14, se presenta el análisis comparativo de los RNAs S de los arenavirus y de las proteínas codificadas en los mismos, con las discusiones correspondientes. En particular, el Capítulo 12, que corresponde a los ácidos nucleicos de arenavirus, se subdividió en tres secciones. En los primeros seis títulos de la Sección I se detalla un análisis bioinformático que ahonda en aspectos informativos no estándar de las moléculas de ácidos nucleicos per se, mientras que en los últimos tres títulos se presentan aspectos estructurales de los RNAs S de arenavirus y la posible correlación con los mecanismos de recombinación. En la Sección II se discute sobre la variabilidad en los extremos de RNAs y el posible origen de los mismos y en la Sección III se reseña una análisis que correlaciona los RNAs S, el rRNA 28S y las proteínas de la nucleocápside (N). Por otra parte, en los Capítulos 13 y 14 se discute acerca del análisis de las estructuras primarias y secundarias de las glicoproteínas y las nucleoproteínas de arenavirus, respectivamente. En la Parte V, que comprende los Capítulos 15 y 16, se detallan los materiales empleados y se describen los métodos utilizados en el desarrollo de este trabajo. En la Parte VI, que comprende los Capítulos 17 y 18, se reseñan algunos desarrollos que se realizaron durante el trabajo de Tesis. En el Capítulo 17 se muestra el diseño y puesta a punto de tres técnicas experimentales y en el Capítulo 18 se presenta el diseño y programación de varios algoritmos que han permitido realizar la mayor parte de los análisis computacionales presentados en los capítulos anteriores. En la Parte VII se incluyen las conclusiones generales de la Tesis, destacando algunos de los aspectos más relevantes del trabajo. En la Parte VIII se lista la bibliografía leída y utilizada durante todos estos años de trabajo. Finalmente, la Parte IX incluye una serie de apéndices con información y/o breves análisis matemáticos que consideré importante incluir.

El objetivo principal de esta tesis es ampliar los conocimientos sobre el diagnóstico, la prevalencia y la epidemiología molecular del HTLV-1/2 y brindar datos que permitan un diagnóstico más eficiente en Argentina. Con tal fin, se analizaron equipos de tamizaje frecuentemente utilizados en nuestro país, y se demostró la importancia de confirmar los resultados seroindeterminados por WB mediante una técnica molecular para obtener un diagnóstico final. En cuanto a la prevalencia de HTLV-1/2 en las distintas poblaciones estudiadas, hemos demostrado que ambos virus se encuentran circulando con prevalencias altas en poblaciones de riesgo y bajas en las de no riesgo en la mayor parte del país, manteniendo la característica epidemiológica de su restricción étnico/geográfica ya demostrada. Es por ello, que debemos considerar también el riesgo de infección en aquellos casos que presenten antecedentes de riesgo como, por ejemplo, haber nacido, ser descendientes o haber sido pareja sexual de individuos provenientes de áreas endémicas. Mediante estudios filogenéticos se demostró que todas las cepas estudiadas del HTLV-1, resultaron subtipo a subgrupo A, mientras que para el HTLV-2 el subtipo b fue el mayoritario ambos en poblaciones no originarias sugiriendo que estos subtipos han sido introducidos en nuestra población caucásica a partir de la interacción con comunidades originarias.