Catálogo de publicaciones

Las talasemias son un grupo heterogéneo de anemias hereditarias, tanto desde el punto de vista molecular como clínico y hematológico, caracterizadas por la disminución o total ausencia de síntesis de una o varias cadenas de globina. La cadena sintetizada en menor cuantía es, por lo demás rigurosamente normal en su composición y estructura. Se trata, por tanto, de desórdenes cuantitativos, en oposición a las alteraciones cualitativas denominadas hemoglobinopatías. La mayoría de los defectos génicos responsables de las -talasemias son la mutación de un único nucleótido que afecta a uno de los diferentes procesos moleculares involucrados en la expresión del gen  globina: transcripción, procesamiento del pre-ácido ribonucleico mensajero (pre-RNAm) y traducción. La intensa actividad desarrollada en la década de los 80 y el gran avance de las técnicas de Biología Molecular para establecer las bases moleculares de las talasemias, han demostrado que las lesiones genéticas no pueden ser detectadas con los métodos analíticos convencionales. Las -talasemias son una de las alteraciones hereditarias más frecuentes y se encuentran distribuidas por todo el mundo. La alta frecuencia de los genes  talasémicos se debe probablemente a la protección frente a la malaria que proporciona el estado heterocigota. En Argentina los estudios epidemiológicos, aunque escasos y fragmentarios, han evidenciado la presencia de las -talasemias con cierta heterogeneidad fenotípica. Debido a todo esto, se diseñó el presente estudio para optar al grado de Doctora en Bioquímica, y se marcaron los siguientes objetivos: 1- Determinar la heterogeneidad molecular de la -talasemia que nos permita dar el adecuado asesoramiento genético y establecer el consiguiente diagnóstico prenatal. 2- Interrelacionar el fenotipo de la mutación responsable de la -talasemia (+ ó 0) con parámetros hematológicos. 3- Tratar de establecer la causa de las diferencias fenotípicas observadas en portadores talasémicos que presentan la misma mutación. Con el objetivo de obtener nuestros valores normales se realizó el estudio de un grupo control constituido por 150 individuos normales (59 varones, 70 mujeres y 21 niños), considerados normales al tener los valores hematimétricos dentro de los rangos normales, morfología de serie roja normal y no presentar ninguna alteración en el estudio de hemoglobinas por electroforesis. Desde 1996 hasta fines de 2000, se han estudiado 124 individuos talasémicos mayores de un año, no relacionadas entre sí, originarios de Rosario y su zona de influencia. En unos casos se trató de sujetos asintomáticos o con leves manifestaciones clínicas que acudieron a nuestro Servicio (Servicio de Hematología- Sala 9- Hospital Provincial del Centenario) por haber presentado microcitosis en un análisis de sangre rutinario coincidiendo con un ingreso quirúrgico, proceso infeccioso banal o chequeo de salud, y otros eran pacientes diagnosticados como portadores de  talasemia con anterioridad. Durante la realización de este trabajo de tesis fue derivado a nuestro Servicio un paciente de 15 meses (hijo de un matrimonio de portadores incluidos en este estudio) por presentar un cuadro de anemia severa con requerimiento transfusional. A las muestras mencionadas anteriormente se les practicaron las siguientes determinaciones: 1. Estudio hematimétrico: Cuantificación de hematíes, hemoglobina y hematocrito. Determinación de los parámetros VCM, HCM, CHCM Observación de la morfología eritrocitaria Recuento de reticulocitos 2. Metabolismo férrico: Dosaje de hierro y capacidad de saturación de la siderofilina Determinación de ferritina sérica 3. Estudio de hemoglobinas Electroforesis de hemoglobinas en acetato de celulosa a pH 9,0 Electroforesis de hemoglobinas en Agar-citrato a pH 6,1 Cuantificación de hemoglobina Fetal Test de cuerpos de inclusión Test de inestabilidad térmica Test de anaerobiosis 4. Estudios moleculares Identificación de la mutación responsable de -talasemia Presencia de la deleción -3,7 Presencia de la triplicación de genes alfa (anti 3,7) en aquellos individuos en los que el dosaje de Hb estuvo por debajo de 11 g/dl (varones y mujeres  50 años) y por debajo de 10,5 g/dl (mujeres  50 años y niños), estudiándose entonces 48 individuos (7 varones, 2 mujeres  50 años, 30 mujeres  50 años y 9 niños). Para la identificación molecular de la mutación responsable de -talasemia se empleó la técnica de PCR-ARMS y para detectar la presencia de la alfa deleción y de la alfa triplicación se empleó PCR- alelo específica. Un individuo presentó la deleción -3,7, dos presentaron triplicación de genes alfa ( anti3,7), dos fueron portadores de una  talasemia y uno mostró una doble heterocigosis tal/HbS. Estos seis individuos fueron por lo tanto excluidos del grupo en el que se estudió la interrrelación de los parámetros hematológicos con el genotipo -talasémico y en ellos se analizaron las diferencias fenotípicas al compararlos con portadores -talasémicos que presentaron la misma mutación. Se identificaron entonces, 118 sujetos no emparentados, portadores de  talasemia heterocigota, con metabolismo de hierro normal y sin asociación a ninguna otra de las patologías de la hemoglobina estudiadas. Los dos individuos portadores de  talasemia fueron excluidos del grupo en el que se analizó la heterogeneidad molecular de la  talasemia ya que estas talasemias presentan, en su gran mayoría, deleciones y no mutaciones puntuales que fue lo investigado en este trabajo, quedando por lo tanto constituido este grupo por 122 individuos. La experiencia en el Mediterráneo ha mostrado que los programas preventivos de talasemia basados en la detección de portadores heterocigotas y el consejo genético no son efectivos para reducir la incidencia de nacimientos de niños con -talasemia mayor. El diagnóstico prenatal de la -talasemia ha dado una nueva dimensión a la prevención de la misma, pero para poder llevarlo a cabo, lo más importante es tener conocimiento de las mutaciones y su incidencia. Este estudio intenta ofrecer un cuadro general de la genética molecular de la talasemia en nuestra área. El 92,6 % de los alelos se identificaron con las 6 mutaciones diferentes estudiadas, superponible a los datos encontrados en otros países de la cuenca Mediterránea como Italia, donde el 88% se distribuye entre CD39 (40,1%), IVS-I-ntl10 (23,0%), IVS-I nt l (10,2%), IVS-I-nt 6 (9,9%) y IVS-II-nt 745 (5,0%), superponible también a lo publicado por Brasil en el estado de San Pablo donde la mayoría de los portadores de -talasemia son descendientes de italianos y con cuatro mutaciones, CD39 (45 %), IVS-I-ntl10 (14 %), IVS-I-nt6 (5 %) y IVS-I-nt 1 (4 %) identificaron el 97,1 % de los cromosomas talasémicos. En España, Villegas y col, lograron identificar el 86,6 % de los alelos investigando cinco mutaciones IVS I-1, IVS I-6, IVS I-110, CD39 y CD8/9 (+G). En nuestro estudio, la mutación más frecuente se correspondió con el CD39, la cual fue identificada en el 57,4 % de los alelos. Esta también resultó ser la mutación más frecuente en Italia, España, Francia y Portugal. La segunda mutación en importancia correspondió a la IVS I-110 que representó el 22,1 % del total identificado siendo ésta la segunda en importancia también en Italia y Francia (23,2 y 25,7 % respectivamente), no así en España y Portugal donde la IVS I-6 (15,5 %) y la IVS I-1 (32,9 %) ocuparon el segundo lugar respectivamente. Cabe destacar que la frecuencia de la mutación IVS I-6 que representa el 10,3 % en Italia y el 15,5 % en España, en este estudio fue hallada sólo en el 2,5 % de los casos. El resto de mutaciones encontradas, IVS I-1 (4,9 %), IVS II-1 (1,6%) e IVS II-745 (4,1 %), representó el 10,6 %. Este estudio viene a confirmar que a pesar de la elevada heterogeneidad molecular de la -talasemia, un grupo de mutaciones, relativamente pequeño, es el responsable de la mayoría de los casos de -talasemia en nuestra área, y su incidencia, en general, superponible con las descritas en otros países de la cuenca Mediterránea, teniendo fundamentalmente en cuenta los datos publicados por Italia ya que el origen de nuestros pacientes fue 89,3% italianos, 9,8 % españoles y 0.9 % griego. Si comparamos nuestros datos con los publicados por nuestro país, vemos que Varela y col logró identificar en una población de Bs. As. de origen Mediterráneo, el 90 % (similar a nuestro porcentaje) de los alelos talasémicos estudiando cuatro mutaciones (CD39, IVS-I-nt l10, IVS-I-nt 6 y IVS-I-nt 1). Estos mismos autores cuando posteriormente estudiaron las mismas seis mutaciones que buscamos en nuestro trabajo lograron también identificar el 90 % de sus 109 portadores beta talasémicos. Si bien las mutaciones más frecuentes resultaron ser CD39 (39,45 %) e IVS-I-nt-l10 (23,85 %), el porcentaje de la primera fue distinto del nuestro probablemente debido a una mayor proporción de descendientes del norte de Italia presentes en nuestra población. La misma consideración puede hacerse con respecto a los valores de las mutaciones más predominantes publicados por Soria y col en una población de Córdoba. Nuestra mayor concordancia es con el trabajo publicado por Roldán y col. que en una población de Bs. As, encontraron que los cuatro defectos más comunes (CD 39, 47%; IVS-I nt 110, 22,4%; IVS-I nt 1, 9,4% y IVS-I nt 6, 5,9%) se detectaron en el 84,7% de los alelos talasémicos. Debido a que no fue posible poner de manifiesto la mutación en el 7,4 % de los casos y a la gran variedad de asociaciones -talasemia y hemoglobinopatías concluimos de la complejidad del estudio molecular en nuestros pacientes con -talasemia. Por ello los estudios de Biología Molecular son trascendentales para dar el adecuado consejo genético y establecer el diagnóstico prenatal. Entre los pacientes en los que no se pudo detectar la mutación responsable del fenotipo  talasémico se hallaron cuatro hombres, cuatro mujeres y un niño. Todos eran de origen italiano, excepto uno, griego. Todos presentaron fenotipo hematológico dentro de lo esperado para pacientes portadores de  talasemia. Los niveles de Hb A2 estuvieron por encima del 4% y los de Hb F por debajo del 5%. Los valores del metabolismo férrico y de ferritina sérica fueron normales. Cuando se estudiaron por PCR-ARMS las seis mutaciones anteriormente mencionadas, todos presentaron banda de amplificación con el oligonucleótido normal, no así con el mutado. Ningún paciente presentó asociación con alfa talasemia (deleción 3,7 kb) ni con triplicación de genes alfa (alfa alfa alfa anti 3,7 kb). En estos casos sería necesario investigar la presencia de mutaciones muy poco frecuentes en nuestro medio (menos del 2 %) o proceder a la secuenciación del gen beta. También tener en cuenta que hay estudios poblacionales que han mostrado que aproximadamente el 1% de los genes beta talasémicos en el mundo permanecen sin caracterizar a pesar de un exhaustivo análisis de los genes  globina incluyendo las regiones flanqueantes. Se ha postulado que en estos casos la mutación puede ser hallada en el upstream  LCR o en la región enhancer 700-1000 pb 3´del gen  globina. Sin embargo, en varias familias, análisis de ligamiento, demostraron que el fenotipo -talasémico se segrega independientemente del cluster  globina, implicando que la determinante genética puede actuar en trans. Para el estudio comparativo de los genotipos talasémicos 0 y + en hombres, mujeres  50 años y  de 50 años y niños, se aplicó la técnica de Análisis de la Variancia a dos criterios de clasificación (Talasemia y grupo) para seis variables de interés, correspondiente a un diseño no balanceado dado que los tamaños de las muestras eran diferentes para las combinaciones de Talasemia y Grupo, mientras que para el estudio comparativo de las mutaciones de los genotipos talasémicos estudiados se utilizó la técnica Análisis de la Variancia a un criterio de clasificación para cinco variables de interés correspondiente a un diseño balanceado. De la aplicación de las comparaciones múltiples se concluye que los promedios de GR Hb, y Hto para hombres y mujeres mayores de 50 años son iguales y significativamente mayores que los promedios de los GR de las mujeres menores de 50 años y niños, los cuales no difieren, el promedio de VCM y HCM para niños es significativamente menor que para las mujeres menores de 50 años, siendo estos dos grupos los únicos que difieren entre sí. También se concluye que el promedio de Hb A2 para los niños es significativamente mayor que para las mujeres mayores de 50 años, siendo estos dos grupos los únicos que difieren entre sí. En lo que respecta a la Hb F no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre genotipos de talasemia ni entre grupos en estudio. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los promedios de cada una de las variables estudiadas para las seis mutaciones consideradas. Existen diferencias levemente significativas (p0,10) entre los valores promedios de HCM para las distintas mutaciones consideradas. Al aplicar comparaciones múltiples de Newman-Keuls para el 10% se concluye que el promedio de HCM para el genotipo + I-6 es marginalmente superior que para el genotipo + II-745, no existiendo diferencias significativas entre los restantes cuatro genotipos estudiados. Las diferencias fenotípicas en portadores talasémicos que presentan la misma mutación se observaron en: 1. Asociación con  talasemia (deleción -3,7): el fenotipo hematimétrico en los pacientes que presentan rasgo beta talasémico asociado con alfa deleción heterocigota tiende a normalizarse. 2. Asociación con triplicación de genes alfa ( anti 3,7): el fenotipo hematimétrico de los pacientes que presentan rasgo beta talasémico asociado con alfa triplicación se desvía por debajo de los valores esperados para un portador de  talasemia. 3.  talasemia: en el caso del portador de  talasemia en que se encontró la mutación 0 39 el fenotipo hematológico fue similar a los portadores  talasémicos. El estudio convencional de hemoglobinas fue distinto al característico del portador  talasémico. 4. Doble heterocigosis 0 39 / Hb S: en este caso se observaron diferencias tanto en el fenotipo hematológico cuanto en el estudio convencional de hemoglobinas. 5. Asociación con otra mutación para  talasemia: en nuestro único caso, la doble heterocigosis para  talasemia dio lugar a un paciente con anemia de Cooley.

Las hemofilias A (HA) y B (HB) son coagulopatías hereditarias, ligadas al cromosoma X (X), sufridas por varones (1:5000) y raramente por mujeres, causada por defectos génicos del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. Para caracterizar el espectro de mutaciones causales de HB en Argentina se aplicó un esquema original de 12 amplímeros para el F9, incluyendo un screening por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis), en 49 familias, y se identificaron 29 cambios missense (60%), 7 nonsense (14%), 4 defectos de splicing (8%), 2 pequeñas inserciones‐deleciones (4%), 6 grandes deleciones (12%) y un cambio en región promotora del F9. Dos cambios missense no reportados mostraron, uno la disrupción de un puente disulfuro y otro la destrucción de un sitio de γ‐carboxilación condicionando el fenotipo de HB severa. Para mejorar la estrategia de detección de grandes rearreglos que involucran int22h e int1h en el F8, causales del 50% de las HA severas, se desarrolló un abordaje nuevo, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Mediante el uso de un test diagnóstico para la inversión del intron 22 (Inv22), los resultados de IS‐PCR fueron validados por perfecta concordancia en 32 y 43 casos previamente estudiados por Southern blot y PCR inversa, y en 34 casos nuevos. El uso conjunto del test diagnóstico y complementario sobre las series de nuestra población, no mostró las variantes estructurales, i.e., deleciones y duplicaciones hipotetizadas en la literatura. El test para la inversión del intrón 1 fue validado por perfecta concordancia en 21 casos estudiados por doble PCR y en 13 casos nuevos. Para investigar la utilidad de IS‐PCR en diagnóstico prenatal, muestras de vellosidades coriónicas de una madre portadora de la Inv22 y su feto nonato fueron diagnosticadas. Para estudiar la causa de la expresión de HA severa en mujeres portadoras heterocigotas se ajustó y validó el sistema del gen HUMARA para estimar el patrón de inactivación del X (XIP). Se estudiaron 6 mujeres con HA severa: una mostró la mutación c.3633delA en hemi‐homocigosis, 4, mostraron la mutación en heterocigosis y sesgo extremo en el XIP, y un caso, heterocigota para c.4388_4391delCTTT, mostró XIP no sesgado en leucocitos de sangre periférica (hipotetizando una inactivación hepática distinta). En una serie de 37 portadoras heterocigotas, y un grupo control de 20 no portadoras, se estudió la correlación XIP‐FVIII:C mediante análisis de contingencia y de errores respecto a un modelo teórico original (Obs.‐Esp.), obteniéndose modestas diferencias significativas (p menor a 0,05) asociadas a una gran dispersión de FVIII:C. Este trabajo presentó la primera serie molecular de mutaciones causales de HB en Argentina, el desarrollo de una nueva estrategia para el estudio de las grandes invers.

Fil:De Siervi, Adriana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Louis-Tisserand, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El parasitoide bracónido Diachasmimorpha longicaudata es ampliamente utilizado como controlador biológico de moscas de los frutos; sin embargo, es escaso el conocimiento disponible sobre su genética. A fin de aportar información y mejorar su cría masiva, se estudió su sistema de determinación del sexo mediante la realización de cruzamientos de alta y baja endogamia, utilizando herramientas de citogenética para determinar el nivel de ploidía de la descendencia. Asimismo, se analizó su espermatogénesis y su cariotipo en detalle, realizando aportes a la Teoría de Interacción Mínima, desarrollada para el estudio de la evolución del cariotipo en Hymenoptera. En este parasitoide el sexo se determina por haplodiploidía (machos haploides, hembras diploides), pero en condiciones de alta endogamia ocurre un sesgo significativo de la proporción de sexos hacia machos, debido a la generación de machos diploides. El sexo estaría determinado por el estado de un promedio de tres loci no ligados. Los individuos homocigotas para los loci sexuales se desarrollan en machos diploides. Esta información permitirá mejorar los protocolos de cría masiva de la especie, tratando de minimizar el nivel de endogamia a fin de evitar un incremento en la producción de machos. El estudio citogenético permitió corroborar el número cromosómico descripto previamente. Se analizó la cantidad, composición y distribución de la heterocromatina constitutiva, se mapearon los “clusters” de genes ribosomales y se determinó la cantidad de “clusters” activos. La información obtenida permitió aportar más evidencias a favor de la Teoría de Interacción Mínima.

Apomixis is a mode of asexual reproduction through seeds that originate progeny that is genetically identical to the mother plant. It is significant in the subfamily Panicoideae and genera Paspalum and its importance is given by the evolutionary connotations and its implications in breeding plant. Paspalum (Poaceae) is a genus comprising between 330 and 400 natural species of tropical, subtropical and temperate regions, mainly from North America and South America. Plicatula group of Paspalum comprises many promising species as forage resources and several of them are typical on natural fields of northeastern Argentina. Most apomictic species are tetraploid and usually possess sexual diploid co-specific counterparts. Sexual tetraploid plants have not been found in nature so far. The objectives of this research were: to generate a segregating population for the reproductive mode by crossing Paspalum plicatulum 4PT (completely sexual, experimentally induced) and P. guenoarum GR19 (natural apomictic) at tetraploid level, to construct genetic linkage maps of both species, to localize the region responsible for apomixis on the male map, to investigate the mode of inheritance (tetrasomic or disomic) of both parental genotypes. An interspecific hybrid population of 211 F1 plants, segregating for reproductive mode, was generated. Classification of 206 hybrids showed that 127 of them were sexual and 79 apomictic. The progeny showed morphological characteristics intermediate compared to their parents but resembling more the male plant. Inheritance of apomixis in Plicatula species showed a segregation distortion of 1.6:1, favoring to sexual individuals. This proposed apomixis segregation model in Plicatula is a novelty for interspecific hybrids of Paspalum. P. guenoarum and P. plicatulum are autotetraploids and both species show tetrasomic inheritance, according to the DDA markers of both genotypes that fixed to the 5:1 ratio. Moreover, some regions of both parental genomes showed disomic inheritance (markers 3:1 and bivalent chromosome associations). Both species share the same basic genomic complement. Seventeen AFLP primer combinations were assayed in 89 F1 individuals (55 sexual and 34 apomictic). The female genetic linkage frame map consisted of 89 markers [39 maternal (1:1) and 50 biparental (3:1)] assigned to 11 cosegregation groups, covering a distance of 819 cM. The genetic male linkage frame map was formed by 127 markers [76 paternal (1:1 and 1:1.6) and 51 biparental (3:1)], that were distributed in 23 cosegregation groups, spanning 1393 cM. The linkage group carrying apomixis (apo group, M10) was identified on the male map. Seven markers mapped onto the M10 linkage group: the character apomixis, 5 paternal markers and a biparental marker. Paternal markers that mapped onto M10 and apomixis showed segregation distortion, thus confirming the distorted transmission of the character and its associated genomic region. Unlike the data for other aposporic Paspalum species and other grasses, markers completely linked to apomixis have not been detected in P. guenoarum. Two paternal markers mapped to 4 and 7 cM from apomixis locus. Results presented in this work indicated that Plicatula species may be different cases from those previously described in the genus. Probably, P. guenoarum represents a new model for studying apomixis in Paspalum.

En este estudio se realizaron dos análisis diferentes dentro del género Dichroplus. El primero involucra un análisis microevolutivo entre especies de Dichroplus elongatus. Se midió entonces la variabilidad intra e interpoblacional en siete poblaciones de Dichroplus elongatus localizadas en las Provincias de Tucumán y de Buenos Aires utilizando marcadores enzimáticos y de fragmentos de ADN amplificados al azar (RAPDs). Al estudiar la estructura poblacional por regiones (provincias) y globalmente se observó una tendencia hacia un exceso de homocigotas dentro de las poblaciones como se esperaría en poblaciones subestructuradas. La diferenciación entre poblaciones es significativa para tres loci enzimáticos, en concordancia con lo esperado para alelos que muestran una distribución clinal de sus frecuencias (Singh y Rhomberg, 1987). Hay cuatro lineas de evidencia que sugieren causas alternativas al "contacto secundario" (interacción entre deriva y migración) para explicar los patrones de variación direccional encontrados para dos loci en Dichroplus elongatus. En primer lugar, si se encuentran ejes concordantes para diferentes loci, el flujo génico en gran escala podría ser responsable de la variación clinal de las frecuencias alélicas; pero si, como en el caso de D. elongatus se encuentran diferentes variables en asociación con distintos loci entonces se debe invocar a la selección, excepto que estos loci se encuentren ligados (Barbujani 1988). Nuestros resultados apoyarían la hipótesis selectiva ya que Aat-1 y Pep-1 estan correlacionados con diferentes variables (Lat, Long, T.Min y T.Max: T.Max.Abs y T.Min.Abs respectivamente) sin mostrar ninguna correlación concordante con ninguna de las nueve variables estudiadas. En segundo lugar, el fenograma construido a partir de las distancias genéticas no se vinculan de acuerdo con lo esperado considerando las distancias geográficas. Concordantemente, la matriz de distancias geogróficas no esta correlacionada con la de distancias genéticas. En tercer lugar, el flujo génica estimado seria lo suficientemente elevado como para enmascarar las diferencias en las frecuencias alélicas si estas fueran originadas solamente por deriva genética. Por último, el patron de variación encontrado se mantiene incluso al incluir poblaciones muestreadas en distintos años. Esto sugiere que de alguna manera la variación clinal encontrada es estable en el tiempo. Un gradiente temporalmente estable debe ser mantenido por algún tipo de selección, de lo contrario el gradiente desaparecería. De esta manera, los resultados obtenidos sugieren la existencia de un probable efecto adaptativo de algunos loci alozímicos, que estaría determinado en última instancia por variables ambientales como la temperatura mínima, relacionadas con la latitud. A partir de los datos de variabilidad resultante del analisis de marcadores de ADN amplificados al azar se desprende que la variabilidad obtenida mediante isoenzimas no difiere significativamente de la obtenida mediante RAPDs. Si muchos de los productos de amplificación obtenidos mediante RAPDs representan ADN repetitivo deberíamos esperar niveles mas altos de variabilidad con marcadores RAPD que con isoenzimáticos. La ausencia de disparidad entre ambos estimadores es sugerida como una posible evidencia indirecta de la cantidad de ADN repetitivo presente en un genoma en particular. El valor de Fst calculado a partir de RAPDs es mucho mayor que el calculado a partir de datos alozímicos. Los primeros por ser considerados marcadores genéticos neutros daría más exactitud al valor de Fst comparado con uno que surge del calculo utilizando loci alozímicos que muestren alguna evidencia de no neutralidad. En los fenogramas construidos a partir de datos de RAPDs, las poblaciones se vinculan de acuerdo con lo esperado por las distancias geográficas. Este resultado no es consistente con los resultados alozímicos previos. Nuevamente esto podría deberse al uso de loci enzimóticos con una posible función selectiva y reforzaría la noción de neutralidad de los marcadores RAPD (que dan como resultado distancias genéticas y geográficas concordantes). Realizando un análisis macroevolutivo se llevaron a cabo también estudios sistemáticos dentro del género Díchroplus a través del análisis de los polimorfismos para fragmentos de restricción del ADN mitocondrialcon el finde llevar a cabo una reconstrucción filogenética dentro del género. Se desprende que a pesar que S. lemniscattase dispone naturalmente como grupo externo, tal como se esperaba de acuerdo a los datos morfológicos, el resto de los datos moleculares compilados no se corresponden con la clasificación taxonómica inferida para este grupo. La propuesta para un estudio mas exhaustivo sería la de incluir caracteres provenientes de genes nucleares y comparar las filogenias obtenidas con los tres métodos, construyendo matrices que incluyan todos los caracteres. A pesar de que los datos moleculares superan a los morfológicos en número generalmente son muy uniformes, dando como resultado pocos árboles. Se aplicaría entonces la combinación de caracteres, descartando la partición, ya que estudios que combinen ambos enfoques pueden maximizar la cantidad y utilidad de la información y darnos una visión mas comprensible de la evolución de los organismos.