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El tratamiento de las infecciones por tripanosomas depende de un pequeño número de drogas que tienen limitada eficacia y pueden causar severos efectos secundarios. El ácido lipoico (AL) es una molécula esencial para la viabilidad de la mayoría de los organismos procariotas y eucariotas de metabolismo aeróbico. No sólo por su participación como cofactor de complejos multienzimáticos que intervienen en la respiración celular y el metabolismo central sino también por su papel como regulador redox. Es por ello que se plantearon como objetivos principales de esta tesis: i) validar el metabolismo de lipoilación de proteínas en Trypanosoma cruzi como potencial blanco quimioterapéutico de efecto altamente pleiotrópico, y ii) identificar y caracterizar las enzimas involucradas en dicho metabolismo. Dado que existen antecedentes en la utilización de análogos estructurales de AL como inhibidores del crecimiento de distintos microorganismos, incluyendo parásitos como Plasmodium falciparum, se decidió ensayar el efecto del inhibidor más conocido, 8-bromo-octanoato (BrO), sobre cultivos de T. cruzi epimastigotes de las cepas CL Brener y Dm28c. Se realizaron curvas de inhibición a distintas concentraciones que evidenciaron un efecto letal sobre los parásitos. No obstante, las concentraciones requeridas fueron altas como para ser relevantes en términos quimioterapéuticos (EC50 = 0,591 ± 0,190 mM para CL Brener y EC50 = 0,829 ± 0,033 mM para Dm28c). Tras demostrar que por la falta de transportadores específicos el BrO no era incorporado eficientemente por los parásitos, se sintetizó un derivado metil éster –metil-8-bromo-octanoato (MBrO)- presumiblemente más permeable a la membrana celular y se ensayaron nuevas curvas de inhibición mejorándose la efectividad de la droga en hasta un orden de magnitud (EC50 = 66,18 ± 10,40 μM y 62,17 ± 7,46 μM para una y otra cepa). Por otro lado, se estudió si este efecto letal en el crecimiento se debía efectivamente a la inhibición del metabolismo de lipoilación. Mediante la realización de western blots anti-lipoamida se pudo apreciar cómo el tratamiento con ambas drogas disminuía o suprimía por completo la lipoilación de proteínas. Más aún, observamos que la señal de una de las proteínas lipoiladas, la subunidad E2 (E2p) del complejo piruvato deshidrogenasa (PDH), mostraba una intensidad muy baja respecto del resto, razón por la cual nos preguntamos –teniendo en cuenta las funciones metabólicas de cada complejo lipoilado- si las condiciones de cultivo estarían influyendo. Efectivamente, al crecer cultivos en condiciones de baja glucosa (de una concentración diez veces menor a la utilizada en el medio LIT convencional) y realizar extractos mitocondriales y nuevos western blots, la señal de E2p aumentó notoriamente. Por último, demostramos que las actividades α-oxoácido deshidrogenasas de los complejos lipoilados desaparecían en extractos de cultivos tratados con MBrO. Adicionalmente, vimos que la actividad PDH aumentó hasta cinco veces en condiciones de baja glucosa. En su conjunto, estos resultados nos permitieron validar el metabolismo de lipoilación de proteínas de T. cruzi como un potencial blanco quimioterapéutico, que además sería de efecto altamente pleiotrópico. En segundo lugar, tras observar que BrO (análogo de AL) y octanoato libre (precursor de AL) son incorporados pobremente al interior celular, aportamos nuevas evidencias a favor de la ausencia de la vía de salvataje de AL en tripanosomátidos, en concordancia con otras evidencias reportadas en T. brucei por otros laboratorios. Estos resultados plantearon la necesidad de profundizar nuestro conocimiento sobre los mecanismos involucrados en el metabolismo de lipoilación del parásito, los cuales deben ser lo suficientemente divergentes en términos evolutivos de aquellos presentes en el ser humano para poder diseñar fármacos inocuos para nuestra salud. Por ello se identificaron las enzimas que participan en la síntesis de novo de AL y se caracterizaron dos de ellas. En este caso, se trabajó con los genes de Trypanosoma brucei dado que el genoma de T. cruzi fue realizado sobre la cepa CL Brener, un híbrido de poliploidía incierta y especie que se caracteriza por poseer múltiples alelos. En primer lugar, mediante ensayos de reversión de fenotipo de levaduras mutantes lip2, incapaces de sintetizar AL por falta de una octanoiltransferasa, se demostró que el gen Tb927.11.9390 (TblipT) codifica una octanoiltransferasa específica para la proteína H y la subunidad E2p. Se ensayaron distintos medios de cultivo: YPG, YNBDGly, YPS e YPE (suplementado con AL u octanoato 50 μM, y sin suplementar), ajustándose a nuestra hipótesis el comportamiento de las cepas complementadas con el gen de interés, en todos los casos y según el medio en cuestión. Estos resultados fueron revalidados mediante western blots anti-lipoamida, tanto en extractos de proteínas de levaduras mutantes como de Escherichia coli doble mutantes (cepa TM136), ambas expresando el gen de T. brucei. Cabe destacar que este último caso nos permitió dilucidar por completo la especificidad de TbLipT, dado que en las levaduras mutantes lip2, la actividad de una de las enzimas funcionales endógenas de la vía de síntesis de AL, Lip3, enmascaraba los efectos de nuestra enzima en estudio, no así en el caso de TM136, donde pudimos determinar la capacidad de esta enzima de acilar la subunidad E2p. Se realizó un estudio análogo al de TblipT con el gen Tb927.8.630 (TblipL), de particular importancia debido a que como hemos indicado, los tripanosomas carecen de la vía de salvataje de AL. Curiosamente, TblipL posee homología con lipoato proteína ligasas, enzimas que intervienen en dicha vía. No obstante, estas enzimas pertenecen a una superfamilia caracterizada por conservar cierto grado de homología secuencial y estructural pero de funciones diversas, incluyendo octanoiltransferasas, amidotransferasas, octanoil-CoA:proteína transferasas e incluso biotina proteína ligasas. Se realizaron ensayos de reversión de fenotipo de la mutante de levadura lip3, carente de una enzima con aparente actividad amidotransferasa u octanoil-CoA:proteína transferasa. La complementación funcional provocada por TbLipL en los medios YNBDGly e YPE (suplementado y sin suplementar) indicaría que se trata también de una acil transferasa, pero específica para E2k, subunidad del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDH). Ensayos de western blots anti-lipoamida realizados a partir de extractos mitocondriales de levaduras mutantes lip3 complementadas con TblipL mostraron la aparición de una banda correspondiente a E2k, revalidando los resultados y conclusiones. Proponemos que los tripanosomas carecen de una vía de salvataje de AL libre y lipoilan sus proteínas mediante la síntesis de novo. En esta vía, una octanoiltransferasa LipT transfiere residuos octanoilos desde octanoil-ACP a la proteína H del complejo de clivaje de glicina y a la subunidad E2 de PDH. Una ligasa/amidotransferasa (LipL) octanoila las subunidades E2 de KGDH y presumiblemente -dado que no está presente en levaduras- del complejo deshidrogenasa de α-cetoácido de cadena ramificada, a partir de un dador de octanoilos aún no caracterizado. Una tercera enzima identificada bioinformáticamente, LipS, de actividad lipoato sintasa y altamente conservada, catalizaría la inserción de dos átomos de azufre sobre los grupos octanoilos, ya incorporados a H, E2k y E2p, convirtiéndolas en las holoproteínas lipoiladas. La vía descripta, además, ha sido validada como un potencial blanco quimioterapéutico de efecto altamente pleiotrópico.

En la presente Tesis Doctoral se realizaron estudios sobre la biosíntesis de aldosterona, en la glándula interrenal de Bufo arenarum, a partir de distintos sustratos tales como corticosterona, 18-hidroxicorticosterona (18-OH-B) y el compuesto "N" que se biosintetiza a partir de pregnenolona pero no de progesterona. A diferencia de lo que ocurre con la 18-OH-B comercial o de rata, la proveniente de interrenales de sapo presenta una forma menos polar única y distinta de las conocidas hasta el momento. Con respecto a la precursoriedad de aldosterona que posee este esteroide 18-hidroxilado, los resultados mostrados indican que esta hormona no es intermediario en la biosíntesis de aldosterona, por lo menos en las condiciones utilizadas para los experimentos presentados en esta Tesis. También se ensayó la capacidad precursora de aldosterona que tiene corticosterona y la conclusión a la que se arribó es que la capacidad biosintética de este conocido intermediario en la síntesis de aldosterona es, también, muy baja. Se caracterizó por diversos métodos el compuesto "N", esteroide muy polar con movilidad intermedia entre 18-OH-B y cortisol en el sistema Bush B5, como el 3β -hidroxi-5-ene análogo de aldosterona (3β ,11β ,21-trihidroxi-5-pregnen-20-ona-18-al). Cuando se estudiaron las propiedades biosintéticas del compuesto "N", este esteroide demostró ser un muy buen precursor para la síntesis de aldosterona. La importante capacidad precursora de aldosterona que posee "N", a la menor precursoriedad de corticosterona y a la falta de capacidad de 18-OH-B, indican que en Bufo arenarum, la isomerización del doble enlace Δ 5 a Δ 4 es un paso muy tardío en el camino biosintético de aldosterona. La transformación del análogo de aldosterona en el mineralocorticoide es catalizada por la enzima 3β -hidroxiesteroide deshidrogenasa-Δ 4 isomerasa de localización mitocondrial. La actividad de la enzima mencionada es regulada por la concentración de sodio del medio, la que parece regular la cantidad de enzima presente en aquella fracción.

Se investigó la citología de células de Rps. palustris, comprobándose que cuando crece anaeróbicamente a a la luz posee un sistema de membranas intracitoplasmáticas continuo con la membrana citoplasmática, que no existe en células que crecen aeróbicamente a la oscuridad. -Por primera vez se reporta la detección de la enzima ALA-S en Rps. palustris crecida en diversas condiciones y medios, habiéndose logrado un método rápido, reproducible y sencillo para la medición de su actividad. -Se caracterizó el producto de la reacción enzimática como ácido delta aminolevúlice. -Se comprobó que en células crecidas aeróbicas, ente en oscuridad los nivles de ALA-S son menores que en células crecidas fotosíntéticamente, sugiriendose un rol regulatorio de la biosintesis de BChl para esta enzima. Los niveles de Succinil-CoA-S y ALA-D no varian al cambiar condiciones. -La enzima de células crecidas fotosíntéticamente tiene un pH óptimo de 7,5 y una temperatura óptima de reacción de 37°C. Ni cisteína, ni glutation, ni 2-mercaptoetanol tienen efecto activador destacable del ALA-S. Tampoco su actividad es afectada por cistina. Su peso molecular es de 61.000 — 64.000. -La enzima de células anaerobias y la de células aerobias presentan el mismo Km para glicina. Ambas se inhiben por producto, 16 que sugiere un posible mecanismo regulatorio. Se trata de una enzima relativamente inestable, aunque en extractos crudos resulta ser bastante estable si ellos no se congelan. -La precipitación con sulfato de amonio del ALA-S de células crecidas anaeróbicamente ocasiona una pérdida irreversible de us su actividad. Como tambien se pierde actividad al filtrar por geles, se dificultó el intento de purificación de la enzima. -Tanto en células crecidas fotosintéticamente como aerobias existen activadores del ALA-S,de bajo peso molecular. En células crecidas aeróbicamente en oscuridad existe un activador del ALA-S de células crecidas fotosintéticameate. Se postula un mecanismo que explicaría la acción de los distintos activadores detectados. -Si se burbujea oxígeno a un cultivo de Rps. palustris crecido fotosintéticamente, cesa inmediatamente la sintesis de BChl y decae la actividad especifica del ALA-S,sin alterar notablemente el crecimiento bacteriano. La pérdida de actividad del ALA-S es una inhibición provocada por el oxigeno, aparentemente sin que decaiga en forma importante el número de moléculas del ALA-S puesto que al cesar dicho burbujeo gaseoso, la actividad enzimática recupera rápidamente sus niveles, afin en presencia de inhibidores de sintesis proteica. La cinética de la activación "in vivo" del ALA-S es de orden cero, postulándose que durante la oxigenación del cultivo se forma un activador. de la enzima asociado a membrana. Si la oxigenación se efectúa en presencia de inhibidores de la sintesis proteica, el ALA-S decae pero la recuperación de los niveles al cesar el burbujeo gaseoso no es tan acentuada como si no hubiera inhibidor. -El ALA-S de células de Rps. palustris crecidas fotosintéticamente y luego oxigenadas se activa espontáneamente en extractos crudos a 0-4°C, dependiendo esta activación fuertemente de la concentración de extracto. -Inhibidores del transporte de electrones y desacoplantes de la fotofosforilación afectan al crecimiento y la biosintesis de BChl en Rps.palustris, sin alterar los niveles de ALA-S.

La presente Tesis describe el metabolismo de esteroides del testículo de Bufo arenamrm como así también algunos aspectos de la regulación del mismo. Durante el período no reproductivo, la biosíntesis de andrógenos (T y DHT) se realiza por una vía Δ5 que incluye al 5Diol como intermediario. P4 se transforma mayoritariamente en derivados reducidos como 5αP y 5αP3αol,20ona. La función biológica de estos esteroides reducidos en el testiculo de B. arenam se desconoce hasta el momento. En los animales capturados durante el período de reproducción, la capacidad biosintética del testículo se modifica. Este cambio va desde el predominio de esteroides con 19 átomos de carbono, que se observa en el período no reproductivo, hacia la formación de esteroides de 21 átomos de carbono. Así, se encuentra aumentada la transformación de P5 en P4 y la producción de 5αP; 5αP3α,20ona; 5αP3α,20(α/β)diol y un metabolito no caracterizado. La disminución de la síntesis de andrógenos, in vitro, se correlaciona con una disminución de la concentración plasmática de los mismos. Este cambio en el patrón esteroidogénico podría relacionarse con el final de la espermatogénesis (que depende de andrógenos) y el comienzo de la época de apareamiento. El mecanismo por el cual ocurren estos cambios consistiría, principalmente, en la reducción de la actividad de la enzima P450C17. Se confirma el fuerte efecto inhibitorio de CNK sobre la actividad de 3βHSD reportado previamente para interrenal de esta especie. SPNL ejerce un 50 % de inhibición de la actividad de C17-20 liasa, pero presenta un menor efecto sobre la hidroxilación en la posición C17. Finasteride es incapaz de inhibir a la 5αRed de sapo independientemente del sustrato utilizado. Esta enzima es de localización microsomal, tiene dependencia de NADPH como cofactor, presenta un Km menor para P4 que para T y un amplio rango de pH óptimo, entre 6 y 8. Las características mencionadas previamente son válidas tanto para la conversión de P4 como de T, lo que estaría sugiriendo la existencia de un único tipo enzimático para ambas reacciones. La falta de sensibilidad a Finasteride y el rango de pH óptimo de esta enzima se asemejan al tipo I caracterizado en mamíferos. Independientemente de la concentración utilizada, el tratamiento agudo con hCG in vitro no tiene efecto sobre la actividad de 5αRed. Sin embargo, el tratamiento crónico con hCG y FSH provoca una reducción de la actividad enzimática. Por otro lado, GnRH induce un aumento de la actividad de 5αRed, sólo en la menor concentración utilizada. Las actividades asociadas a la enzima P450c17 son inhibidas por el tratamiento crónico tanto con FSH como con GnRH en todas las concentraciones utilizadas y con hCG sólo en la mayor concentracion ensayada. Sin embargo, la actividad de 3βHSD no se ve influenciada por ninguno de estos tratamientos. GnRH, cuyos receptores testiculares se caracterizan en esta tesis, reduce la liberación de T inmunoreactiva tanto basal como estimulada por hCG. El efecto sobre la liberación basal de T solo se observa en la concentración más baja, al igual que lo que ocurre sobre la 5αRed. Por otro lado, el bloqueo de la acción de hCG sobre la secreción de andrógenos se ejerce en todas las concentraciones probadas. Estas diferencias sugieren que los mecanismos subyacentes para cada una de las inhibiciones provocadas por GnRH son diferentes.

La biosíntesis del glucano β1-2 cíclico en A. tumefaciens y R. meliloti transcurre por transferencia de residuos de glucosa desde el nucleótido UDP-glucosa a una proteína intermediaria de 235 kDa (P235), presente en las membranas internas, para formar glucooligosacáridos β1-2 unidos covalentemente a la proteína. Cuando los giucooligosacáridos alcanzan un grado de polimerización de 14 a 24 se ciclan y se liberan de la proteína. Lo descripto se esquematiza de la siguiente manera: Etapa 1 P235 + nUDP-Glc -—> P235(G1cfl1-2) + nUDP (el ongación) Etapa 2 P235-(Glcβ1-2)n -—> P235 + (Glcβl-2)ncíclico (terminación, ciclación) Las mutantes cromosomales chvB avirulentas y defectivas en la unión con la planta de A. tumefaciens, son incapaces de sintetizar el glucano β1-2 cíclico por carecer de la proteína intermediaria de 235 kDa. Esto último enfatiza el rol de la proteína intermediaria en la síntesis del glucano. La ausencia de la proteína de 235 kDa es posiblemente el defecto bioquímico primario de estas mutantes, lo que sugiere fuertemente una función del glucano β1-2 cíclico en el proceso infectivo y más específicamente en la adherencia.

La resistencia de los microrganismos a los antibióticos de primera línea parauso clínico es un problema global conocido desde hace muchos años. La grancapacidad que las bacterias han desarrollado para enfrentar la acción de losantimicrobianos ha generado en los científicos la necesidad de encontrar nuevoscompuestos bioactivos que posean actividad antimicrobiana frente a las diferentesespecies bacterianas. Debido a las innumerables propiedades que presentan lasnanopartículas, se espera que la plata en su forma elemental y en tamañonanométrico actúe como un antimicrobiano con mejores destrezas con respecto asu forma iónica. De todos los métodos de fabricación de nanomateriales se hacreado un gran interés por el término biosíntesis, que se caracteriza por utilizar lamaquinaria proveniente de microorganismos y/o plantas y por ser eficiente desde elpunto de vista energético y no tóxica. En este contexto, se plantea en este trabajode tesis obtener nanopartículas de plata (NPsAg) a través de un métodoecoamigable y evaluar su actividad como agente antimicrobiano, como así también,su capacidad para modificar el metabolismo oxidativo de bacterias y su toxicidad encélulas humanas, con el propósito de contribuir al conocimiento sobre diversosaspectos involucrados en el posible mecanismo de acción de las mismas. Seencontró que la biosíntesis de NPsAg a partir del sobrenadante de P. aeruginosafue exitosa, obteniéndose NPsAg de tamaño homogéneo y estables. Las mismasfueron efectivas como antimicrobianos frente a diferentes especies bacterianas,superando la acción de la plata en su forma iónica y antibióticos de actual usoclínico. Se observó que las NPsAg produjeron un estado de estrés oxidativo en lascélulas bacterianas estudiadas, mediante el aumento de las especies reactivas del oxígeno y un desbalance en los sistemas antioxidantes protectores. Se logrócuantificar la oxidación de proteínas, lípidos y el daño al ADN, y se expusieron comoevidencia del estrés oxidativo producido por las NPsAg. Se propone el uso de lasNPsAg biosintetizadas como un potencial antimicrobiano para ser utilizado enaquellas infecciones donde el tratamiento con los antibióticos existentes no esviable.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

EL glucógeno es el polisacarido de reserva presente en tejidos animales, como así también en algunas algas, plantas superiores, hongos y bacterias. Es un polímero ramificado de D-glucosas unidas entre si por uniones glucosídicas α 1,4 en las cadenas lineales y α 1.6 en los puntos de ramificación. La síntesis del glucógeno involucra tres etapas: a) iniciación, b) crecimiento y c) terminación. Desde el descubrimiento de las enzimas glucógeno sintetasa y ramificante, se planteó la necesidad de conocer como se origina "de novo" una molécula de glucógeno. A partir de resultados obtenidos en hígado de rata y E. coli donde , a partir de un nucleótido-(14C)glucosa se transfiere la marca radioactiva a una proteína, Krisman postuló un modelo para la iniciación de la biosíntesis del glucógeno. En base a este modelo, la síntesis "de noyo" de una molécula de glucógeno involucraría una etapa inicial donde, si no más, por lo menos una glucógeno sintetasa iniciadora, formaría un glucano unido covalentemente a una proteína que serviría como "primer" para la acción conjunta de la glucógeno sintetasa y la ramificante. De esta forma se originarían moléculas de glucógeno unidas a proteína. Por otro lado, la etapa de crecimiento de la molécula de glucógeno ha sido muy bien estudiada. Si bien se conocen todos los mecanismos regulatorios de la glucógeno sintetasa es muy poco lo que se sabe acerca de la regulacion de la enzima ramificante. Esto se debe a la inexistencia de métodos específicos y cuantitativos para medir su actividad enzimática. Teniendo en cuenta las características particulares del cerebro en cuanto al metabolismo del glucógeno, ya que este no lo acumula salvo en casos patológicos, se estudio el proceso de iniciación y ramificación del mismo en este tejido. Los resultados obtenidos en esta Tesis son los siguientes: -Se desarrolló un método específico, sensible y cuantitativo para determinar la actividad ramificante. La metodología propuesta consiste en la determinación específica de las glucosas involucradas en los puntos de ramificaoión. -Se demostró que la estructura final de un polisacárido depende de la especificidad de la enzima ramificante involucrada en su síntesis. -Se demostró que en el cerebro, tejido que no acumula glucógeno en condiciones normales, también es operativo el modelo propuesto por Krisman para la iniciación de la biosintesis del glucógeno. -Se estudiaron, en particular las actividades involucradas en la formacion del "primer" proteico. Se demostró la existencia de más de una actividad glucógeno sintetasa iniciadora.

Fil:Geremía, Roberto Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente estudio tiene por objeto: la biosíntesis e identificación de porfirinas formadas in vitro por sistemas de GR o fracciones de los mismos en presencia de ácido delta amino levúlico o porfobilinógeno; la investigación de la naturaleza química de la porfirina descripta por Falk como Pseudouroporifina y su identificación con la aislada de orina de porfiria humana, denominada originalmente "Porfirina 208", finalmente, siendo dicha porfirina de estructura isomérica III, el estadio de su significado biológico y posible intermediario en la biosíntesis del hemo. Se describen una serie de métodos aplicados durante el trabajo, en particular un micrométodo para la determinación cuantitativa de porfirinas, que ha surgido de nuestro laboratorio (114). Además algunas modificaciones interesantes a otras técnicas que han mejorado las mismas desde el punto de vista de su rendimiento. El empleo de distintos sistemas de incubación,, en diferentes condiciones, de atmósfera, temperatura, tratamiento previo, etc, llevó a la elección de un determinado sistema como el más eficaz, es decir que produce un mejor rendimiento, en lo referente a la biosíntesis de la Firiaporfirina III. Con iguales concentraciones de sustrato, a mayor tiempo de incubación, hay mayor síntesis; pero a los 90´ se alcanza aproximadamente, el máximo, de donde el mejor tiempo de incubación es, para nuestros fines, de 90´. El uso de solución fisiológica o de sacarosa 0,25M, como líquido de lavado o disolución, no produce ninguna modificación. Se han estudiado independientemente, cada una de las porfirinas aisladas de los distintos sistemas de incubación, comparativamente, cuando era posible, con los correspondientes isómeros provenientes de fuentes naturales; identificándose así dichas porfirinas. Se aprecia que la fracción "Uroporfirina" consiste de aproximadamente 60% de Uroporfirina III y aproximadamente de 30% de Firiaporfirina III, además de menores cantidades de porfirinas que poseen una movilidad correspondiente a una hexacarbóxilica y otras dos que se sitúan en una posición intermedia entre la Uro-porfirina I y la Uroporfirina III por cromatografía sobre papel. La fracción "Coproporfirina" consiste principalmente de Coproporfirina III y cantidades menores de profirinas hexacarboxílica pentacarboxílica y tricarboxílica, que no habían sido descriptas anteriormente. Estas porfirinas que se encuentran en pequeña cantidad, fueron detectadas utilizando la cromatografía en columna de carbonato de calcio, que demostró ser más sensible para la separación de porfirinas que la cromatografía sobre papel de Falk y Benson. Si el sistema se calienta previamente a 60°C durante más de 15´, ocurren cambios muy significativos en lo que atañe a la naturaleza de las porfirinas sintetizadas, así: la fracción "Uroporfirina" consiste casi exclusivamente de Uroporfirina I y desaparece la Firiaporfirina III; en tanto que el rendimiento de la fracción "Coproporfirina" disminuye considerablemente y ésta consiste sólamente de Coproporfirina I. Cuando se emplea ácido delta amino levúlico como sustrato, aproximadamente un 15% del ALA agregado no se utiliza en la biosíntesis y un 25% se transforma en porfobilinógeno; en tanto que cuando se usa porfobilinógeno como sustrato, aproximadamente un 40% del mismo queda sin utilizar. Utilizando Uroporfirinógeno III-C^14 y Coproporfirinógeno III-C^14 se demuestra por 1° vez su transformación a Protoporfirina IX, confirmándose que el Uroporfirinógeno III y el Coproporfirinógeno II, pero no el UPG I, ni el CPG I, son intermediarios en la biosíntesis del heso. Se han aislado e identificado las porfirinas libres formadas cuando se usaron los distintos porfirinógenos como sustratos, determinándose los porcentajes de los diferentes componentes de cada fracción. Se demuestra que la porfirina descripta por Falk como pseudouroporfirina, es igual a la aislada de orina de porfiria humana, designada como "Porfiria 208" y actualmente como firiaporfirina III. Por otra parte, mediante la técnica I otopica, se establece que el firiaforfirinogeno III, es un intermediario normal, siguiendo al uroporfirianogeno III en la biosíntesis de la protoporfirina IX. Y muy posiblemente la decarboxilación seria un proceso en etapas que ajustaria al siguiente esquema *Ver esquema en tesis*