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El rendimiento del maíz se encuentra determinado por el número y peso individual de los granos cosechados por unidad de área. Si bien el número de granos tiene más impacto sobre el rendimiento final, cambios en el peso individual de los granos (PG) impactan sobre el mismo. Existe gran variabilidad genotípica en el patrón de crecimiento de los granos de maíz de híbridos comerciales y en líneas elite de mejoramiento.El conocimiento de las bases genéticas de los procesos fisiológicos que determinan el PG es relevante para mejorar el rendimiento del cultivo. Los objetivos generales de esta tesis fueron (i) caracterizar fenotípicamente una población de RILs de maíz para características de llenado de granos, y (ii) realizar una primera aproximación a las bases genéticas que determinan el peso de grano en una población de RILs de maíz. Se realizó un análisis de QTL sobre una población de 245RILs de maíz de la población IBM Syn4 (B73 x Mo17) que mostró grandes diferencias genotípicas en PG (p<0,001) en dos ambientes. La variabilidad en PG estuvo positivamente asociada a variaciones en tasa de llenado (TLL) y duración de llenado (DLL). Un total de 10 QTL conjuntos fueron detectados, mostrando generalmente efectos menores y no consistentes a través de los dos ambientes evaluados. La TLL y DLL no mostraron QTL en común, sugiriendo un control genético independiente. A través de información de uno de los dos padres de la población de RILsy los intervalos de confianza de los principales QTL se presentan posibles genes candidatos para futuras disecciones. También se evaluó la correlación entre líneas parentales e híbridos derivados para caracteres de llenado de grano. Tanto la heterosis como la correlación entre el valor medio de las líneas parentales y los híbridos derivados fueron significativas para todos los caracteres de llenado evaluados. Estos resultados confirman que el estudio de caracteres de llenado de grano en líneas endocriadas genera información valiosa para sus híbridos derivados. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran la relación entre las bases genéticas del crecimiento del grano de maíz y sus mecanismos fisiológicos. Los resultados observados en líneas endocriadas son relevantes para estimar el comportamiento de sus híbridos derivados gracias a la alta correlación que se encontró en el desempeño entre ambos.

Comprender el origen y la evolución del cerebro humano es uno de los desafíos más sobresalientes que enfrenta la ciencia. Los cambios genéticos que llevaron a la adquisición de las capacidades distintivas del cerebro humano están codificados en nuestro genoma. La disponibilidad de más de cincuenta genomas de vertebrados permite hoy reconstruir nuestra historia evolutiva. Nuestra hipótesis es que la adquisición de nuevos patrones de expresión de genes relacionados con el desarrollo y la función cerebral en el linaje humano, habría sido crítica para la evolución de las capacidades cognitivas excepcionales de nuestro cerebro. Haciendo uso de bases de datos públicas de secuencias no codificantes conservadas con evidencia de evolución acelerada en el linaje humano (denominados HAEs por human accelerated elements), se encontró que el factor de transcripción neuronal PAS domain-containing protein 3 (NPAS3) contiene 14 HAEs, el mayor número de HAEs para un solo gen en todo el genoma humano. Usando un ensayo de expresión en peces cebra transgénicos se demostró que 11 de los 14 HAEs son capaces de activar la expresión de la proteína reportera EGFP durante el desarrollo embrionario, particularmente en el sistema nervioso. Además, utilizando ratones transgénicos, se realizó un análisis comparativo estudiando los patrones de expresión de uno de los HAEs de NPAS3 y secuencias ortólogas de chimpancé y ratón. El enhancer humano muestra una extensión del patrón de expresión en el telencéfalo. Este cambio humano específico pudo haber contribuido con la evolución de alguna de las características de nuestro cerebro.

La luz es uno de los principales factores ambientales que regulan el crecimiento y desarrollo de las plantas. A lo largo de su ciclo de vida, desde la germinación hasta la floración, las plantas monitorean la intensidad, la longitud de onda, la dirección y la duración de la luz y utilizan la información del ambiente lumínico para optimizar su desarrollo. La percepción de las señales lumínicas está mediada por fotorreceptores específicos como los fitocromos, del rojo al rojo lejano. En Arabidopsis thaliana, existen 5 fitocromos diferentes (PHYA, PHYB, PHYC, PHYD y PHYE). La percepción de los cambios en el ambiente lumínicos asociados a la presencia de plantas vecinas acelera el crecimiento de los tallos, la floración e induce la hiponastia. Conjuntamente estos cambios en el desarrollo se denominan síndrome de escape al sombreado y están mediados principalmente por el PHYB. Este trabajo aporta nuevos elementos para comprender los mecanismos implicados en la transducción de las señales lumínicas en plantas a través de la identificación de nuevos componentes involucrados en la vía de señalización del fitocromo B. En esta tesis se aisló y caracterizó al mutante csa1 (del inglés constitutive shade avoidance) por presentar el síndrome de escape al sombreado aún creciendo en condiciones no inductivas. csa1 posee una inserción de T-DNA en el segundo exón de un gen TIR-NBS-LRR (del inglés Toll/Interleukin1 receptor-nucleotide binding site-leucinerich repeat), generando así una proteína truncada que interfiere en la señalización de otras proteínas con dominios TIR. Hasta el momento las proteínas TIR-NBS-LRR habían sido implicadas únicamente en las respuestas de defensa en plantas; nuestros resultados indican que además estarían involucradas en la modulación de la vía de señalización del fitocromo B a través de la regulación de la expresión de PIF3. Además, detectamos que los niveles de expresión de los genes PIF3 y PIF4 (dos genes involucrados en las respuestas ftomorfogénicas) varían luego de la infección con Pseudomonas syringae. Finalmente, los resultados de estas tesis muestran que el mutante eds4 aislado originalmente por ser hipersensible a la infección con bacterias, está afectado en las vías de transducción de las señales lumínicas. En conjunto, los resultados de este trabajo constituyen el primer paso para comprender los mecanismos moleculares implicados en la interacción o cross-talk entre las vías de señalización que conducen a las respuestas foromorfogénicas y las que regulan las respuestas de resistencia frente al ataque de los patógenos.

Virus patogénicos como Adenovirus, Papilomavirus y Poliomavirus poseen proteínas capaces de interactuar con el supresor de tumores Retinoblastoma (pRb), controlador central del ciclo celular eucariótico. Dichas interacciones se establecen en sitios utilizados por pRb para unir blancos endógenos como el surco A/B donde se une el factor de transcripción E2F y el surco LxCxE donde se unen proteínas que poseen el motivo LxCxE. Estos virus hacen mímica de motivos lineales de interacción altamente conservados, y generalmente presentes en regiones intrínsecamente desordenadas, para interferir efectivamente con la red celular y tomar el control de la célula huésped conduciendo en algunos casos a transformación celular y oncogénesis. La oncoproteína viral E1A del Adenovirus (AdE1A) es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) y se une a pRb a través de dos motivos lineales necesarios para desplazar a E2F, el motivo E2F y el motivo LxCxE , que se encuentran separados por una región de 70 residuos o “ linker ”. En este trabajo, sugerimos que ciertas características de esta proteína desempeñan un papel esencial en los mecanismos de desregulación de pRb. Dado el limitado conocimiento mecanístico y estructural de alta resolución con respecto a AdE1A, su interacción con pRb y la contribución de la región “ linker ” en esta interacción, nos propusimos caracterizarlos para revelar información que servirá para comprender mejor las interacciones virus-hospedador. En primer lugar, desarrollamos un protocolo de expresión recombinante de AdE1A y mutantes individuales de motivos, con rendimientos de 9 mg/L y pureza superior al 95%. Experimentos biofísicos evidenciaron que AdE1A es un monómero intrínsecamente desordenado con radio hidrodinámico extendido y migración anómala en gel. En segundo lugar, ensayos de interacción muestran que AdE1A se une a pRb con estequiometría 1:1 y una muy alta afinidad ( K D = 24 pM). Aunque los sitios individuales unen a pRb con menor afinidad (≈ K D = 110nM) que la E2F celular ( K D = 1 nM), el modelado del sistema como un arreglo de dos motivos unidos por un “ linker ” de longitud óptima y altamente flexible permite explicar la potenciación de su afinidad global y la efectividad de la proteína AdE1A en el desplazamiento de E2F. En tercer lugar, estudios estructurales de RMN permitieron la asignación completa de la cadena carbonada de AdE1A y su caracterización a nivel de estructura secundaria y propensiones conformacionales evidenciaron su naturaleza desordenada y flexible. AdE1A se une a pRb a través de dos sitios independientes conformados por residuos centrales de los motivos E2F y LxCxE modulados por residuos flanqueantes con función complementaria, más interacciones débiles en la región “ linker ”. El análisis de la región “ linker ”, sugiere que existe un fino balance entre repulsión de cargas y contactos hidrofóbicos débiles con pRb en regiones de interacción secundarias, las cuáles se encuentran altamente conservadas a nivel evolutivo y que contribuirían a su capacidad de interacción con múltiples blancos celulares. Los resultados del presente trabajo contribuyen a comprender las bases moleculares de las interacciones entre proteínas de virus y hospedador y los mecanismos mediante los cuales los virus toman control de la célula huésped, lo cual allana el camino para el desarrollo de estrategias terapéuticas contra el cáncer de etiología viral.

El trigo pan es uno de los cultivos de granos más importantes del mundo. Uno de losprincipales objetivos del mejoramiento genético a nivel mundial es el aumento delrendimiento en grano. El rendimiento es un carácter complejo, controlado por unelevado número de genes, con alta influencia ambiental e interacción genotipo porambiente. Sumado a esto, el trigo es una especie alohexaploide de origen muyreciente (~8000 años) y por esto, las relaciones entre genes homeólogos soncomplejas. Por lo tanto, el desafío de continuar mejorando sostenidamente elrendimiento requiere de la identificación de caracteres asociados al rendimiento defácil medición y del trabajo interdisciplinario (ecofisiología, mejoramiento genéticotradicional, genética molecular, bioinformática, estadística, entre otras).En este sentido, el objetivo del proyecto fue identificar regiones genómicas asociadasa la fertilidad de espiga (FE), un carácter de fácil medición a madurez, que estáfuertemente asociado al número de granos por superficie, el principal determinantedel rendimiento en trigo pan. Para esto, se utilizó una población de 146 líneasendocriadas recombinantes (RIL) derivadas del cruzamiento entre Baguette 10(madre de alta FE) y Klein Chajá (padre de baja FE). Se realizaron tres ensayos acampo, durante los ciclos agrícolas 2013, 2014 y 2015, para determinar la FE, comoasí también el rendimiento y sus componentes para cada una de las líneas y susparentales, además de otros caracteres de interés agronómico. Se analizó lacorrelación genética entre caracteres medidos y se estimaron los componentes devarianza de los mismos para calcular su heredabilidad en sentido estricto. Un grupode 126 RIL fue genotipificado con un ?chip? comercial (Axiom® 35K SNP WheatBreeder‟s Array, Affimetrix). Se construyó un mapa de ligamiento con 857 marcadoresSNP en 80 RIL, y se realizó un mapeo de QTL para los caracteres medidos a campo. xiiiLa distribución de frecuencia de la FE para la población mostró una formaacampanada para los tres años de evaluación fenotípica, y segregación transgresivahacia ambos lados de la distribución. La heredabilidad en sentido estricto del carácterfue de 0,84, con sólo un 11% de varianza total debida a la interacción genotipo xambiente. La FE estuvo positivamente asociada al número de granos por unidad desuperficie (r=0,48) mientras que estuvo negativamente asociada al peso de mil granos(r=-0,49). El rendimiento estuvo asociado al número de granos por superficie,mientras que no presentó asociación con el peso de mil granos.Se encontraron cuatro regiones genómicas (QTL) asociadas a la FE, en loscromosomas 1B, 2D, 5B y 7A. En total, estas regiones explicaron un 26% de lavariación total en FE, no hubo interacción QTL por año y no hubo ninguna interacciónentre QTL (p>0,05). Se desarrollaron marcadores homeólogo-específicos y aleloespecíficospara cada uno de los marcadores contenidos en el intervalo de confianzade cada uno de los QTL. Cinco de los seis marcadores desarrollados para el QTL delcromosoma 2D fueron probados en un grupo de individuos de la poblacióngenotipificada, pero no fue posible amplificar el polimorfismo correspondiente demanera consistente. Debido al amplio intervalo de mapa de las regiones genómicasque mostraron asociación con la FE, no fue posible avanzar en la búsqueda de genescandidatos para el carácter. No obstante, los resultados del presente trabajoconstituyen un avance significativo en el establecimiento de las bases genéticomolecularesde la fertilidad de la espiga, escasamente conocidos hasta el momento.

Tesis para obtener el grado de Doctora en Ciencias Agrarias, presentada en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en marzo de 2018.

Las leguminosas establecen una asociación simbiótica fijadora de nitrógeno con bacterias del suelo conocidas como rizobios. Cuando la planta crece en condiciones limitantes de nitrógeno comienza un intercambio de señales químicas con especies de rizobios compatibles presentes en la rizósfera, que permite un reconocimiento mutuo muy específico. La bacteria se adhiere a la punta de los pelos radicales, y la planta genera una estructura tubular llamada hilo de infección que permite el avance de la bacteria hacia las células del córtex. Allí se activan las divisiones celulares formando un nuevo órgano llamado nódulo, donde los rizobios son internalizados al citoplasma de las células vegetales y se lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico a formas fácilmente asimilables por la planta. Phaseolus vulgaris (poroto) es una leguminosa de origen americano que ha diversificado genéticamente en dos centros geográficos independientes, el Andino y el Mesoamericano. El estudio molecular de la diversidad de rizobios presentes en nódulos ha permitido determinar que Rhizobium etli es la especie que ocupa predominantemente los nódulos de P. vulgaris. A su vez, los cultivares de origen Mesoamericano nodulan preferentemente y de manera más eficiente con cepas que poseen el alelo tipo α en el gen nodC, mientras que las plantas de origen Andino nodulan más eficientemente con cepas con un alelo tipo δ. Este sistema representa un excelente modelo experimental para el estudio de los determinantes moleculares que participan en el reconocimiento específico entre ambos simbiontes y lleva al establecimiento de una interacción preferencial y más eficiente. Estudios previos de nuestro laboratorio permitieron identificar y caracterizar a nivel funcional distintos genes implicados en esta respuesta. Uno de ellos codifica para la subunidad C1 del factor de transcripción NF-Y, el cual es un regulador transcripcional requerido tanto para la infección bacteriana y la organogénesis del nódulo, como para la nodulación preferencial por cepas nodC-α. La subunidad NF-YC1 interacciona con las subunidades NF-YA1 y NF-YB7 formando un trímero funcional en la simbiosis. A su vez, NF-YC1 interacciona físicamente con un factor de transcripción de la familia GRAS denominado SIN1, el cual es requerido para la infección y organogénesis del nódulo, así como también para el desarrollo de raíces laterales, siendo un excelente ejemplo de la interconexión de programas transcripcionales en el desarrollo de dos órganos diferentes. En la presente Tesis doctoral se abordó la caracterización de las bases moleculares de una interacción simbiótica eficiente mediante el análisis transcriptómico por secuenciación masiva de ARN de raíces de plantas de poroto de origen Mesoamericano y Andino inoculadas con cepas tipo nodC-α, nodC-δ o con medio de cultivo a modo de control. Este análisis permitió identificar genes que se expresen de manera diferencial frente a las cepas más eficientes, y además, distinguir las respuestas moleculares específicas de cada cultivar frente a cada cepa. Estos genes codifican proteínas involucradas en diferentes procesos de percepción y señalización, regulación de la transcripción, procesos rédox y en modificaciones de la pared celular y la membrana plasmática, los cuales son requeridos para la iniciación y progresión de los hilos de infección. En una segunda etapa de este trabajo de Tesis se identificaron genes que son regulados de manera directa por los factores de transcripción NF-YC1, NF-YA1 y SIN en etapas tempranas de la simbiosis entre P. vulgaris y R. etli. Para ello se utilizaron plantas que expresan de manera ectópica y constitutiva estos factores de transcripción como fusiones traduccionales al epitope FLAG, las cuales se utilizaron en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) para identificar genes regulados directamente por dichos factores transcripcionales. Esta aproximación experimental permitió identificar genes que participan en la activación de las divisiones mitóticas y de la infección rizobiana. Por último, para profundizar en el conocimiento sobre la vía de transducción de señales que involucra a NF-YC1, en nuestro laboratorio se realizó un screening de una biblioteca de doble híbrido de levadura para identificar proteínas que interaccionen físicamente con NF-YC1. Uno de los clones identificados codifica una proteína quinasa, a la cual denominamos NF-YC1 Interacting Protein Kinase (NIPK). La interacción física entre NF-YC1 y NIPK fue confirmada mediante ensayos de doble híbrido, complementación bimolecular de fluorescencia y ensayos de co-inmunopreciptación. Posteriormente se caracterizó la localización subcelular de NIPK detectándose tanto en el citoplasma como en la membrana plasmática. La caracterización fenotípica de plantas de P. vulgaris silenciadas en NIPK utilizando dos RNA de interferencia (RNAi) dirigidos a diferentes regiones del mRNA, revelaron que NIPK sería requerido para la organogénesis y desarrollo de los nódulos, así como también la frecuencia de la infección rizobiana. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de Tesis no sólo contribuyen a comprender en mayor detalle los mecanismos moleculares que gobiernan el establecimiento de una simbiosis fijadora de nitrógeno eficiente entre P. vulgaris y R. etli, sino que también sienta las bases para futuros proyectos de investigación y desarrollo que permitan optimizar la fijación de nitrógeno en una planta de interés agronómico y alto valor social para los pueblos del Noroeste Argentino.

Los virus fitopatógenos producen alteraciones en el metabolismo y la fisiología de sus huéspedes provocadas principalmente por alteraciones en la expresión génica durante las infecciones. Numerosos cambios están asociados a respuestas de estrés y defensa y sus efectos secundarios son probablemente causantes de los síntomas. El uso de plantas transgénicas que expresan proteínas virales constituye un sistema útil para estudiar la complejidad de la interacción planta-virus. Con el fin de determinar patrones de expresión génica alterados, se emplearon líneas que expresan proteínas del TMV sin función supresora del silenciamiento: la proteína de cápside mutada (CPT42W), la proteína de movimiento (MP)y una línea co-expresante (MPxCPT42W)que mostró alteraciones morfológicas (semejantes a síntomas)y de acumulación de miARNs. Se realizó un microarreglo para detectar cambios transcripcionales asociados a la coexpresión de CPT42W y MP, utilizando como control una línea isogénica con ambos transgenes silenciados y fenotipo normal (mpxcpT42W*). Se estudiaron procesos biológicos cuyos genes mostraron alteraciones por la co-expresión de CPT42W y MP, focalizando en vías relacionadas a estrés oxidativo, inmunidad innata y vías degradación de ARN. Se demostró que CPT42W y MP modularon la defensa innata de un modo complejo: MP parecería actuar como inductor de defensa, alterando los niveles de ERO y SA mientras que CP jugaría un rol antagónico, inhibiendo la expresión de PR-1 y RDR1. Por otro lado, estudios funcionales en vías de degradación de ARN, demostraron que genes componentes del ARN exosoma, inducidos por la expresión de MP y CPT42W, estarían implicados en la alteración de miARNs y constituirían mecanismos alternativos subyacentes a la generación de síntomas en infecciones virales. Este trabajo constituye un importante aporte al entendimiento de los mecanismos de defensa antiviral y de producción de síntomas, proporcionando herramientas para diseñar nuevas estrategias biotecnológicas de control de virosis en cultivos de interés agronómico

En esta tesis doctoral se abordó el estudio de los parámetros que regulan las reacciones de transferencia electrónica (TE) en sistemas proteicos dentro del marco teórico desarrollado por Marcus. Para ello se emplearon métodos espectroscópicos, electroquímicos, espectroelectroquímicos y computacionales. En particular, se investigaron dos componentes de la cadena de transporte respiratorio: el citocromo c (Cyt), un transportador soluble de electrones y el centro de CuA, el aceptor primario de la citocromo c oxidasa. En primer lugar, se estudió el rol de la dinámica proteica del Cyt y su modulación por campos eléctricos de relevancia biológica. Se verificó que dicha dinámica es crucial en la regulación de las reacciones de TE que tienen lugar en la cadena de transporte de electrones a través de la modulación del acoplamiento electrónico entre donor y aceptor. Por otro lado, se encontró evidencia de que el campo eléctrico regularía la alternancia entre dos conformaciones del Cyt que difieren principalmente en la magnitud de la energía de reorganización. Finalmente, se constató el rol fundamental de las fluctuaciones térmicas y la dinámica proteica para las reacciones de TE en centros de CuA. Dichos centros podrían alternar entre dos estados electrónicos distintos, en los cuales el balance entre la energía de reorganización y el acoplamiento electrónico permitiría conferir direccionalidad a las reacción de TE a pesar de presentar un ΔG≈0. El conjunto de los resultados obtenidos sugiere que los procesos de TE en sistemas biológicos se encuentran finamente regulados, y en particular nos permiten postular un mecanismo de retroalimentación negativa cuyo actor principal es el campo eléctrico interfacial.

Fil:Chazenbalk, Gregorio Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.