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Se describe el aislamiento y elucidacíón estructural de los withanólidos presentes en las especies Datura ferox, Jaborosa runcinata y Jaborosa odonelliana, utilizando técnicas espectroscópicas combinadas con modelado molecular. De la especie Datura ferox recolectada en la provincia de Córdoba, se aislaron, por dos métodos diferentes, cuatro withanólidos novedosos: el 15-hidroxiderivado de la nicandrina B y las daturolactonas 5, 6 y 7, además de siete withanólidos conocidos, withaferoxólido, withanólido mayoritario de esta especie, withanicandrina, withastrarnonólido, withametelina E y las daturolactonas l, 2 y 3. De la especie Jaborosa runcinata recolectada en la provincia de Entre Ríos, se aislaron siete jaborosolactonas novedosas de tipo espiránico: las jaborosolactonas 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 9. Estos compuestos presentaron un sistema l7(20)-en-22- ceto, funcionalizacíón no encontrada previamente en la familia de los withanólidos, siendo la principal diferencia entre los mismos la sustitución en el anillo B. De la especie Jaborosa odonelliana recolectada en la provincia de Salta en abril y diciembre, se aislaron, además de jaborosolactona P, compuesto mayoritario previamente reportado en esta planta, seis withanólidos espiránicos novedosos: las jaborosolactonas 10, ll, 12, 13 , 14 y 15. Como en el caso de los withanólidos aislados de Jaborosa runcinata, la principal diferencia entre los compuestos aislados era la sustitución en los anillos A y B, siendo la cantidad y tipo de withanólidos diferente en ambas épocas de recolección. Esta variación estacional había sido encontrada previamente en otro tipo de Solanáceas, habiéndose relacionado en algunos casos, con mecanismos de defensa química. Los compuestos mayoritarios de las especies antes mencionadas se evaluaron como antialimentarios de larvas de insectos y como agentes quimiopreventivos del cáncer obteniéndose resultados prometedores.

Se describe el aislamiento y elucidación estructural de los withanólidos de S. origanifolia recolectada en Buenos Aires en invierno y de la misma planta recolectada en la Pcia. de Salta en primavera-verano. De plantas recolectadas en Buenos Aires en agosto se aislaron cuatro salpichrólidos novedosos con anillo D aromático: los salpichrólidos E y F de cadena lateral no cíclica, los salpichrólidos H e I como mezclas 26R/26S que presentan la apertura hidrolítica del 24,25-epóxido en la cadena lateral y además el salpichrólido A, mayoritario de esta especie y el salpichrólido C. De planta recolectada en noviembre se aislaron los salpichrólidos A y C y un withanólido fenólico nuevo, el 15-hidroxiderivado del salpichrólido A. De S. origanifolia recolectada en la Pcia. de Salta se aislaron además de los salpichrólidos A y C tres withanólidos nuevos con anillo D aromático: los salpichrólidos J y K con estado de oxidación de C-22 y C-26 invertido y el salpichrólido M, isómero del salpichrólido H con estereoquímica inversa en C-24 y C-25. También se obtuvieron dos withanólidos nuevos con anillo D de cinco miembros: los salpichrólidos L y N. Los withanólidos aislados permitieron aclarar los caminos biosintéticos y degradativos en Salpichroa origanifolia. El seguimiento cromatográfico anual de los salpichrólidos mayoritarios, junto con los resultados de ensayos de actividad antialimentaria frente a Tribolíum eastaneum y Musca domestica sugieren que estos compuestos desempeñan rol insecticida en la planta.

Fil:Buzzola, Fernanda Roxana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Rickettsia massiliae es un miembro del grupo de la fiebre manchada del género Rickettsia que fue aislado por primera vez en una garrapata Rhipicephalus turanicus de Francia. En el nuevo mundo, se detectó en garrapatas Rhipicephalus sanguineus de diferentes lugares de Argentina y EE.UU., pero sólo fue aislada en Arizona. El objetivo de este estudio fue el aislamiento y la caracterización genética de R. massiliae desde garrapatas R. sanguineus colectadas en perros de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (Argentina). Se colectaron 49 garrapatas R. sanguineus de 10 perros, que fueron agrupadas en 10 grupos de 4-5 ejemplares. Mediante PCR para un fragmento del espacio intergénico 23S-5S del género Rickettsia, 1 grupo de 5 garrapatas resultó positivo. Las secuencias obtenidas exhibieron una identidad del 100% con R. massiliae. De este grupo de garrapatas positivas se obtuvo un aislamiento, denominado cepa CABA, mediante la inoculación en monocapas de células Vero. Las características genotípicas se determinaron mediante PCR para fragmentos de seis genes: espacio intergénico 23S-5S, ompA, ompB, gltA, htrA y sca1. La cepa CABA resultó similar genéticamente a los hallazgos anteriores en Argentina (en CABA y Bahía Blanca), mientras que presentó sólo 4 nucleótidos de diferencia con respecto a la cepa Bar29 aislada en España (considerando 5 fragmentos génicos, dado que no se encuentran disponibles secuencias del gen htrA de Bar29) y sólo 6 nucleótidos de diferencia con respecto a la cepa AZT80 aislada en EE. UU. (considerando los 6 fragmentos génicos). En los árboles filogenéticos de R. massiliae cepa CABA se observan agrupamientos similares entre los distintos fragmentos génicos analizados. Aunque pocos casos humanos fueron confirmados por este patógeno, su circulación en las zonas urbanas es de gran importancia para la salud pública. Este aislamiento mejora el conocimiento del patógeno circulante y podría mejorar el futuro de diagnóstico, ya que permite la producción de antígeno más específica para las pruebas serológicas para el diagnóstico de rickettsiosis.

Desde su primera descripción en 1988, los enterococos resistentes a vancomicina (EVR) se han tornado un grave problema para la salud pública. La colonización precede y predispone generalmente a infecciones como endocarditis o bacteriemia especialmente en pacientes añosos, inmunocomprometidos o posquirúrgicos. Los EVR pueden colonizar el intestino de estos pacientes y pueden persistir durante largos períodos, lo cual resulta en costos muy elevados para los centros hospitalarios teniendo en cuenta los gastos de aislamiento y cohortización del paciente. Hasta el momento no ha podido establecerse un método que permita la descolonización de EVR en seres humanos. En este marco proponemos como objetivo general la utilización de bacteriófagos líticos como herramientas para ese fin. En la primera fase el objetivo específico fue el aislamiento y caracterización de bacteriófagos líticos apropiados para la descolonización. Para el aislamiento de los mismos se utilizaron muestras clínicas filtradas y ensayadas sobre cepas de enterococos tanto resistentes como sensibles a la vancomicina. Con este procedimiento se aislaron cinco bacteriófagos líticos sobre distintas cepas del género Enterococcus spp., los cuales fueron denominados siguiendo normativas taxonómicas internacionales como ΦBE1, ΦBE2, ΦBE3, ΦBE4, y ΦBE5 respectivamente. El fago ΦBE2 presentó un mayor espectro de infectividad, ya que resultó producir lisis sobre todas las cepas de EVR ensayadas. Se realizó la puesta a punto de un protocolo para la extracción y caracterización del material genético de cada uno de los bacteriófagos aislados y se construyó en particular una biblioteca genómica del bacteriófago ΦBE2. El fago ΦBE2 fue escogido además para realizar los experimentos de descolonización in vitro e in vivo. Se pusieron a punto las condiciones y medios apropiados para el almacenamiento a largo plazo de las suspensiones de fagos. La combinación de la utilización del buffer SM con una temperatura de -20°C resultó ser la condición apropiada para este fin. Se logró demostrar la capacidad lítica de los bacteriófagos ensayados tanto in vitro como in vivo. Se pusieron a punto las diferentes variables para trabajar con el modelo in vitro como con el modelo animal. Se trabajó con los diferentes bacteriófagos aislados y se concluyó que los mismos eran capaces de lisar diferentes aislamientos clínicos de enterococos tanto sensibles como resistentes a vancomicina. Además, se tomaron microfotografías electrónicas de los bacteriófagos aislados para estudiar su morfología y clasificarlos taxonómicamente. Para ello se tuvieron en cuenta caractericticas morfológicas de la cabeza y cola, las dimensiones de los fagos como asi tambien la homología de acidos nucleicos realizando la comparación con secuencias almacenadas en bases de datos. La segunda fase tuvo como objetivo específico la evaluación de los fagos en un modelo animal. Los ensayos realizados en el modelo de descolonización con células Caco-2, demostraron que la actividad del bacteriófago ΦBE2 se mantenía aun cuando las bacterias estaban adheridas a las microvellosidades. Se ensayaron diferentes variables para intentar determinar las vías y concentraciones óptimas de administración de los bacteriófagos en modelo murino. Se concluyó que la vía óptima de administración de las suspensiones de bacteriófagos de concentración conocida era la vía oral no forzada mediante la dilución de estas suspensiones en agua de bebida. Se determinó además la forma de recuento de las colonias bacterianas y de los bacteriófagos, como así también el agrupamiento y duración de cada experimento. En diferentes ensayos se observó que en los grupos de ratones tratados con las suspensiones fágicas individuales o un cóctel de tres fagos los recuentos de enterococos disminuyeron con valores estadísticamente significativos comparando con los grupos controles. Sin embargo no se logró la completa descolonización.

Fil:Guerra, Fabiana Karina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Gadaleta, Patricia Gladys. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Elizalde, Patricia Virginia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La enzima nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa) es ubicua y cataliza la síntesis de NTPs a partir de sus correspondientes NDPs y un NTP dador (fisiológicamente el ATP). La reacción sigue una cinética de ping-pong con la formación del intermediario de alta energía (P)NDP quinasa. Aparte de su rol fundamental en la síntesis de NTPs, se ha relacionado a esta enzima con a) la activación de proteínas G en la transducción de señales, b) la diferenciación de Drosophila y distintas líneas celulares, c) inhibición de metástasis (nm23), y recientemente ha sido identificada como d) un factor de transcripción. En el presente trabajo se presentan resultados de la purificación y caracterización de la NDP quinasa de Candida albicans, un hongo patógeno oportunista de vertebrados. Se caracterizó la enzima bioquímicamente, en cuanto a su tamaño, al número de subunidades, su punto isoeléctrico, su estabilidad térmica, y la posibilidad de usar distintos NTPs y NDPs como dadores y aceptores de la reacción. A través de dos enfoques experimentales diferentes se demostró que los nucleótidos de guanina y adenina son los mejores aceptores de la reacción (Arch). Biochem. Biophys. (1995), 187-194). Se evaluó a su vez, la capacidad de NDP quinasas de distinto origen de fosforilar a análogos de nucleótidos utilizados en terapias antivirales; para ello, se desarrolló la metodología para medir la actividad NDP quinasa con estos sustratos (J. Biol. Chem. (1996), 271, en prensa). Se estudió la actividad y la presencia de la enzima durante el crecimiento y la morfogénesis del hongo; la actividad específica máxima se encontró durante el crecimiento logarítmico (An. Asoc. Quím. Argent. (1993), 81, 4-5, 359-366). Se realizó un estudio detallado del proceso de autofosforilación de la NDP quinasa, y se encontró que sólo se encuentra autofosforilada en residuos de histidina. La autofosforilación de la enzima también se realizó en extractos crudos de C. albicans y de Escherichia coli. Dado que la NDP quinasa se autofosforila en residuos de histidina como parte de su mecanismo de acción, los ensayos para estudiar la posible regulación de la enzima por fosforilación a través de alguna quinasa necesitan de una metodología que pueda distinguir la fosforilación en histidina de aquella en serina o treonina. Se desarrolló entonces una metodología sobre membranas de Immobilon con el uso de buffers de pH 1 y 14 con el agregado de 5 por ciento metano. Esta metodología se utilizó para estudiar la fosforilación in vivo en C. albicans y en células HeLa en cultivo. Se discuten las posibles implicancias de la fosforilación en serina in vivo.