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Los iones metálicos están involucrados en todas las fases de la vida y juegan roles primordiales en el crecimiento celular y el funcionamiento metabólico pero pueden ser tóxicos cuando su concentración supera un umbral determinado. En particular, las bacterias han desarrollado sistemas que permiten monitorear estos iones y modular la expresión de factores involucrados en la remoción de los mismos para mantener su homeostasis y prevenir su toxicidad. Salmonella Typhimurium, una enterobacteria capaz de sobrevivir tanto en el medio ambiente como en el hospedador, dispone de sistemas de detoxificación/resistencia específicos, controlados por reguladores transcripcionales que monitorean la concentración intracelular del metal. Entre estos, es de destacar a CueR, que ante la presencia de Cu(I) en el citoplasma induce la transcripción de copA, cuiD y cueP. Los productos de estos genes participan en forma directa y específica en la resistencia al metal. Salmonella dispone además de sistemas no específicos de respuesta a estrés celular que son importantes moduladores de las respuesta global a metales. En este trabajo, vinculamos la resistencia al estrés por Cu con el sistema de fosfotransferencia Rcs de respuesta a estrés en la envoltura. Observamos que este sistema se activa en presencia de concentraciones subletales de Cu provocando la síntesis de la cápsula de ácido colánico en la cepa sensible a Cu ΔcuiD. Determinamos que el sistema Rcs confiere resistencia al Cu y que la sobreexpresión de CueP impide la activación de dicho sistema provocada por Cu Por otro lado, demostramos la participación del sistema de dos componentes CpxAR de respuesta a estrés periplasmático, que junto con CueR regulan transcripcionalmente la expresión de cueP. Estudiamos los aspectos mecanísticos de esta co-regulación y analizamos su relevancia fisiológica para la sobrevida en condiciones de estrés. Finalmente, identificamos nuevos componentes en el locus cueP; un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de 3,5 kDa que denominamos CueQ y que es cotranscripta junto a cueP, y un ARN regulatorio codificado en cis que afecta específicamente la traducción de cueQ dentro del operón.

El manganismo es un desorden neurodegenerativo originado por la sobreexposición crónica a Mn, cuyo cuadro clínico y vías de señales se asemejan a los de la Enfermedad de Parkinson Idiopática. El Mn se acumula preferentemente en los ganglios basales y en particular, en las mitocondrias y lisosomas, donde puede generar especies reactivas de oxígeno y afectar las membranas de estas organelas. La permeabilización de la membrana lisosomal (PML) conduce a la liberación de hidrolasas al citosol y a la apoptosis y puede también comprometer la degradación autofágica. En el presente trabajo se investigó el daño lisosomal inducido por Mn y el impacto de este evento en la muerte de las células C6 de glioma de rata. Parte de los resultados obtenidos fueron trasladados a un modelo in vivo de intoxicación aguda con Mn. Por lo tanto, el enfoque estuvo dirigido al estudio de la posible participación de la vía lisosomal en la apoptosis inducida por Mn y al rol potencial de la autofagia en este contexto celular. Los ensayos in vitro se realizaron empleando células expuestas a MnCl2 en distintas condiciones de incubación. Se demostró que el Mn induce un aumento en el tamaño de las vesículas ácidas que puede ser totalmente prevenido por preincubación con antioxidantes. Asimismo, la exposición al metal genera PML y liberación de Catepsina D (CatD) al citosol, procesos que tienen lugar rio arriba de la injuria a la mitocondria. El estudio del rol de las catepsinas en la vía de muerte celular apoptótica demostró que las CatD y B regulan los niveles de expresión de FasL, intervienen en el clivaje de caspasa-8 y Bid y en la activación de la vía de muerte mitocondrial. En este contexto, el Mn activó la autofagia como un mecanismo de supervivencia celular. Los estudios in vivo sugieren que los efectos tóxicos del Mn resultan en un daño a los astrocitos del striatum y en la alteración de los niveles de expresión de la CatD en las neuronas de ciertos ganglios basales involucrados en el manganismo. En conjunto, nuestros resultados demuestran por primera vez que los lisosomas constituyen un blanco estratégico de la toxicidad del Mn, integrando la cascada de señales implicadas en la apoptosis. En este escenario, la autofagia se desencadena en un intento de rescatar a las células de la muerte. Estos hallazgos contribuyen al conocimiento de los mecanismos de daño posiblemente activados en el manganismo y probablemente en otras enfermedades neurodegenerativas.

El objetivo de esta tesis es estudiar rotaciones e isomerizaciones moleculares de sondas ópticas incorporadas en matrices poliméricas. Estos procesos tienen en común el hecho de que involucran grandes movimientos moleculares, por lo que son sensibles al grado de flexibilidad del entorno y al volumen disponible para el movimiento. Las rotaciones moleculares fueron estudiadas a través de medidas de anisotropla de fluorescencia. En una primera parte del trabajo se estudió la rotación de una serie de carbocianinas en alcoholes normales con el fin de investigar la dinámica de la rotación molecular. Los resultados mostraron que el régimen hidrodinámico de rotación, así como la influencia de factores no hidrodinámicos como la fricción dieléctrica, depende del grado de interacción soluto-solvente, determinado principalmente por la capacidad de la cianina de establecer uniones puente de hidrógeno. Por otro lado, se estudió la rotación molecular de una serie de sondas que difieren en forma y tamaño, en una matriz de poliestireno entrecruzado. Los resultados mostraron que estas sondas pueden realizar amplios movimientos durante el tiempo de vida del estado excitado, con una pequeña restricción que correlaciona con el tamaño de la sonda. Las restricciones al movimiento pueden provenir de interacciones sonda-matriz, o pueden deberse a limitaciones en el volumen libre. En una segunda parte del trabajo se estudió el fotocromismo y termocromismo de espiropiranos y espirooxazinas en poli(metacrilatos de alquilo). Estas sustancias isomerizan al ser irradiadas en el UV, formando una merocianina, un isómero coloreado producido por apertura de un ciclo. La merocianina revierte termicamente a la cerrada, que es la más estable. En el caso del fotocromismo, el trabajo se centró en el estudio de la cinética de la transfromación térmica entre la merocianina y el isómero cerrado. El objetivo principal fue analizar las causas por las cuales la matriz provoca desviaciones en la cinética respecto del comportamiento monoexponencial observado comúnmente en solución. El análisis cinético se realizó mediante los modelos habituales de bibliografia, y se elaboró uno nuevo que incorpora la dinámica de la matriz en forma simultánea al decaimiento de la sonda. Los modelos fueron analizados comparativamente, y se discuten las ventajas y desventajas de cada uno. En forma similar a lo realizado para la cinética, en el estudio del termocromismo el objetivo fue el de analizar la influencia de la matriz sobre el equilibrio entre la forma abierta y cerrada, y su dependencia con la temperatura. Los resultados fueron analizados mediante un modelo que se elaboró en este trabajo para interpretar cuantitativamente las desviaciones obtenidas respecto del comportamiento observado en los solventes comunes. Este modelo supone que las distribuciones de energia total de las formas abierta y cerrada es Gaussiana. Por último se estudiaron las propiedades piezoeléctricas y de electrostricción de peliculas delgadas de poli(metacrilato de isobutilo) conteniendo espiropirano y merocianina, con el objetivo de investigar los posibles cambios en las propiedades dieléctricas y mecánicas de la pelicula al inducir la isomerización fotoqulmicamente. Las medidas permitieron detectar un efecto piezoeléctrico fotoinducido y además medir el momento dipolar del fotoisómero directamente en la matriz de polímero, lo cual no habla podido lograrse hasta el momento mediante las técnicas comunes debido a su corto tiempo de vida.