Catálogo de publicaciones

AKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejosproteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi. AKAP350 está implicada en laregulación de la dinámica de los microtúbulos y participa en el desarrollo de la polaridadmigratoria y la polaridad epitelial hepática. En este trabajo se analizó la participación deAKAP350 en el desarrollo de dos tipos de asimetría celular: la polaridad epitelial columnary la sinapsis inmune.En una primera instancia utilizamos cultivos celulares 3D de células epiteliales paraanalizar la relevancia de AKAP350 en el establecimiento y mantenimiento de la polaridadepitelial. Las células con expresión disminuida de AKAP350 (AKAP350KD) formaron quistespolarizados con una morfología anormal del lumen. La organización de células epitelialesen estructuras organotípicas con un único lumen requiere que las divisiones celulares selleven a cabo en forma simétrica respecto al plano del epitelio. Aún no se hancaracterizado completamente las vías de señalización que proveen conexionesmoleculares entre regiones específicas de la corteza celular y los microtúbulos del husomitótico, y que, por lo tanto, definen la orientación del huso mitótico. El análisis de lascélulas mitóticas mostró que las células AKAP350 KD presentaron un alineamientodefectivo del huso mitótico. EB1 es una proteína asociada a los microtúbulos queparticipa en la regulación de la orientación del huso mitótico en células epiteliales.Nuestros hallazgos indicaron que AKAP350 colocaliza en los polos del huso con EB1. Losresultados del análisis de la distancia mínima entre ambas proteínas por FRET fueroncompatibles con la interacción de ambas proteínas en dichas estructuras. Experimentosde co-inmunoprecipitación mostraron la interacción de EB1 con el dominio N- terminal deAKAP350, el cual es también el sitio de unión a la subunidad de la dinactina p150glued. Ladisminución de la expresión de AKAP350 generó una reducción de los niveles de EB1 enlos polos del huso y en los microtúbulos del aster. El aumento en los niveles de EB1 en lospolos mitóticos y en los microtúbulos del aster inducido por sobreexpresión de estaproteína compensó el efecto de la disminución de la expresión de AKAP350 sobre laorientación del huso. La deslocalización específica de AKAP350 del centrosoma, así comola interferencia en su interacción con EB1, indujeron fenotipos similares a los de AKAP350KD, respecto tanto a la localización de EB1 como a la formación del lumen. En estascondiciones también se observó una disminución de los niveles de p150glued en loscentrosomas y en los microtúbulos del aster. Concluimos que AKAP350 recluta a EB1 y2p150 glued a los polos del huso, asegurando la presencia de estas proteínas en losmicrotúbulos del aster y una correcta orientación del huso mitótico durante lamorfogénesis epitelial.Tanto EB1 como AKAP350 participan en la ruptura de la simetría durante elestablecimiento de la sinapsis inmune en célulasT no citolíticas. En una segunda etapa,realizamos experimentos destinados a evaluar la participación de AKAP350 en elposicionamiento de EB1 durante la adquisición de asimetría celular asociada a laformación de la sinapsis inmune citolíticaen células natural killer (Nks). Inicialmentecaracterizamos la presencia de AKAP350 en células YTS, una línea celular proveniente decélulas Nks. A partir de las mismas, se obtuvieron células con la expresión disminuida deAKAP350 (YTS AKAP350 KD). Se utilizó un modelo bien establecido de sinapsis inmunecultivando las células YTS en presencia de células derivadas de eritroleucemia (KT86).Hallazgos de nuestro grupo indicaron que AKAP350 participa en el desarrollo de lapolaridad celular en este modelo. En dichas condiciones, utilizando microscopía confocal,se determinamos que AKAP350 modula la localización centrosomal de EB1. En conclusión,demostramos que AKAP350 modula el direccionamiento del huso mitótico en célulasepiteliales a través del reclutamiento de EB1 hacia los polos y, consiguientemente, hacialos microtúbulos asociados a estas estructuras. En forma similar, AKAP350 también reclutaEB1 hacia el centrosoma durante el establecimiento de la sinapsis inmune citolítica encélulas NK. A través del reclutamiento de EB1 a los polos del huso mitótico, AKAP350interviene en el mantenimiento de la polaridad epitelial planar. La relevancia de lainteracción entre ambas proteínas en la reorganización de las estructuras subcelulareshacia el sitio de contacto con la célula blanco es un aspecto importante a investigar enfuturos estudios.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2014. - 150 h. + CD. tabls.; grafs.;figus. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

El virus Junín (JUNV), miembro de la familia Arenaviridae, es el agente causal de la fiebre hemorrágica argentina, enfermedad endemo-epidémica que afecta una amplia zona central de la República Argentina y para la cual, si bien existe una vacuna atenuada eficaz, no hay disponible un tratamiento antiviral específico.Numerosos virus modulan diferentes vías de señalización celular entre las que se encuentran aquellas mediadas por las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP quinasas), proteínas implicadas en la proliferación, supervivencia, diferenciación y apoptosis celular.El presente trabajo de tesis tuvo como objetivos analizar el estado de activación de las vías dependientes de MAP quinasas Raf/MEK/ERK y p38 en la infección de JUNV en cultivos celulares, establecer la importancia de estas vías para la infección y determinar el rol que cumple la vía Raf/MEK/ERK en diferentes etapas del ciclo de multiplicación viral.Se demostró que la infección con JUNV induce la activación de Raf/MEK/ERK en diferentes líneas celulares, mientras que la activación de p38 es dependiente del sistema celular analizado. Se comprobó que en cultivos de células Vero la activación de Raf/MEK/ERK es de tipo bifásica, observándose una primera activación temprana y una segunda fase de activación a las 7 h pos-infección, mientras que la fosforilación de p38 se hace evidente fundamentalmente a tiempos tardíos de la infección. El bloqueo de las vías mediante inhibidores químicos o RNAs de interferencia demostró que ambas rutas de señalización promueven la multiplicación de JUNV. La producción de virus infeccioso y la expresión de proteínas virales se redujeron de manera notoria en presencia de inhibidores específicos de cada una de las cascadas de señalización, tanto en células de mono como en líneas celulares humanas. El análisis detallado del papel de la vía Raf/MEK/ERK en diferentes etapas del ciclo de multiplicación de JUNV mostró que esta ruta de señalización no estaría implicada en las etapas iniciales de la infección como la adsorción, la internalización o el desnudamiento viral sino en la síntesis de RNA viral. Esto último se puso en evidencia mediante la cuantificación de los niveles de RNA viral en cultivos celulares tratados con U0126, inhibidor específico de la vía. Estos hallazgos se corroboraron empleando un sistema de genética reversa basado en análogos del genoma del arenavirus Tacaribe, virus estrechamente emparentado con JUNV. Se determinó además que la inhibición de la vía no afectaría la traducción de proteínas virales, por lo cual la reducción de la expresión de proteínas virales detectada en los cultivos celulares tratados con U0126 sería consecuencia de la inhibición de la síntesis de RNA viral. El tratamiento con el inhibidor de la vía Raf/MEK/ERK tampoco afectó los niveles de fosforilación del factor eIF2α, componente celular clave en el proceso de traducción.Los resultados obtenidos en este trabajo muestran por primera vez la capacidad de JUNV de activar vías de señalización celular dependientes de MAP quinasas y ponen en evidencia que las mismas son relevantes en la multiplicación de este virus. Asimismo, cabe destacar que la comprensión del papel de las rutas de transducción de señales en la replicación y patogénesis viral tiene importantes implicancias en el desarrollo de nuevas terapias antivirales, dado que la modulación de estas vías podría constituir una estrategia terapéutica con bajo riesgo de aparición de resistencia viral y efectiva frente a diferentes virus que manipulen de manera similar estos mecanismos de señalización.

El cuerpo lúteo (CL) es una glándula endócrina transitoria esencial para lasupervivencia e implantación del embrión. Es por esto que su formación, función yregresión están estrictamente reguladas a través de diversas vías de señalización. En estatesis se estudió el rol de los sistemas Notch y Wnt/β-catenina sobre el desarrollo yfunción del CL de ratas. También se analizó la interacción de ambas vías con la acciónde la progesterona.El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitrodel sistema Notch y su interacción con progesterona en cultivo de cuerpo lúteo de rata.Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG. Cuatro días después, los animales sufrieron eutanasia. Se aislaron losCLs y se cultivaron en presencia de Aminoglutetimida (AG, inhibidor de la síntesis deprogesterona), DAPT (inhibidor del sistema Notch), progesterona, de DAPT enpresencia de progesterona, o vehículo de las drogas (DMSO). Luego de una o 4 horas decultivo, se recolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidadluteal midiendo la concentración de progesterona en el medio. Se evaluó laparticipación del sistema Notch y de progesterona en cuanto al contenido de proteínaspro- y anti-apoptóticas, regulación de las enzimas esteroidogénicas, contenido de PCNA(marcador de proliferación) y nivel de fosforilación de AKT y ERK.DAPT produjo una disminución de la producción de progesterona. A su vez se observóuna disminución en el contenido luteal de la enzima P450scc. La presencia deprogesterona en el medio de cultivo aumentó los niveles de StAR, efecto que fueimpedido al inhibir la vía de Notch. El cultivo con DAPT produjo un aumento de larelación entre proteínas pro:anti-apoptóticas y un aumento del fragmento activo decaspasa 3. Este aumento en la apoptosis fue revertido con la presencia de progesteronaen el medio de cultivo. Para determinar la proliferación de células del CL, se cuantificóel contenido de PCNA. Progesterona incrementó significativamente los niveles deResumen2PCNA, y este aumento fue impedido por DAPT. Además, DAPT disminuyó lafosforilación de AKT, la cual se restituyó con la incubación junto a progesterona.Los resultados de este capítulo muestran por primera vez la existencia de unainteracción entre Notch y progesterona que promueve la función y supervivencia delCL.El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la implicancia dela vía Wnt/β-catenina en la función del ovario de ratas superovuladas.Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG, día en que los animales fueron operados. A un grupo se le administróbajo la bursa de ambos ovarios un inhibidor específico de la vía Wnt/β-catenina(XAV939), mientras que el grupo control recibió la dosis equivalente del vehículo delinhibidor (DMSO). Lo animales sufrieron eutanasia 24 o 48 horas luego de la cirugía.Se estudió el desarrollo folicular y la formación de CL en ovarios de cada grupoexperimental y se evaluó también la concentración de progesterona sérica. En extractoproteico de CLs se midió el contenido de proteínas pro- y anti-apoptóticas, de enzimasesteroidogénicas y de PCNA. Además, se determinó el grado de fosforilación de lasproteínas AKT y ERK. Por último, se cuantificaron los niveles de VEGF luteal y seestudió el desarrollo vascular del CL mediante marcación con lectina BS-1.La inhibición in vivo de la vía Wnt/β-catenina produjo una disminución en el porcentajede CLs, efecto que estuvo acompañado por la aparición de estructuras quísticas. Laconcentración de progesterona sérica disminuyó en los animales tratados con XAV939,como así también el contenido luteal de la proteína StAR. La administración deXAV939 aumentó el balance entre proteínas pro:anti-apoptóticas, incrementando laapoptosis en células del CL. A su vez, XAV939 disminuyó los niveles de ERKfosforilado y el contenido de PCNA en CL. Además, la inhibición de la vía Wnt/β-catenina disminuyó el porcentaje de área endotelial en CL y redujo el contenido lutealde VEGF. La doble marcación para PCNA y lectina reveló que la mayoría de las célulasproliferativas son las endoteliales. Estos resultados demuestran por primera vez que lavía Wnt/β-catenina está involucrada en el proceso de ovulación y funcionalidad lutealde ratas prepúberes tratadas con gonadotrofinas.El tercer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitro delsistema Wnt/-catenina sobre la expresión de miembros del sistema Notch.Resumen3Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG. Dos días luego de la administración de hCG, los animales sufrieroneutanasia. Se aislaron los CLs y se cultivaron en presencia de ICG-001 o soluciónvehículo (DMSO). El ICG-001 es un inhibidor de la vía de Wnt/β-catenina con unmecanismo de acción distinto al de XAV939. Luego de 12 horas de cultivo, serecolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidad lutealmidiendo la concentración de progesterona en el medio. En extractos de ARN de CLs seestudió la expresión de miembros del sistema Notch, y en extractos proteicos se midióel contenido de la proteína StAR.ICG-001 disminuyó la producción de progesterona y el contenido de la proteína StAR,reproduciendo el resultado observado con XAV939 en el capítulo II. Además, lainhibición de la vía Wnt/β-catenina produjo un aumento de la expresión génica delreceptor notch1, del ligando jagged1, del efector hes1 y del regulador rbpjκ. Losresultados de este capítulo muestran que, ante la inhibición de Wnt/β-catenina, lascélulas del CL promueven la activación de la vía de Notch, posiblemente comomecanismo compensatorio para recuperar la homeostasis celular.Los resultados de esta tesis demuestran que los sistemas Notch y Wnt/β-catenina estánimplicados en la regulación del desarrollo y función del CL de rata. A su vez, revelan laexistencia de una interacción entre estas vías y la progesterona que promueve lafuncionalidad luteal.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra. INIMEC-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2013. 176 h. + CD; grafs.; tabls. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Laboratorio de Neurofarmacología. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Católica de Córdoba-Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas-IIByT-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 148 h. + CD. tabls.; figuras. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.