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El objetivo general de esta tesis fue determinar el papel de la senescencia foliar en la tolerancia de las plantas superiores al déficit hídrico. La aproximación experimental consistió en comparar la respuesta a la sequía de líneas casi isogénicas de soja que senescen normalmente (genotipo silvestre, ggD1D1D2D2) o con mutaciones que provocan un fenotipo stay green (genotipo GGd1d1d2d2). La combinación al estado homocigota de los genes G (dominante) y d1 y d2 (recesivos) provoca la inhibición de un amplio espectro del síndrome de senescencia foliar, manteniendo la integridad del cloroplasto cuando en el genotipo silvestre se han degradado la mayor parte de los componentes del estroma y la membrana tilacoidal. Sin embargo, se comprobó que la combinación al estado homocigota recesivo de los genes d1 y d2 también provoca una mayor sensibilidad a la sequía. Ante una situación de estrés hídrico, las hojas del mutante d1d1d2d2 (con o sin G) experimentan una deshidratación irreversible a niveles de estrés mucho menores que los necesarios para causar el mismo fenómeno en el genotipo silvestre. La deshidratación comienza en los bordes de la hoja y luego se extiende hacia el resto de la lámina, primero en las hojas basales y luego progresa hacia las apicales. La deshidratación de las hojas de GGd1d1d2d2 ocurre tanto en plántulas como en plantas al estado reproductivo sometidas a sequía. Un fenómeno similar se observa en plantas con adecuado suministro hídrico al final del ciclo vital. En el genotipo silvestre, en cambio, las hojas abscinden al final del ciclo con un alto grado de hidratura. Se efectuaron varios experimentos con el objetivo de caracterizar cuantitativamente la respuesta a la sequía del genotipo silvestre (cv. Clark) y del mutante stay green GGd1d1d2d2, a través de la medición de indicadores del estado hídrico de las hojas. El contenido relativo de agua (CRA) y el potencial agua de las hojas del mutante sometidas a un período de estrés hídrico declinaron mas rápidamente que en el genotipo silvestre. Sin embargo, la conductancia estomática disminuyó en forma semejante en las plantas de GGd1d1d2d2 y del genotipo silvestre. Tampoco hubo diferencias en el potencial soluto en el estado de hidratación máxima de hojas de plántulas de Clark y GGd1d1d2d2 sometidas previamente a sequía. Estas observaciones indican que la mayor sensibilidad a la sequía en GGd1d1d2d2 no se debe a diferencias en la capacidad para el ajuste osmótico o cierre estomático. La deshidratación de las hojas del mutante podría explicarse por una obstrucción permanente del xilema que impidiera el flujo de agua durante la sequía y luego de reasumidas las condiciones de adecuado suministro hídrico. Para probar esta hipótesis, se realizaron experimentos donde se midieron el CRA, el contenido porcentual de agua y el potencial agua de plántulas de Clark y GGd1d1d2d2 sometidas a sequía y luego rehidratadas. En estos experimentos se encontró que los indicadores del estado hídrico se recuperan en pocas horas a niveles semejantes en las hojas de Clark y en las de GGd1d1d2d2 que se han deshidratado parcialmente. De estos experimentos se puede deducir que la deshidratación de las hojas de GGd1d1d2d2 no se debe a que una obstrucción permanente del xilema impida el flujo de agua. La aplicación exógena de ácido abscísico causó una marcada reducción de la conductancia estomática tanto en el genotipo silvestre como en GGd1d1d2d2. Sin embargo, la aplicación exógena de ácido abscísico no evita la deshidratación de las hojas de GGd1d1d2d2, ni revierte el fenotipo stay green del mutante. De estos experimentos se puede concluir que la mayor sensibilidad de GGd1d1d2d2 a la sequía probablemente no está relacionada con alteraciones en la percepción, sensibilidad o biosíntesis del ácido abscísico. Dado que no se encontraron diferencias en la respuesta de la conductancia estomática de Clark y GGd1d1d2d2 frente al estrés hídrico, se examinó la pérdida de agua del mutante a través de la cutícula, midiendo la pérdida de agua de hojas mantenidas en la oscuridad y a elevada concentración de CO2, situación en la cual los estomas están cerrados. Debido a que las hojas de soja son anfiestomáticas y es imposible descartar totalmente la pérdida de agua a través de los estomas, la pérdida de agua en oscuridad y a alta concentración de CO2 se menciona aquí como transpiración superficial mínima en lugar de transpiración cuticular, reservando este último término para las superficies foliares desprovistas de estomas. La transpiración superficial mínima (Tsm) disminuyó durante la sequía en las plantas del genotipo silvestre. En GGd1d1d2d2 la disminución de la Tsm durante el tratamiento de estrés fue mucho menor. Es posible que la mayor Tsm en GGd1d1d2d2 sea debida a alteraciones en la deposición de ceras epicuticulares. Pero observaciones con el microscopio electrónico de barrido no mostraron diferencias en la morfología de las ceras epicuticulares entre el mutante y el genotipo silvestre. Para comprobar cuál (o cuales) de las mutaciones que causan el fenotipo stay green determinan la mayor sensibilidad a la sequía del mutante, se realizaron experimentos utilizando líneas casi isogénicas con diferentes combinaciones de los genes G, d1 y d2. Las plantas de todas las isolíneas fueron sometidas a sequía y se midió su contenido relativo de agua. Se encontró que las isolíneas que portaban los genes d1 y d2 al estado homocigota recesivo, al ser sometidas a estrés hídrico, experimentan la deshidratación irreversible de sus hojas. De estos experimentos se puede concluir que los genes causantes de la mayor sensibilidad a la sequía del mutante son d1 y d2 combinados. Además de los efectos sobre la tolerancia al estrés, las mutaciones que causan el fenotipo stay green también tienen efectos pleiotrópicos sobre el rendimiento en semillas en condiciones naturales. En estas condiciones el rendimiento fue menor en GGd1d1d2d2 que en el genotipo silvestre. Experimentos previos mostraron que el rendimiento de plantas cultivadas en cámaras de crecimiento era mayor en GGd1d1d2d2, debido probablemente a que el mutante prolonga su actividad fotosintética porque mantiene la integridad del cloroplasto. La actividad fotosintética no resulta prolongada en GGd1d1d2d2 en condiciones naturales, probablemente debido a que el mutante experimenta estrés hídrico en condiciones naturales aún con adecuada disponibilidad hídrica. Esto no sucede en cámaras de crecimiento donde las condiciones de humedad, temperatura e irradiancia son menos extremas que a la intemperie durante la estación normal de crecimiento de la soja. El resultado mas importante hallado en esta tesis es que la combinación de genes que causan el fenotipo stay green en soja provocan también una mayor sensibilidad a la sequía. Esta vinculación entre la senescencia y la tolerancia a la sequía no ha sido encontrada en otros mutantes stay green. Los datos obtenidos sugieren que los genes d1 y d2 se encuentran en un punto de una cadena de transducción de señales donde convergen la senescencia foliar y algunas respuestas al estrés hídrico. En esta tesis se realizó una extensa caracterización fisiológica del comportamiento del mutante GGd1d1d2d2 ante la sequía. Queda pendiente determinar cuáles genes de resistencia a la sequía son controlados por G, d1 y d2 como un primer paso del camino que conduzca a dilucidar la interrelación genética entre la senescencia foliar y las respuestas de las plantas al estrés hídrico.

Sinorhizobium meliloti es una α-proteobacteria capaz de establecer asociaciones simbióticas con plantas de los géneros Medicago, Melilotus y Trigonella. Esta asociación es el resultado de un complejo diálogo molecular entre los simbiontes, que se diferencian a lo largo de la interacción para dar lugar a un nuevo órgano en las raíces de las plantas, el nódulo fijador de nitrógeno. El nicho simbiótico accesible a los rizobios está naturalmente limitado, y resulta ocupado por aquellas cepas que muestran ser más competitivas para acceder al mismo. Las evidencias actuales indican que la competitividad para la nodulación es un fenómeno complejo, en el que son particularmente relevantes los procesos que tienen lugar en la vida rizosférica temprana. Lamentablemente, y a pesar del detallado conocimiento actual del proceso de infección y desarrollo de nódulos por los rizobios, muy poco se conoce sobre las etapas críticas de la colonización rizosférica. La caracterización molecular de las etapas tempranas de la simbiosis, donde el número de rizobios intervinientes es muy escaso, hace difícil el uso de aproximaciones transcriptómicas y proteómicas clásicas. En este marco nace el objetivo general de esta tesis, que utiliza dos alternativas experimentales aplicadas a la búsqueda y selección de determinantes genéticos de los rizobios asociados a la colonización temprana de la rizósfera y del rizoplano de alfalfa por Sinorhizobium meliloti. Por un lado hemos abordado la búsqueda de información sobre el conjunto de transcriptos específicamente inducidos en las etapas tempranas de la simbiosis, y para esto nos hemos enfocado en el mejoramiento de las herramientas disponibles para hacer estudios RIVET (Recombination based In Vivo Expression Technology). Dicha técnica utiliza una biblioteca de fusiones transcripcionales de todos los genes del microorganismo con el gen una recombinasa específica (tnpR sin promotor), cuya expresión será indicio de la actividad promotora del gen al que estaba fusionado la recombinasa y da como resultado la escisión (pérdida) de un cassette de ADN indicador presente en la misma bacteria en un lugar neutro de su genoma. Atento a la dificultad que significa la construcción de bibliotecas genómicas en vectores plasmídicos, en esta tesis hemos construido y validado una variante de módulo sensor que utiliza un transposón como herramienta para generar las fusiones trascripcionales, útil para estudios RIVET en diferentes gram-negativos y que representa una alternativa valiosa en reemplazo de la construcción de bibliotecas plasmídicas. En la segunda parte del trabajo de tesis hemos abordado la búsqueda y selección fenotípica de determinantes genéticos involucrados en las primeras etapas de la interacción simbiótica utilizando técnicas de mutagénesis etiquetada por firmas STM (Signature Tagged Mutagenesis). Esta metodología utiliza un conjunto de mutantes portadores de transposones mini-Tn5 etiquetados con una secuencia de nucleótidos que le es propia (firma) y que permite por tanto conocer la cantidad relativa de cada mutante en presencia de los otros. El desafío de un conjunto de mutantes a una condición de interés y la posterior evaluación de la proporción de cada firma al inicio y al final del experimento permite conocer que mutaciones redundan en efectos negativos y positivos sobre la condición estudiada. Hemos utilizado por primera vez la técnica de mutantes etiquetados asistida por plataformas de secuenciamiento de alta penetración para la evaluación del comportamiento de más de 6000 mutantes de S. meliloti en su capacidad de colonizar raíces de alfalfa y una leguminosa heteróloga (arveja). Los resultados alcanzados nos permitieron identificar más de un centenar de genes afectados en la colonización de raíces de alfalfa, algunos de los cuales resultaron específicos de la planta huésped. La identificación de las funciones asociadas a varios de esos genes nos ha permitido conocer actividades vinculadas a este proceso y proponer un modelo que explique las actividades requeridas para la colonización temprana del huésped.

En el marco de las asociaciones benéficas fijadoras de nitrógeno entre bacterias y plantas, se destaca el par simbiótico rizobio-leguminosa integrado por Sinorhizobium meliloti y Medicago sativa (alfalfa), como modelo de referencia para el estudio de estas interacciones. Conocer con precisión los fenómenos moleculares a través de los cuáles se desarrolla la simbiosis entre rizobios y leguminosas, y cómo éstos se encuentran regulados, permite sentar las bases racionales para abordar la manipulación y el mejoramiento de las simbiosis con propósitos prácticos en el marco agroeconómico. Durante los últimos 20 años, el extenso estudio de los fenómenos riboregulatorios en organismos procariotas ha permitido esclarecer la importancia que posee esta forma de regulación de la expresión génica en bacterias. Recientemente, producto del desarrollo de nuevas tecnologías de alto impacto para la caracterización transcriptómica de organismos procariotas, se han identificado cientos de ARNs pequeños no codificantes (sRNAs) que se expresan desde el genoma de S. meliloti en consecuencia a diversos estímulos fisiológicos. Extrapolando las nociones adquiridas a partir de la intensa caracterización de los fenómenos mediados por sRNAs llevada a cabo principalmente en modelos de enterobacterias, hipotetizamos sobre la existencia de una extensa red riboregulatoria en S. meliloti que jugaría un rol distintivo en el ajuste fino de la regulación de la expresión génica en esta bacteria. Un mayor conocimiento acerca de cómo esta red riboregulatoria modula la expresión génica en rizobios se espera ayude a comprender mejor los mecanismos a través de los cuáles estos microorganismos logran adaptarse a las condiciones de estrés ambiental a las que se ven desafiados continuamente. En el presente trabajo de Tesis Doctoral se abordó la caracterización funcional del ARN pequeño no codificante Sm8 en S. meliloti. En primer lugar, se analizó la distribución filogenética e inferencias evolutivas del gen sm8 a través de la búsqueda y el análisis de sus genes homólogos, con el propósito de comprender el origen y la evolución del gen y de su entorno y contar con un marco de referencia valioso para la interpretación biológica. sm8 ha evolucionado a partir de un ancestro remoto común en la rama de las alfa-proteobacterias y se trata del gen codificante para sRNA de S. meliloti más extensamente distribuido y conservado -a nivel secuencial y estructural- en esta clase filogenética. A continuación, se llevó a cabo la caracterización del rol del sRNA Sm8 en S. meliloti durante la vida libre de los rizobios. A través del estudio comparativo del comportamiento de un conjunto de cepas isogénicas de S. meliloti 2011 en las que se alteró la concentración intracelular de Sm8 se logró establecer un vínculo entre la actividad intracelular del sRNA y el flujo metabólico de C hacia la acumulación de reservas bajo la forma de polihidroxibutirato (PHB); la expresión del sRNA en la cepa parental limita la acumulación del compuesto de reserva. Con el propósito de dilucidar las bases moleculares de acción del sRNA en la célula, se realizaron ensayos de transcriptómica y proteómica cuantitativa, orientados a revelar el regulón asociado al sRNA. En este sentido, se identificó un conjunto de genes cuya representatividad en el transcriptoma/proteoma varía -directa o indirectamente- en función de la concentración intracelular de Sm8. El análisis integral de los resultados ha permitido establecer un modelo de regulación metabólica mediado por el sRNA Sm8 en S. meliloti.

El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la población de juveniles de tortuga verde (Chelonia mydas) que habita las aguas templadas del Atlántico Sudoccidental. La tortuga verde es una de las siete especies de tortugas marinas del mundo. Se encuentra en peligro de extinción debido a siglos de explotación de hembras adultas y huevos en las zonas de reproducción. Los esfuerzos de conservación llevados a cabo hasta la actualidad resultaron en el aumento de algunas colonias, aunque otras continuaron disminuyendo debido a las diferentes condiciones ambientales y amenazas que los juveniles experimentan en sus zonas de alimentación y a lo largo de sus rutas migratorias. La determinación del estado de conservación requiere de la investigación y manejo de la especie a lo largo de todo el ciclo de vida y la distribución de la especie. Una de las poblaciones que se encuentra en crecimiento es la colonia de Isla Ascensión. Los juveniles de esta población son afectados por la captura incidental y la degradación de sus hábitats que ocurre en la costa de Sudamérica. Por ello se estudió el comportamiento de los animales en relación al uso de hábitat, la ecología trófica y se analizó el marco legal en que ocurre la captura incidental. Los resultados de estos estudios demostraron que los juveniles de tortuga verde exhiben un comportamiento diferente al que se conoce para el resto de su distribución y que esto podría tener consecuencias para su conservación. Los animales utilizan áreas neríticas y oceánicas para alimentarse, e incluso en algunas áreas neríticas no exhiben una dieta estrictamente herbívora y una alimentación bentónica, sino que consumen plancton gelatinoso. El cambio ontogenético no sería necesariamente abrupto e irreversible. Los animales adaptarían su comportamiento a las condiciones ambientales locales. Además, los juveniles están expuestos a numerosas pesquerías costeras y pelágicas, y se alimentarían en una serie de ambientes degradados. Al menos en Argentina, existe un abundante marco legal e institucional que podría utilizarse para implementar medidas que apunten a reducir su captura incidental. Si bien la magnitud de la mortalidad de los juveniles en la región se desconoce, las amenazas ocurren en un área de grandes dimensiones y de difícil manejo que abarca las jurisdicciones y regímenes legales de tres países e implica el trabajo con pesquerías artesanales para las cuales hay un vacío de información. Esta tesis propone sumar el seguimiento y protección de los juveniles para asegurar que la colonia de Isla Ascensión alcance los niveles poblacionales previos a la explotación o al menos la capacidad de carga del ambiente. Esta tesis aporta información novedosa y de relevancia que puede ser utilizada para el manejo y protección de los juveniles en sus zonas de alimentación a lo largo de la costa de Sudamérica.

Fil:Hoc, Patricia Susana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (Magíster en Ciencias Agropecuarias) -- UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2017

El objetivo general de la tesis es contribuir al conocimiento de la vegetación sammófila del centro-oeste de la Argentina mediante el análisis geosinfitosociológico (florístico y sinecológico) (paisaje vegetal) de la vegetación de los Médanos Grandes–San Juan, uno de los sistemas eólicos más importantes de Argentina. El análisis realizado permite definir en el sistema dos subambientes, el dominado por procesos eólicos, con megadunas, y el dominado por procesos fluvio-eólicos, sin megadunas. El sistema, en general estabilizado y fijo, tiene actividad sólo en las crestas con escasa cobertura vegetal. La vegetación juega un papel determinante en la dinámica de la arena y en el modelado de este sistema, estando estrechamente relacionada con la disponibilidad de agua que se ajusta a tres modelos: -el de escurrimiento superficial y subsuperficial desde la bajada pedemontana de la sierra de Pie de Palo al norte, -el de la freática relacionada con los ríos San Juan, al oeste, y Bermejo, al este, y – el del agua de lluvia que en las megadunas determina un bulbo húmedo con contenidos de 1,21-2,4 g de agua/100 g de arena, entre los 15-35 m de profundidad, aprovechada por las raíces de los arbustos. Cuatro comunidades vegetales dominan en el sistema:-el pastizal de Panicum urvilleanum en las crestas, el -matorral de Tricomaria usillo-Bulnesia retama en las laderas de las dunas e intermédanos a más de 690 m, el -matorral de Atriplex lampa en los sectores marginales con suelos salinos y el -bosque de Prosopis flexuosa en los intermédanos bajos. Sintaxonómicamente la vegetación pertenece a tres Clases, la Panico urvilleani-Sporoboletea rigentis Esk., 1992 en ambientes sammófilos, la Suaedetea divaricatae Alonso et Conticello ex Martinez Carretero, 2001 en ambientes halófilos y la Larreetea divaricato-cuneifoliae Roig, 89 en la estepa arbustiva del Monte. La relación entre las comunidades vegetales y las asociaciones geomorfológicas permite establecer dos paisajes: el Paisaje I o de Sistema eólico que incluye el 55 % de la superficie y el Paisaje II o de Sistema fluvio-eólico. Palabras claves: eólico, megadunas, comunidades vegetales, dinamismo, bioclima, paisaje vegetal.

El reloj circadiano controla los ritmos comportamentales, fisiológicos y metabólicos en todos los organismos en los que se lo ha estudiado. Este oscilador, cuya periodicidad es cercana a las 24 hs, se mantiene sincronizado gracias a diversas claves ambientales. En Drosophila, como en otros organismos, se han identificado algunos de los componentes responsables de generar y mantener las oscilaciones moleculares. Asimismo se han caracterizado circuitos neuronales en los que componentes del reloj fluctúan con un período cercano a 24 hs. A lo largo de esta tesis se estudió el rol de la vía de bone morphogenetic protein (BMP) en Drosophila en el circuito neuronal que controla el comportamiento rítmico. Esta vía de señalización, además de estar involucrada en la organogénesis y el crecimiento, funciona como una señal sináptica retrógrada involucrada en la sinaptogénesis, la morfología sináptica y el control de la homeostasis en Drosophila y en otros organismos. La alteración de esta vía en el circuito PDF en estadios adultos conlleva un alargamiento del período endógeno de la actividad locomotora, que correlaciona con el ritmo de acumulación y localización subcelular de period, un componente central del reloj molecular. Los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo permiten proponer que la vía de BMP es capaz de modular la trascripción de genes centrales del reloj molecular y que schnurri podría constituir un regulador negativo determinante del nivel de expresión de los genes reloj en Drosophila.