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Entre las bacterias comúnmente reconocidas como causantes de ETA se encuentran las especies Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp., Bacillus cereus, Campylobacter, Listeria monocytogenes y Shigella, entre otras. La incidencia de estas enfermedades es un indicador directo de la calidad higiénico-sanitaria de los alimentos y se ha demostrado que la contaminación de estos puede ocurrir durante su procesamiento o por el empleo de materia prima contaminada, pues algunas bacterias patógenas para el hombre forman parte de la microbiota de aves, cerdos y bovinos. Además, estas bacterias, presentan capacidad de formación de biofilms lo que implica un potencial riesgo de contaminación de los alimentos a lo largo de la cadena de producción. Para disminuir el riesgo de infección por patógenos se necesita un control microbiológico estricto en toda la cadena de producción de alimentos. Para ello se han estudiado diversas estrategias como sistemas de biopreservación mediante bacterias ácido lácticas (BAL) o sus metabolitos, tecnologías no térmicas o combinaciones de estas. Las BAL resultan sumamente atractivas para ser utilizadas como herramientas para controlar el crecimiento de patógenos en una gran variedad de alimentos, debido a que son consideradas seguras y se utilizan hace cientos de años a nivel mundial en la producción de alimentos fermentados.El género Lactobacillus spp. y en menor medida Pediococcus spp. pertenecen al grupo de las BAL y generan día a día un creciente interés entre microbiólogos y tecnólogos dedicados a descubrir nuevas aplicaciones biotecnológicas y propiedades probióticas. Estas bacterias representan una alternativa para inactivar los patógenos de los alimentos mediante sus metabolitos activos con actividad inhibitoria y brindar así alimentos seguros a los consumidores. En este trabajo de Tesis se planteó como objetivo aislar y caracterizar BAL de las distintas etapas de la cadena productiva de cerdo y evaluar su capacidad antagónica ante patógenos implicados en ETA, tales como Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC), Salmonella entérica subsp. entérica serovar Typhimurium (S. Tiphymurium) y S. aureus. Asimismo, se planteó determinar el efecto inhibitorio en cortes de carne de cerdo mediante el empleo de BAL. Se tomaron muestras mediante hisopado de las distintas etapas de la cadena productiva porcina: criadero, frigorífico, boca de expendio. De 32 muestras se aislaron en total 63 bacterias, de las cuales un 38,09% presentaron características fenotípicas y genotípicas correspondientes al género Lactobacillus spp. y por secuenciación de Sanger fue posible determinar la especie, siendo Lactobacillus plantarum (L. plantarum) y Pediococcus acidilactiti (P. acidilactiti), las BAL identificadas. El 95,83% de las BAL presentaron capacidad inhibitoria frente a por lo menos una de las cepas patógenas evaluadas. La actividad antibacteriana de estos aislamientos se atribuye a la producción de metabolitos proteicos tales como bacteriocinas, específicamente las producidas por L. plantarum llamadas plantaricinas que fueron detectadas bioquímica y genéticamente en la etapa de crecimiento logarítmico o exponencial. Estos metabolitos con capacidad antibacteriana fueron concentrados por liofilización, permitiendo un mayor carácter inhibitorio ante las bacterias patógenas. Se determinó que los aislamientos de L. plantarum estudiados presentan un efecto sinérgico cuando son combinados entre sí y que presentan una acción natural de reducción de biofilms de los patógenos implicados en ETA. Finalmente, se determinó la potencial capacidad biopreservadora de L. plantarum al reducir la presencia de STEC, S. Tiphymurium y S. aureus en una matriz cárnica de origen porcino.Estos resultados indican que los microorganismos aislados representan una potencial alternativa para inactivar a los patógenos en las distintas etapas del procesamiento de la carne de cerdo para mejorar su calidad microbiológica, limitando el número de bacterias patógenas que puedan ingresar en la cadena de producción de alimentos. Esto permitirá brindar alimentos más seguros a los consumidores y un impacto benéfico en la salud pública.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Laboratorio Ecología Evolutiva y Biología Floral. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal-IMBIV-CONICET-Universidad Nacional de Córdoba. 2013. 140 h. + DVD; maps.; ils.; fots. col.; grafs.; tabls. Contiene Referencia Bibliográfica. Abstract en español e inglés.

Este trabajo tuvo como principal objetivo el aislamiento de bacteriófagos a partir de muestras de suelo y a partir de cepas lisogénicas pertenecientes al genero Rhizobium, y su posterior caracterización a través de una variada metodología. A lo largo de su desarrollo se debieron efectuar los estudios colaterales necesarios para adquirir un conocimiento mas acabado del sistema al cual estábamos enfrentados, como así también ensayos de interferencia entre cepas de Rhizobium, necesarios para el aislamiento de bacteriófagos temperados. También se realizaron experimentos de integración de bacteriófagos en el genoma de sus bacterias indicadoras con el objeto de establecer las posibilidades que ofrecía el sistema para la realización de futuros trabajos de ingeniería genética. Los estudios preliminares, ensayos de interferencia y aislamiento de bacteriófagos (capítulos III.1 y III.2) fueron efectuados conjuntamente con la Dra. Graciela L. De Antoni.

Objetivos de la tesis: - Aislamiento de fagos de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). - Caracterización de los fagos aislados. - Desarrollo de matrices de encapsulamiento de fagos y estudio in vitro de la capacidad protectora frente a la acidez para el suministro de bacteriófagos a bovinos por vía oral. - Determinación de las condiciones óptimas de conservación de los fagos.

Eugenia uniflora L., es una especie nativa, arbustiva que pertenece a la familia Myrtaceae; es ampliamente usada en la medicina tradicional, con reconocimiento de vastos compuestos químicos y propiedades biológicas. Los objetivos de la investigación fueron extraer y aislar principios activos a partir de las hojas y realizar una búsqueda de posible actividad antimicrobiana en los extractos no polares obtenidos. El material vegetal, secado y pulverizado, fue extraído con hexano mediante maceración, concentrado y obteniendo un Extracto Hexánico Concentrado (EHC) que fue fraccionado por cromatografía en columna. Se colectaron 150 fracciones reuniéndose veintidós que presentaron un comportamiento cromatográfico semejante, a las cuales se les realizaron un seguimiento bioguiado: Fr1-9, Fr1-14, Fr1-15, Fr1-16, Fr1-20 y Fr1-22. En la FrD3, procedente de Fr1-22, fue identificado el ácido ursólico a través de una CCD contra testigo. Del fraccionamiento de Fr1-20 por cromatografía preparativa en columna se obtuvo la Fr2-10, en donde fue caracterizado el acetato de bornilo. FrD3 y Fr2-10 fueron analizadas a través de HPLC – HRMS, por ionización a presión atmosférica (API) y el detector usado fue Masa de Impacto Electrónico (IE), encontrando en FrD3 el pico del ión molecular m/z 456 [M+] correspondiente con el ácido ursólico y en Fr2-10, m/z 196 [M+] compatible con el acetato de bornilo. Los estudios fueron complementados con tablas de las fracciones analizadas, especificando los distintos picos, a diferentes señales, con su m/z resaltando aquellas coincidentes con m/z del espectro de masas de cada uno de los compuestos, provenientes de una base de datos. Fr1-9 y Fr1-15 fueron analizadas en HPLC-MS en LC/ MSD VL Agilent Technologies 1100 Series Liquid Chromatography en un rango de m/z 50 a 1500, con detector Masa APCI. En Fr1-9 se identifica la Pulegona al comparar con su espectro homónimo aportado por la base de datos. En Fr1-15, el Germacrone, correspondiente a m/z 218 [M+] y los otros fragmentos característicos aportados por la base de datos permitió realizar posibles vías de fragmentación con la obtención de diferentes compuestos con una m/z coincidente a algunas señales de la fracción. Se determinó la actividad antimicrobiana en Fr1-9, Fr1-14, Fr1-15, Fr1-16, Fr1-20, Fr1-22, EDCMT y Fr2-10 a través del método de difusión: “cilindro placa” (USP 29) y el “Contact bioautography” como método bioautográfico. Se emplearon los microorganismos: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 y Staphylococcus aureus ATCC 29737 y el antibiótico estándar fue Ceftazidina. Los resultados mostraron inhibición de crecimiento frente a Staphylococcus aureus en todas las fracciones analizadas. La Bioautografía resultó ser un método útil para encontrar componentes naturales activos. De acuerdo al Rf del ácido ursólico, en los sistemas cromatográficos empleados, y la ubicación de los componentes químicos en la placa cromatográfica con actividad antimicrobiana, podría presumirse que uno de los compuestos presentes en el extracto hexánico con acción biológica sería el ácido ursólico.

En esta tesis se describe el aislamiento, bioguiado a través de ensayos de actividad antifúngica y/o antibacteriana, y la elucidación estructural de los metabolitos presentes en los cultivos de hongos provenientes de diversas fuentes naturales. Las especies analizadas Alternaria brassicicola, A. raphani, Aspergillus restrictus, Trichoderma koniigii y Ascosphaera apis fueron aisladas de polen de colmenas ubicadas en el apiario del INTA (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria) de la ciudad de Balcarce, Buenos Aires, Argentina. De Alternaria brassicicola y A. raphani se aislaron los compuestos 1-4, siendo el ácido tenuazónico, compuesto 2, el responsable de la actividad antibacteriana frente a la bacteria P. larvae, patógena de las larvas de las abejas melíferas. El compuesto 1, ácido D-allo-tenuazónico, es aislado por primera vez como producto natural. De Aspergillus restrictus se aisló el compuesto 3, conocido como pseurotina A3. Del hongo entomopatógeno de las larvas de las abejas melíferas, Ascosphaera apis, se aislaron los compuestos 6-8, siendo 6 y 8 monoterpenos de estructura química no informada previamente. Los compuestos 6 y 8 mostraron actividades antibióticas, antifúngicas y antioxidantes moderadas, mientras que el compuesto 7 posee buena actividad frente al hongo fitopatógeno F. virguliforme. Del cultivo de Trichoderma koningii se aislaron los compuestos 9, ácido hidroxiaspergílico, y 10, ácido terréstrico, ambos con actividad antifúngica importante frente a F. virguliforme. El estudio del cultivo de una cepa endófita septada oscura (DSE1) aislada de raíces de plantas de soja, brindó los compuestos 11-13. Dichos metabolitos son activos frente a los hongos F. virguliforme y F. lateritium. Se sintetizaron nuevos agentes antimicrobianos previamente aislados del cultivo del hongo intermareal Acremonium furcatum, compuestos 14 y 15. Los intermediarios sintéticos 21 y 22 resultaron poseer muy buena actividad antifúngica frente a F. virguliforme, Aspergillus fumigatus, Botrytis cynerea, Colletotrichum trucatum y Macrophomina phaseolina. Todos los extractos de las especies estudiadas fueron fraccionados mediante distintas técnicas cromatográficas hasta la obtención de los metabolitos de interés puros. La elucidación estructural se llevó a cabo utilizando principalmente experimentos de RMN-1D y 2D, junto con espectrometría de masa.

Desde su primera descripción en 1988, los enterococos resistentes a vancomicina (EVR) se han tornado un grave problema para la salud pública. La colonización precede y predispone generalmente a infecciones como endocarditis o bacteriemia especialmente en pacientes añosos, inmunocomprometidos o posquirúrgicos. Los EVR pueden colonizar el intestino de estos pacientes y pueden persistir durante largos períodos, lo cual resulta en costos muy elevados para los centros hospitalarios teniendo en cuenta los gastos de aislamiento y cohortización del paciente. Hasta el momento no ha podido establecerse un método que permita la descolonización de EVR en seres humanos. En este marco proponemos como objetivo general la utilización de bacteriófagos líticos como herramientas para ese fin. En la primera fase el objetivo específico fue el aislamiento y caracterización de bacteriófagos líticos apropiados para la descolonización. Para el aislamiento de los mismos se utilizaron muestras clínicas filtradas y ensayadas sobre cepas de enterococos tanto resistentes como sensibles a la vancomicina. Con este procedimiento se aislaron cinco bacteriófagos líticos sobre distintas cepas del género Enterococcus spp., los cuales fueron denominados siguiendo normativas taxonómicas internacionales como ΦBE1, ΦBE2, ΦBE3, ΦBE4, y ΦBE5 respectivamente. El fago ΦBE2 presentó un mayor espectro de infectividad, ya que resultó producir lisis sobre todas las cepas de EVR ensayadas. Se realizó la puesta a punto de un protocolo para la extracción y caracterización del material genético de cada uno de los bacteriófagos aislados y se construyó en particular una biblioteca genómica del bacteriófago ΦBE2. El fago ΦBE2 fue escogido además para realizar los experimentos de descolonización in vitro e in vivo. Se pusieron a punto las condiciones y medios apropiados para el almacenamiento a largo plazo de las suspensiones de fagos. La combinación de la utilización del buffer SM con una temperatura de -20°C resultó ser la condición apropiada para este fin. Se logró demostrar la capacidad lítica de los bacteriófagos ensayados tanto in vitro como in vivo. Se pusieron a punto las diferentes variables para trabajar con el modelo in vitro como con el modelo animal. Se trabajó con los diferentes bacteriófagos aislados y se concluyó que los mismos eran capaces de lisar diferentes aislamientos clínicos de enterococos tanto sensibles como resistentes a vancomicina. Además, se tomaron microfotografías electrónicas de los bacteriófagos aislados para estudiar su morfología y clasificarlos taxonómicamente. Para ello se tuvieron en cuenta caractericticas morfológicas de la cabeza y cola, las dimensiones de los fagos como asi tambien la homología de acidos nucleicos realizando la comparación con secuencias almacenadas en bases de datos. La segunda fase tuvo como objetivo específico la evaluación de los fagos en un modelo animal. Los ensayos realizados en el modelo de descolonización con células Caco-2, demostraron que la actividad del bacteriófago ΦBE2 se mantenía aun cuando las bacterias estaban adheridas a las microvellosidades. Se ensayaron diferentes variables para intentar determinar las vías y concentraciones óptimas de administración de los bacteriófagos en modelo murino. Se concluyó que la vía óptima de administración de las suspensiones de bacteriófagos de concentración conocida era la vía oral no forzada mediante la dilución de estas suspensiones en agua de bebida. Se determinó además la forma de recuento de las colonias bacterianas y de los bacteriófagos, como así también el agrupamiento y duración de cada experimento. En diferentes ensayos se observó que en los grupos de ratones tratados con las suspensiones fágicas individuales o un cóctel de tres fagos los recuentos de enterococos disminuyeron con valores estadísticamente significativos comparando con los grupos controles. Sin embargo no se logró la completa descolonización.

Fil:Gadaleta, Patricia Gladys. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.