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Las especies forrajeras subtropicales, adaptadas a las distintas condiciones de las regiones NEA, NOA y Semiárida Central, son estratégicas para el desarrollo de la ganadería regional y nacional. Los programas de mejoramiento genéticos de estas especies son recientes y la disponibilidad de marcadores moleculares como los SSR, podría contribuir a una caracterización más exacta de la variabilidad genética disponible. En este contexto, se realizó la amplificación cruzada de SSR en Digitaria eriantha, Setaria sphacelata y Trichloris crinita. Los SSR desarrollados por transferencia fueron evaluados en diferentes materiales de cada una de las especies. Los análisis de agrupamiento se realizaron con UPGMA, basados en los coeficientes de similitud Dice (Digitaria y Setaria) y Jaccard (Trichloris) y las relaciones genéticas fueron visualizadas mediante dendogramas. En Digitaria eriantha, la transferencia fue 7% del total de los SSR evaluados, siendo los SSR diseñados en Digitaria exilis (36%), Cenchrus ciliaris (27%) y Panicum maximum (18%) los que mayor transferencia presentaron. El nivel de polimorfismo fue de 95%. Los individuos se clasificaron en cuatro grupos. El AMOVA mostró que la variabilidad genética fue de 61% entre las poblaciones (grupos) y el 39% dentro de las mismas. En Setaria sphacelata se transfirió un 40% de SSR desarrollados en Setaria italica, con un polimorfismo del 85%. Los cultivares se diferenciaron genéticamente y el material experimental “selección INTA” se separó del cv. Narok, del cual deriva. En Trichloris crinita la tasa de transferencia fue de un 7,3% de SSR diseñados en 9 especies Poáceas pertenecientes a diferentes subfamilias. Estos evidenciaron un 69% de polimorfismo. La clasificación molecular de los individuos fue coincidente con el sitio de colecta. Según el AMOVA, el 21% de la varianza molecular es explicada por la variabilidad entre las poblaciones, mientras que el 79% fue dentro de las mismas. Los resultados han permitido la transferencia de SSR diseñados en especies Poáceas de mayor importancia agronómica a Digitaria eriantha, Setaria sphacelata y Trichloris crinita. De este modo, se han podido obtener SSR informativos, lo que representa una herramienta novedosa disponible para su utilización en bancos de germoplasma y/o programas de mejoramiento para cada especie.

El desarrollo de estrategias para incrementar la producción agrícola es de relevancia debido a la importancia de los vegetales en la alimentación humana. Entre estas estrategias se incluyen la expansión de la frontera agrícola a zonas menos aptas, como los ambientes fríos o áridos, pero es necesario que las plantas puedan resistir y prosperar en esas condiciones. El uso de cultivos transgénicos resistentes a la sequía constituye una buena alternativa que puede ser mejorada con el uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB), que puedan desarrollarse en condiciones de estrés, manteniendo sus actividades. El objetivo de este trabajo consistió en el análisis de cepas bacterianas aisladas de suelos, con diferentes regímenes hídricos, y de Pseudomonas extremaustralis, procedente de un ambiente extremo, en cuanto a su potencialidad para ser utilizadas como promotoras de crecimiento vegetal. Además se analizó la influencia de cultivos de maíz genéticamente modificados (GM) resistentes a la sequía sobre la composición de las comunidades bacterianas del suelo por técnicas secuenciación masiva. Las características de PGP en P. extremaustralis se analizaron en comparación con P. protegens Pf-5, una conocida PGPB. P. extremaustralis presentó una buena capacidad de solubilización y mineralización de fósforo, tanto a 28°C como en frio. El perfil de ácidos orgánicos, responsables de la solubilización de fosfato inorgánico, fue diferente al de P. protegens Pf-5. Estas diferencias se correlacionaron con la ausencia del gen gad responsable de la producción de 2-ceto-gluconato, en el genoma de P. extremaustralis. Esta bacteria también fue capaz de producir ácido indol acético (AIA) y posee genes relacionados a la resistencia a ácido fusárico y otros que la capacitan para resistir la desecación. Posee también la ruta metabólica completa para la síntesis y liberación de pioverdinas y se observó un efecto del regulador global anaeróbico Anr sobre la producción de estos compuestos. Ensayos de quimiotaxis mostraron que P. extremaustralis es atraída por exudados radiculares de plantas de trigo y es capaz de colonizar raíces de trigo y maíz de forma estable e incrementar el peso seco de vástago de plantas de trigo, mostrando que además de sus características como PGPB es capaz de interactuar con vegetales. También se analizaron características de PGP en aislamientos bacterianos obtenidos a partir de suelos de la provincia de Buenos Aires con distinto régimen de lluvias. Se obtuvieron 19 cepas bacterianas capaces de solubilizar fósforo, 3 de las cuales mostraron una alta capacidad de solubilización. Se encontraron 22 aislamientos positivos para la producción de AIA. Se observó un efecto positivo sobre el crecimiento de plantas de maíz en un sistema axénico autotrófico de 2 de las cepas, IIM-Man4 e IIA-Man30, indicando que pueden ser buenas candidatas como PGPB. Para analizar si existe un impacto de plantas GM resistentes a la sequía sobre la comunidad bacteriana del suelo se realizaron experimentos en macetas con suelo de dos localidades Río Cuarto(RC) e Inés Indart (II) en cámaras de cultivo con condiciones controladas, utilizando cultivares de maíz portadores del gen Hahb4 que confiere resistencia a sequía y salinidad. Las plantas fueron sometidas a dos tratamientos hídricos: alta y baja irrigación. Se analizó la diversidad bacteriana de las muestras de suelo mediante la secuenciación de amplicones del gen que codifica el 16S rRNA. Los suelos analizados fueron diferentes en cuanto a la α diversidad. En II no hubo diferencias en β diversidad, mientras que en RC se encontraron diferencias al utilizar los índices cuantitativos (Bray Curtis y Weighted UniFrac) al comparar el tipo de planta. La composición de los grupos mayoritarios fue similar, siendo las Proteobacterias el más representado en ambos suelos con alrededor del 30%, seguido por Acidobacterias con alrededor del 17% y Planctomycetes y Verrucomicrobia representando aproximadamente un 10% del total cada uno. En todas las muestras el género predominante fue Acidobacterium con 14 a 20 % de los registros (lecturas). La mayoría de los géneros presentó una abundancia relativa de 0,01-0,1 %. Se realizó un análisis para determinar que géneros bacterianos son afectados por cada condición de riego. Se detectaron 10 géneros en II y 16 géneros en RC que estuvieron significativamente (p<0,05) más representados en la condición de sequía con respecto a buena irrigación; siendo Chromatium, perteneciente a las Gamma Proteobacterias, el que mayor proporción de cambio mostró en II y Amycolatopsis, perteneciente al grupo de las Actinobacterias, y Nevskia, dentro de las Gamma Proteobacterias, en RC. También se observaron 29 géneros que mostraron diferencias significativas en relación al tipo de planta en II y 61 géneros en suelo de RC. Los tratamientos tuvieron menos efecto en II en comparación con RC. En II no se observaron diferencias significativas ni con el régimen de irrigación ni con el tipo de planta y hubo un menor número de géneros afectados. EN RC se observó un efecto significativo del tipo de planta pero no de la irrigación.

La trombocitemia esencial (TE) y la mielofibrosis con metaplasia mieloide son enfermedades mieloproliferativas crónicas que se caracterizan por aumento de megacariocitos en médula ósea. Los pacientes con TE presentan además, aumento del recuento plaquetario en sangre periférica. Se estudió un grupo de pacientes con TE sin tratamiento y durante la normalización del recuento plaquetario por el tratamiento con anagrelide. En ellos se evaluó el nivel proteico en el plasma y en las plaquetas y el nivel de ARN mensajero intraplaquetario de tres citoquinas relacionadas con el desarrollo de fibrosis medular, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento transformante β (TGFβ) y el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF). Se observó un incremento significativo en el nivel plasmático del PDGF que se normalizó con la reducción del recuento plaquetario por el tratamiento. Los pacientes que tenían fibrosis reticulínica leve en la biopsia de médula ósea mostraron mayores niveles de PDGF plasmático con respecto a los pacientes que no tenían fibrosis. Esta citoquina se encontró disminuida en las plaquetas y nuevamente los valores se normalizaron con el tratamiento. A diferencia de los niveles plasmáticos, los intraplaquetarios no se relacionaron con la presencia o ausencia de fibrosis en la médula ósea. El ARN mensajero se encontró disminuido antes y durante el tratamiento. La normalización del nivel plasmático de PDGF durante el tratamiento puede indicar que su incremento en el plasma se debe a liberación plaquetaria. La disminución del contenido intraplaquetario también podría atribuirse a una disminución de su síntesis en el megacariocito dado que se encontró disminuido el ARN mensajero. Los niveles plasmáticos del TGFβ se encontraron aumentados y los intraplaquetarios normales antes y durante el tratamiento y no se encontró relación con la presencia o ausencia de fibrosis reticulínica leve. El ARN mensajero intraplaquetario se encontró aumentado y se normalizó durante el tratamiento. Dado que el nivel plasmático de esta citoquina permaneció elevado aún con recuento plaquetario normal, se buscó la participación de otra fuente celular en este incremento. Se vió por inmunofluorescencia, la presencia de la citoquina en linfocitos y megacariocitos, la intensidad de marcación fue similar a la de los controles normales. Por lo tanto, los megacariocitos y no los linfocitos podrían ser una posible fuente celular causante del incremento plasmático, dado que su número se encuentra elevado en los pacientes con esta enfermedad. Los niveles plasmáticos e intraplaquetarios del bFGF se encontraron aumentados en los pacientes sin tratamiento y si bien disminuyeron significativamente con la normalización del recuento plaquetario, permanecieron aumentados con respecto al control. No se encontró relación con la presencia o ausencia de fibrosis reticulínica leve en la médula ósea. El ARN mensajero de la citoquina se encontró normal. Dado que el nivel plasmático se reduce cuando se normaliza el recuento plaquetario la liberación de esta citoquina podría ser atribuida en parte a las plaquetas. Pero por otro lado, se buscó la participación de otra fuente celular. Se vió por inmunofluorescencia, la presencia de la citoquina en linfocitos y megacariocitos con intensidad de marcación similar a la de los controles normales. Por lo tanto, también en este caso, los megacariocitos y no los linfocitos podrían ser una posible fuente celular causante del incremento plasmático. El aumento de estas citoquinas en el plasma de los pacientes con TE puede sugerir que éstas juegan un rol en la patogenia de la enfermedad. Los niveles del TGFβ intraplaquetarios normales con el aumento de su ARN mensajero y el aumento intraplaquetario del bFGF con el nivel de su ARN mensajero normal puede indicar una desregulación en su síntesis. Por otro lado se estudió el efecto del TGFβ sobre plaquetas normales. Se encontró la presencia de un número bajo de receptores en la membrana plaquetaria y se estudió el efecto de la citoquina sobre la agregación plaquetaria. El efecto del TGFβ sobre la función plaquetaria fue variable dependiendo tanto del tiempo de incubación como de la concentración de ADP utilizada como agonista. Se observó que el TGFβ potencia la agregación plaquetaria tanto en incubaciones de las plaquetas con la citoquina por períodos cortos como por períodos largos utilizando ADP en bajas concentraciones y tiene el mismo efecto cuando se incuban las plaquetas por periodos largos pero se utilizan concentraciones altas de ADP para inducir la agregación. En cambio, produce un efecto inhibitorio cuando las plaquetas se incuban con la citoquina por períodos cortos y se las estimula con concentraciones de ADP altas. En todos los casos el efecto fue leve y se corresponde con el bajo número de receptores encontrado por plaqueta. Las incubaciones de plaquetas con TGFβ in vitro durante tiempos largos podrían semejar situaciones patológicas en donde hay niveles altos de la citoquina durante tiempos prolongados. De esta manera, las plaquetas circulantes están continuamente expuestas a esta citoquina y ante un estímulo plaquetario las mismas responderían en forma incrementada Este sería el caso de la TE. La respuesta inhibitoria observada en tiempos cortos podría indicar un posible mecanismo de regulación negativa de la activación plaquetaria ante un estímulo intenso, en el sitio de injuria. Al estudiar el mecanismo por el cual la citoquina modula la función plaquetaria, se vió que cuando la activación plaquetaria está inhibida, la presencia de la citoquina no induce en forma directa la fosforilación de proteínas en residuos tirosinas. Al evaluar la fosforilación de proteínas durante la agregación plaquetaria inducida por ADP, en presencia de la citoquina, se vió una disminución en la intensidad de dos bandas correspondientes a 100 y 105 kd que estan relacionadas con la agregación. Este efecto se observó sólo al incubar las plaquetas durante 5 minutos en precencia de la citoquina y concuerda con el efecto inhibitorio causado por el TGFβ en la agregación plaquetaria.

Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la enfermedad de Chagas es una de las principales enfermedades desatendidas del subcontinente latinoamericano. El agente causante es el parásito protozoario Tripanosoma cruzi, transmitido a humanos por insectos triatominos de distintas especies. Debido a la ausencia de vacunas y tratamientos efectivos para la etapa crónica de la enfermedad, el control del vector sigue siendo el medio elegido para reducir el riesgo de transmisión. Después de casi 30 años de tratamiento con insecticidas piretroides, han emergido poblaciones de Triatoma infestans con altísimos niveles de resistencia, asociadas a fallas en las campañas de control, lo que plantea la necesidad de programas para el manejo de resistencia a nivel regional. Un requerimiento fundamental para ello es la detección temprana de la dispersión de poblaciones e individuos resistentes, así como del surgimiento de nuevos focos. Los piretroides ejercen su acción insecticida modificando el funcionamiento fisiológico de canales proteicos de Na+ dependientes de voltaje (NaV), presentes en la membrana de células excitables. Se conoce como kdr (knockdown resistance) a la reducción en la sensibilidad a piretroides causada por mutaciones puntuales en el gen NaV. El mecanismo de resistencia tipo kdr ha sido descrito en numerosas especies de insectos de interés económico y sanitario. La gran mayoría de las mutaciones correlacionadas con resistencia a piretroides se encuentra en el dominio II de esta proteína. El diseño de ensayos moleculares para detección de mutaciones asociadas a resistencia habilita la detección temprana de dispersión y surgimiento de nuevos focos, al permitir detectar la presencia de dichas mutaciones en insectos individuales, cuando la frecuencia poblacional de las mismas aún es baja. La detección temprana no puede conseguirse con ensayos de toxicidad, que detectan resistencia a nivel poblacional y no individual. En este sentido, en la primera parte de esta Tesis se realizó una evaluación de la sensibilidad y una optimización de los métodos moleculares de detección de mutaciones asociadas a resistencia, seguida de un estudio de la presencia de mutaciones para la región IIS4-IIS6 del gen del canal TiNav presentes en distintas poblaciones de T. infestans resistentes a piretroides provenientes de la ecoregión del Gran Chaco. Por otro lado, a través de una secuencia de TiNav detectada en una base de datos transcriptómica depositada en vector base (https://www.vectorbase.org/), complementada con el clonado y pirosecuenciación de regiones concretas del gen, se obtuvo la secuencia nucleotídica completa del mismo, y se realizó una caracterización bioinformática de la secuencia aminoacídica. Los resultados de esta parte del trabajo podrían tener aplicabilidad en el manejo de resistencia dentro de las campañas de control primario de Chagas. Durante el transcurso de la primera parte de la Tesis hemos encontrado que, aunque las mutaciones en el gen TiNav parecen ser la principal causa de resistencia a piretroides en T. infestans provenientes del Gran Chaco, no toda la resistencia es explicable por estos polimorfismos; distintas poblaciones con la misma frecuencia en una mutación kdr presentaron tasas de resistencia muy variables. Esto puede indicar que existen otros mecanismos de resistencia potencialmente involucrados en el fenómeno, tales como procesos de detoxificación y cambios en la penetrancia cuticular. En la segunda parte de esta Tesis, se realizó un estudio comparativo de la expresión diferentes enzimas detoxificativas entre una población sensible y una resistente de T. infestans provenientes del Gran Chaco. También se estudió la expresión génica en una población sensible expuesta a deltametrina, a fin de estudiar su posible papel en la respuesta detoxificativa a insecticidas piretroides, y posiblemente en la resistencia. Los experimentos mostraron una sobreexpresión de un citocromo P450 del clado 4 en la población resistente de T. infestans del Gran Chaco. No detectamos cambios en la expresión de las enzimas estudiadas cinco horas después de una topicación con deltametrina. Se estudió el rol de una Glutatión Transferasa del clado Delta (deltaGST) en la detoxificación de deltametrina. Se realizaron estudios bioinformáticos y de fisiología molecular usando como modelo Rhodnius prolixus. Se registró un aumento en la letalidad causada por dosis bajas de deltametrina cuando la expresión del gen de gst delta fue disminuida significativamente con técnicas de ARN de interferencia. La llamativa conservación en la estructura, función y farmacología del canal de sodio dependiente de voltaje a través del reino animal, genera que aquellos insecticidas que tengan como blanco esta molécula posean también una toxicidad potencial para otras especies. En este sentido, y teniendo en cuenta que las moléculas del sistema neuroendocrino (neuropéptidos y sus receptores) han sido propuestos como blanco de insecticidas, en el Capítulo 3 se estudió la expresión diferencial de genes precursores de diferentes neuropéptidos entre una población de T. infestans sensible a piretroides y otra resistente, a fin de obtener indicios de su posible papel en procesos asociados a resistencia. Por otra parte, se comparó el efecto de deltametrina en la inducción de la expresión de genes precursores de neuropéptidos en una población susceptible de T. infestans. En el Capítulo 4, a partir de secuencias ortólogas en Anopheles gambiae, Apis mellifera, Bombyx mori, Drosophila melanogaster y Tribolium castaneum, se identificaron genes de receptores de neuropéptidos en transcriptomas de T. infestans, Triatoma dimidiata y Triatoma pallidipennis generados en nuestro laboratorio, así como en el genoma de R. prolixus, por medio de búsquedas en bases de datos y análisis filogenéticos. Se espera que esta última parte del trabajo de Tesis aporte conocimientos para ampliar los horizontes en la investigación de posibles nuevos blancos de insecticidas, que sean capaces de reemplazar o complementar a los neurotóxicos dentro de estrategias de manejo integrado de plagas.

Los mecanismos de variación y evolución en los rotavirus comprenden no sólo las mutaciones puntuales introducidas por la RNA polimerasa durante la replicación y la reasociación de segmentos virales durante infecciones mixtas, sino también los reordenamientos que se producen dentro de cada segmento genómico. Estos reordenamientos no afectan la estructura conservada de los segmentos genómicos (extremos 5' y 3' conservados), y esta estructura se supone relacionada con la capacidad de replicación y empaquetamiento del genoma viral en nuevas partículas virales. Con el objetivo de estudiar los mecanismos de reordenamiento genómicos en rotavirus se analizó la estructura molecular del segmento genómico 11 reordenado de distintos rotavirus humanos de "electroferotipo corto", aislados de niños infectados. De acuerdo a los resultados obtenidos, el segmento 11 reordenado de los aislamientos virales analizados tiene una inserción de 148 nucleótidos en la región 3' no traducida del segmento viral. Las secuencias obtenidas de los segmentos 11 de los distintos aislamientos virales analizados fueron altamente homólogas entre sí y con las secuencias de los segmentos 11 de otras dos cepas de rotavirus humanos decriptas previamente: RVS y DS-1. La inserción no afecta la región codificante del gen 11, ni la secuencia y localización de la región 3' no codificante, común a todos los segmentos 11 de los rotavirus tipo A. La secuencia de la inserción, rica en A y T, no presenta homología con el segmento 11 normal ni con otros segmentos virales. Los resultados obtenidos permitieron identificar y estudiar un nuevo mecanismo de reordenamiento genómico en rotavirus, en el cual no hay una duplicación parcial del segmento genómico. Un segundo objetivo de la tesis consistió en el desarrollo de un sistema que permita obtener rotavirus recombinantes. Se estudiaron las secuencias requeridas para que un ARN sea reconocido por la maquinaria viral y sea replicado y empaquetado en nuevas partículas virales. Para estudiar las secuencias involucradas en el reconocimiento del ARN viral por la polimerasa viral hemos construído un plásmido recombinante que al ser transcripto produce un ARN que contiene las secuencias 5' y 3' no traducidas del segmento 11 viral, flaqueando la región codificante del gen CAT. Este ARN es amplificado cuando es transfectado en el citoplasma de células infectadas con rotavirus. De acuerdo a los resultados obtenidos, las señales involucradas en el reconocimiento del ARN por la polimerasa viral con actividad replicasa están localizadas en el extremo 3' no codificante. La polimerasa requiere para iniciar la síntesis de la cadena - del segmento 11, no sólo la secuencia consenso 3', común a todos los segmentos virales, sino también la formación de una estructura de horquilla dejando un extremo 3' libre de 18 nucleótidos que incluyen la secuencia consenso terminal. Aunque la metodología propuesta ha permitido desarrollar un método valioso para el análisis de las secuencias de RNA capaces de ser reconocidas por el complejo de replicación viral, la misma no resultó satisfactoria para la obtención de partículas virales recombinantes. Es posible que existan otras señales importantes para el empaquetamiento que probablemente se localicen en la región codificante del segmento 11, y por lo tanto que están ausentes en nuestra construcción.

La tuberculosis (TB) constituye la enfermedad infectocontagiosa que mayor número de muertes causa en el mundo. Su curso no depende sólo de la activación del Sistema Inmune sino también de su interacción con otros Sistemas como el Neuroendócrino. En trabajos previos demostramos la inhibición provocada por el Cortisol (GC), tanto en la blastogénesis como en la producción de IFN-γ y TNF-α, y el efecto inhibitorio de la ehidroepiandrosterona (DHEA) sobre la síntesis de TGF-β a partir de células mononucleares periféricas (CMP) de pacientes con TB, estimuladas específicamente. A fin de conocer si dicha inhibición se relacionaba con un aumento en la apoptosis de células inmunocompetentes, se cultivaron CMP de Pacientes con TB y Controles, estimuladas con Mtb sonicado (Tso), a las que se les adicionó GC y DHEA. Pudo observarse que la estimulación con Tso indujo mayor apoptosis en las células provenientes de pacientes con TB, sin modificaciones tras la adición de GC y/o DHEA. Por las características de la TB humana, donde es difícil definir el tiempo transcurrido entre el contacto con la micobacteria y la manifestación clínica y a fin de lograr una mayor conocimiento al respecto se estudiaron individuos con exposición conocida, esto es, los Convivientes íntimos de pacientes bacilíferos sin signos y síntomas de enfermedad. In vitro, éste grupo presentó los niveles más altos de linfoproliferación al estimular con Tso, mientras que los pacientes los más descendidos, comportamiento que también se observó al cuantificar la producción de IFN-γ. Más aún, el co-cultivo de las CMP estimuladas específicamente, con GC y DHEA, mostró una inhibición en la síntesis de este mediador en todos los grupos, aunque los Convivientes continuaron presentando las mayores concentraciones. Citocinas inhibitorias de la respuesta inmune antituberculosa, como TGF-β e IL-6 presentan reconocida influencia sobre la síntesis de esteroides, este hecho y la inhibición observada en la síntesis de DHEA por parte de células de la línea adrenal NCI-H295R, producida por los sobrenadantes (SN) de cultivos de CMP, estimuladas con Tso, nos sugirieron que algunos de ellos podrían estar implicados en la inhibición de la síntesis de DHEA adrenal. Como el TGF-β se encontraba significativamente incrementado en el plasma de los pacientes se investigó el potencial efecto modulador del mismo sobre la síntesis de DHEA y GC en cultivos de la línea NCI-H295R.El tratamiento con SN de CMP estimuladas durante 36hs. con Tso inhibió la producción de DHEA, y ello fue revertido por la adición de anti-TGF-β 25:1. Sin embargo, frente a este tratamiento, la producción de GC aumentó. Pudo demostrarse el TGF-β es al menos uno de los responsables de la inhibición en la producción de DHEA por las células adrenales. Estos resultados originales contribuyen con nueva videncia para lograr un mejor conocimiento en cuanto a la comunicación neuroinmunoendócrina en TB

Los gasterópodos del género Megalobulimus Miller, 1878 son endémicos de Sudamérica y forman parte de los pulmonados terrestres más grandes del mundo. La mayoría de sus especies y subespecies fueron descriptas originalmente sobre la base de caracteres conquiliológicos, siendo en la actualidad la única información disponible para la delimitación de un gran número de ellas. Sin embargo, muchas de las entidades de Megalobulimus presentan superposición de caracteres conquiliológicos que dificulta su identificación. En relación con otros abordajes, e.g. anatómicos y genéticos, si bien los antecedentes son escasos, los mismos han permitido complementar las diagnosis taxonómicas de algunas entidades. Para la Argentina, las únicas menciones de estos megamoluscos provienen de listados o catálogos de la malacofauna terrestre, de los cuales se desprende que Megalobulimus podría estar representado por cuatro especies (y cinco subespecies). Sin embargo, no hay claridad suficiente sobre cuales entidades y regiones geográficas son ocupadas por estos moluscos en nuestro país. Más aún, prácticamente todas ellas disponen de criterios conquiliológicos como único elemento para su identificación y diagnosis. La presente contribución tiene como objetivo general efectuar un análisis taxonómico enfocado en especies argentinas de Megalobulimus, principalmente de la provincia de Misiones, a los efectos de dilucidar su situación sistemática, que actualmente es confusa, produciendo información morfo-anatómica y genética que permita mejorar la descripción y diferenciación de las entidades, como así también, redefinir los caracteres diagnósticos de las mismas. A partir del material analizado, el abordaje conquiliológico cualitativo, principalmente basado en la protoconcha, y complementado con morfometría clásica y geométrica, permitió identificar a Megalobulimus oblongus lorentzianus, M. o. musculus y M. sanctipauli. Estas correspondieron a entidades cuya distribución para la Argentina era esperada. Complementariamente, a partir del material identificado se pudo confirmar y redefinir sus áreas de ocupación. No obstante, una parte del material analizado, mayormente procedente de Misiones, no condijo con las especies o subespecies mencionadas para el territorio nacional, el cual fue identificado como M. abbreviatus, informada hasta la fecha solo para el sur de Brasil. A partir del análisis de las partes blandas de estas cuatro entidades, que consistió en la caracterización del complejo paleal, sistema digestivo y reproductor, fue posible evidenciar diferencias para un conjunto de caracteres anatómicos que complementaron las diagnosis. Algunas de las estructuras principalmente informativas fueron los vasos accesorios del pericardio, vasos adrectales transversales del surco uretral, el riñón, el tabique pulmonar, el plexo epirrenal, el tiflosol intestinal, los pliegues del intestino prevalvular (p1 – p5), la válvula prerrectal, la bolsa de fertilización-complejo de la espermateca, el saco anexo del oviducto, el oviducto, la vagina, el conducto deferente, el pene y el número de flagelos en la inserción del conducto deferente y el epífalo. Asimismo, se amplificaron y secuenciaron tres marcadores mitocondriales para los individuos de estas entidades. Dos de ellos correspondieron a genes codificantes para proteínas mitocondriales, “Citocromo Oxidasa subunidad I” (COI) y “Citocromo b” (Cyt b), mientras que el tercero corresponde a una región no codificante para proteínas, el “gen ribosomal mitocondrial 16S” (16S ARNr). El análisis de la evidencia molecular, mediante la estimación de índices de diversidad genética, distancias intra e interespecificas y reconstrucciones filogenéticas permitió respaldar la interpretación dada a los resultados conquiliológicos y anatómicos. Finalmente, la información obtenida en este estudio se suma a los pocos abordajes taxonómicos integrativos existentes en la literatura para entidades del género. Sobre la base de la evidencia conquiliológica, anatómica, genética y de distribución obtenida para las cuatro entidades de Megalobulimus, fue posible redefinir sus caracteres diagnósticos, así como evaluar el estatus subespecífico de M. o. lorentzianus y M. o. musculus. Esto, no solo resulta de utilidad para futuros estudios de esta malacofauna en la Argentina, sino también constituye una línea de base para futuras comparaciones con aquellas entidades cuyos abordajes taxonómicos están aún pendientes.

La familia Chilinidae es exclusivamente sudamericana, con una distribución que abarca desde el Trópico de Capricornio hasta el Cabo de Hornos e Islas Malvinas. Actualmente cuenta con alrededor de 32 especies, de las cuales 16 están citadas para la Argentina. En esta familia la mayor riqueza específica se halla en la región más austral de Argentina y Chile. Sin embargo, la mayoría de las familias de Gastropoda de ambientes límnicos representadas en la República Argentina, presentan una mayor riqueza específica hacia el Norte, disminuyendo a medida que aumenta la latitud. La información existente acerca de esta familia es, en su mayoría, taxonómica. Las diagnosis específicas están casi exclusivamente basadas en caracteres de la conchilla, y en muy pocos casos se mencionaba la anatomía interna. Por esta razón, se abordó el estudio de las características anatómicas y de la conchilla de Chilina iguazuensis, C. fluminea, C. rushii, C. megastoma y C. gallardoi, presentes en la Cuenca del Plata. Además, se actualizó la distribución de estas especies y se analizó la taxocenosis más frecuente para cada especie. También se realizaron dos estudios ecológicos en ambientes y especies diferentes: Balneario La Balandra para C. fluminea y Parque Nacional Iguazú para C. megastoma. En estos estudios se analizó la densidad y estructura de tallas, sobre la base del análisis de su distribución a lo largo de dos años y se realizó un estudio del crecimiento teórico en cada especie. El análisis de componentes principales (ACP) realizado sobre las conchillas de las cinco especies demuestra una buena separación de las dos entidades que habitan en el río Iguazú (C. megastoma y C. iguazuensis) respecto de las otras entidades. Chilina megastoma, difiere de C. iguazuensis, a nivel de la conchilla, en que la abertura de C. megastoma no es de la misma longitud que el último anfracto, presenta dos dientes columelares, mayor desarrollo de la espira y no muestra un interior iridiscente. Como caracteres similares se pueden citar el gran desarrollo de la abertura y el reticulado de la conchilla. El ACP demuestra también que, la forma de la abertura permite diferenciar a las cinco especies. De acuerdo al test de Tukey las especies más relacionadas por los caracteres de la conchilla son C. rushii y C. fluminea. Sin embargo, estas dos especies se diferencian muy bien por la presencia de carena en la primera de ellas y su ausencia en la segunda. Entre las especies carenadas, C. rushii y C. gallardoi, la última solo la presenta a veces. La diferencia más notoria entre ambas es la relación existente entre la longitud de la abertura y la longitud del último anfracto. El ACP desarrollado sobre doce caracteres anatómicos (pie, complejo penial y sistema nervioso), mostró que el tamaño del pie (largo y ancho) es el carácter más robusto. Así, las especies que viven en ambientes de aguas más rápidas, C. Megastoma como C. iguazuensis, fueron las que presentaron un mayor desarrollo del pie. Este carácter favorece la adhesión al sustrato y la resistencia a ser arrastradas por la corriente. Para distinguir las especies también fueron relevantes algunos caracteres del complejo penial, mientras que de las medidas del sistema nervioso las que más información aportaron fueron las distancias de los conectivos nerviosos entre: Ganglio parietal derecho con el ganglio visceral, y ganglio parietal izquierdo con el ganglio subintestinal. En menor medida la longitud del conectivo pleura-parietal derecho. Sin embargo, el análisis factorial discriminante, con los mismos datos, demostró que no hay diferencias significativas entre C. rushii y C. fluminea.

Se estudió la morfología y la ultraestructura de las esporas de las Cyatheaceae del Cono Sur (Argentina, Chile, Paraguay, Uruguay y los tres estados del sur de Brasil). Para realizar este trabajo se utilizó material de herbario y fresco, coleccionado en viajes de campo. Se usaron diversas técnicas de fijación y tinciones diferenciales y las observaciones se realizaron con microscopio óptico y electrónico de barrido y de transmisión. Las Cyatheaceae que crecen en el área de estudio corresponden a tres géneros, que pueden ser diferenciados por la morfología de las escamas de la base del pecíolo. En base a observaciones propias en el campo, la consulta de herbarios y la revisión bibliográfica, se pudo determinar la presencia de 7 especies de Cyathea, 4 de Alsophila y 1 de Sphaeropteris. Se actualizó la distribución de los taxa y se excluyó del área en estudio a Alsophila cuspidata, previamente citada por otros autores. Como características generales las esporas son triletes, triangulares en vista polar, con los lados rectos a cóncavos y los ángulos redondeados. En vista ecuatorial son plano-hemisféricas, convexohemisféricas o cónico-subcónicas. En todos los casos el exosporio presenta dos capas, una interna delgada y una externa más gruesa, menos electrodensa, con margen entero o perforado y canales y cavidades. El perisporio tiene dos capas que varían, según el género, en grosor, ornamentación estratificación y estructura. Las esporas de Cyathea se caracterizan por presentar un perisporio delgado, castaño oscuro al microscopio óptico, formado por una red tridimensional de cordones con los extremos distales libres o unidos formando espínulas. En secciones delgadas de la esporodermis observadas con microscopio electrónico de transmisión se diferencian dos capas en el perisporio, la interna con dos estratos y la externa delgada y uniestratificada. El exosporio al microscopio óptico es grueso, amarillo y la superficie, según la especie, es psilada, perforada o verrucosa. El perisporio de Alsophila es castaño oscuro al microscopio óptico y la ornamentación compuesta por lomos de superficie lisa o crestada, esta última de diversas características. Sobre la superficie se observan glóbulos. A nivel ultraestructural presenta dos capas, la interna con tres estratos y la externa uniestratificada. El exosporio al microscopio óptico es amarillo a castaño claro y psilado. Sphaeropteris tiene un perisporio castaño oscuro al microscopio óptico, la ornamentación se caracteriza por la presencia de lomos de margen equinado. Se observan además glóbulos de distinto tamaño sobre la superficie. La estratificación de la pared es similar a la de Alsophila, aunque con diferencias ornamentales y ultraestructurales en la capa externa del perisporio. El exosporio es castaño claro al microscopio óptico y la superficie es psilada. Los resultados obtenidos en el presente trabajo reflejan la homogeneidad palinológica para cada género. Se aportan caracteristicas palinológicas superficiales y estructurales que permiten la diferenciación a nivel específico. Asimismo, se pone de manifiesto que la superficie y ultraestructura de las esporas de las Cyatheaceae del área podrían reflejar las tendencias evolutivas de la Familia y aportarían datos que avalan las hipótesis filogenéticas recientes. Los resultados obtenidos del análisis de la ultraestructura y subestructura de la pared de las esporas, como la presencia de superficies aplanadas y glóbulos superficiales, cordones con una subestructura compleja dispuestos de diferente manera en cada estrato del perisporio y canales en el perisporio y exosporio, ponen en evidencia la complejidad de la esporodermis. Tal complejidad estaría relacionada con la función que cumple la pared durante la diferenciación de las esporas en formación, la protección y dispersión de las esporas maduras y el mecanismo de abertura durante la germinación. Las descripciones morfológicas, basadas en diferentes metodologías utilizadas al trabajar en material, vivo o de herbario, brindan importante información a la botánica morfológica interpretativa y aportan datos a otras disciplinas afines, como ser el mejoramiento de las afinidades botánicas en paleobotánica.

En el presente trabajo se estudió la morfología y ultraestructura de las esporas de las Dennstaedtiaceae de la Provincia Fitogeográfica Paranaense (extremo sur de Brasil, desde los faldeos occidentales de la Serra do Mar hasta el centro de Río Grande do Sul, el extremo nordeste de la Argentina y el este de Paraguay). Para realizar este trabajo se utilizó material de herbario y fresco, coleccionado en viajes de campo. Se usaron diversas técnicas de fijación y tinciones diferenciales y las observaciones se realizaron con microscopio óptico (MO) y electrónico de barrido y de transmisión (MEB y MET). Dennstaedtiaceae es una familia de helechos ampliamente distribuida en el mundo, con representantes predominantemente pantropicales, ocasionalmente boreales y de regiones templadas. Desde el punto de vista morfológico, la familia incluye grupos muy diversos lo que ha dificultado la delimitación taxonómica de taxa subordinados a lo largo de la historia. Los caracteres reproductivos dentro de la familia son los que presentan la mayor variación. En base a observaciones propias en el campo, la consulta de herbarios y la revisión bibliográfica, se pudo determinar la presencia de 7 géneros y 17 especies de Dennstaedtiaceae: Blotiella lindeniana (Hook.) R. M. Tryon, Dennstaedtia cicutaria (Sw.) T. Moore, Dennstaedtia cornuta (Kaulf.) Mett. , Dennstaedtia dissecta (Sw.) T. Moore, Dennstaedtia globulifera (Poir.) Hieron., Dennstaedtia obtusifolia (Willd.) T. Moore, Histiopteris incisa (Thunb.) J. Sm., Microlepia speluncae (L.) T. Moore, Paesia glandulosa (Sw.) Kuhn, Pteridium arachnoideum subsp aracnoideum (Kaulf.) Maxon, Hypolepis mitis Kunze ex Kuhn, Hypolepis paulistana Shwartsb. & J. Prado, Hypolepis repens (L.) C. Presl, Hypolepis rugosula (Labill.) J. Sm., Hypolepis stolonifera Fée, Hypolepis rigescens (Kunze ex Mart.) T. Moore. No obstante, esta última podría estar extinta en el área. Se actualizó la distribución de los taxa y se describió una nueva variedad de Hypolepis stolonifera (Hypolepis stolonifera var. delasotae Arana, Yañez & Schwartsburd). Como características generales, las esporas son de dos clases. Las especies de Dennstaedtia, Microlepia y Pteridium presentan esporas triletes, de lados rectos, cóncavos o convexos y ángulos redondeados, triangulares o subcirculares en vista polar, convexohemisféricas a plano-hemisféricas en vista ecuatorial. Las especies de Blotiella, Histiopteris, Hypolepis y Paesia presentan esporas monoletes, bilaterales, elípticas a oblongas en vista polar y plano-convexas a plano-hemisféricas en vista ecuatorial. A partir de la diversidad de esculturas observadas y los elementos predominantes de la ornamentación, se identificaron 7 grupos morfológicos en la familia. Las esporas del grupo morfológico verrucoso, observadas en Dennstaedtia, se caracterizan por presentar verrugas con distintas dimensiones, formas y superficies, a veces fusionadas formando lomos o retículos, lo que permite a su vez diferenciar a las especies del género. Las verrugas están constituidas por el perisporio que se distingue como castaño claro a castaño oscuro con MO y posee una o dos capas distinguibles en secciones delgadas observadas con MET. Las esporas del grupo morfológico con cordones, presentes en Pteridium y Microlepia, están tapizadas por redes tridimensionales de cordones ramificados y fusionados entre sí que se disponen tangenciales o perpendiculares a la superficie y que se originan a partir del perisporio. El perisporio se observa castaño claro a marrón al MO y, a nivel ultraestructural, presenta tres capas. Las especies incluidas en este grupo pueden diferenciarse por la morfología, subestructura y organización de los cordones de la red. El grupo morfológico baculado, que incluye a Blotiella, presenta esporas tapizadas por báculas, con frecuencia rodeadas por engrosamientos de la pared que conforman mamelones. Las báculas están conformadas por el perisporio que es hialino y presenta dos capas. Las esporas del grupo morfológico rugulado, presentes en Paesia, están tapizadas por lomos angostos, sinuosos, que definen un arreglo laberíntico o se ordenan perpendiculares a la lesura. Los lomos están conformados por el perisporio que se posee una colocación grisoscura a la madurez y tiene dos capas a nivel ultrastructural. Todas las especies de Hypolepis, excepto H. rugosula subsp. pradoana, se incluyeron en el grupo morfológico equinado, debido a que presentan esporas ornamentadas por espinas que se fusionan lateralmente para formar crestas sinuosas y que, con frecuencia, están tapizadas por cordones que las conectan lateralmente. Las espinas están conformadas por un perisporio castaño claro al MO, en el cual se pueden identificar cuatro capas con MET. Particularmente en H. x paulistana, se hallaron caracteres palinológicos que sustentarían el origen híbrido de esta especie. Por otra parte, H. rugosula subsp. pradoana es la única especie del género que pertenece al grupo morfológico crestado debido a que presenta esporas tapizadas por crestas de margen irregular, ocasionalmente fenestradas en la base. En esta especie las crestas también están conformadas por el perisporio que es hialino al MO, y a nivel ultraestructural presenta tres capas. Finalmente, Histiopteris se incluyó en el grupo morfológico tuberculado. Presenta esporas tapizadas por tubérculos que se fusionan entre sí para formar retículos. A diferencia del resto de las especies estudiadas, en este grupo los tubérculos están originados por el exosporio, mientras que el perisporio acompaña la ornamentación. El perisporio es castaño al MO, y presenta dos capas distinguibles con MET. En relación al exosporio, todas las especies de Dennstaedtiaceae paranaenses poseen un exosporio constituido por dos capas de características ultraestructurales similares. Asimismo, el margen del exosporio resultó ser ornamentado en todas las especies con esporas monoletes. Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que la diversidad morfológica observada en los esporofitos de las especies de la familia Dennstaedtiaceae es comparable con la diversidad observada respecto a las características esculturales de las esporas. En este sentido, dentro de la familia la mayoría de los géneros estudiados pertenecen a un grupo morfológico que los caracteriza, excepto Hypolepis cuyas especies se incluyen en dos grupos distintos y Microlepia y Pteridium que comparten un mismo grupo morfológico. En relación historia evolutiva de la familia, los resultados ponen de manifiesto que algunos caracteres palinológicos como la clase de esporas y el margen del exosporio aportarían datos que avalan las hipótesis filogenéticas recientes. Asimismo, se hallaron similitudes entre algunas especies estudiadas y especies pertenecientes a familias filogenéticamente no emparentadas. Esto permite sugerir que los caracteres palinológicos no poseen por sí sólos un valor evolutivo que permita establecer relaciones entre grupos por encima del nivel de género. Adicionalmente, se realizó una evaluación preliminar sobre la posible relación entre la distribución geográfica de las especies y géneros y algunos caracteres palinológicos. En este sentido, no se observó un patrón de variación evidente en el tamaño de las esporas o la ornamentación que pueda relacionarse con la distribución geográfica de las especies paranaenses de Dennstaedtiaceae. Finalmente, las descripciones detalladas de la ornamentación tanto del exosporio como del perisporio de las especies estudiadas, así como las imágenes capturadas con microscopía óptica aportadas por esta tesis, representarían un aporte de información útil para ser utilizada en la comparación con material fósil.